CN105223326A - 一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法,包括以下步骤:测定目标中药口服速释制剂中目标活性成分的单次口服最大剂量的剂量数D0;确定出所述目标活性成分对应的溶出校正因子D;确定出所述目标活性成分对应的降解校正因子S;根据已确定的剂量数D0、溶出校正因子D及降解校正因子S,确定所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0,所述Mod-D0=D0×D×S;确定所述目标活性成分的渗透性参数CLogP;根据已确定的所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP,采用二维象限法对所述目标活性成分进行分类。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂领域,特别涉及一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法。
背景技术
口服药物的生物利用度分类系统(BioavailabilityClassificationSystem,简称BCS)是根据药物体外溶解性及肠渗透性的高低,对药物进行分类的一种科学框架或方法,可以用于预测药物在体内的吸收情况。该方法将药物分成4类,第Ⅰ类为高溶解性、高渗透性的药物;第Ⅱ类为低溶解性、高渗透性的药物;第Ⅲ类为高溶解性、低渗透性的药物;第Ⅳ类为低溶解性、低渗透性的药物;其中,药物溶解性的高低可以根据药物的剂量数D0来确定,当D0>1时,为低溶解性,当D0<1时,为高溶解性;药物渗透性的高低可以采用已确定的高渗透性药物,例如美托洛尔的Papp值18×10-6cm·s-1为基准来确定,即当药物的渗透性参数大于18×10-6cm·s-1时,为高渗透性,当药物的渗透性参数小于18×10-6cm·s-1时,为低渗透性。
对于化学药品而言,其分子结构清楚,构效关系明确,通过对其进行体外溶解性及渗透性等有关药物胃肠吸收参数的研究及评价,基本可以预测药物在口服吸收时的生物利用度。
但是,对于中医理论指导下的中药口服速释制剂,通常都包含多种活性成分,且临床实践早于制剂成型工艺研究,因此,在判断这些活性成分在不同剂型中的体内的吸收情况时,除了要考虑药物溶解性及渗透性的影响,还要考虑活性成分在该剂型中的溶出度及稳定性对渗透性的影响。
发明内容
为了能够更准确的对中药口服速释制剂中活性成分在体内的吸收情况进行分类,本发明实施例公开了一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法。技术方案如下:
1、一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法,包括以下步骤:
测定目标中药口服速释制剂中目标活性成分在第一介质中的溶解度Cs,并根据已确定的溶解度Cs确定目标活性成分的单次口服最大剂量的剂量数D0;
测定所述目标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度AD30min;并根据AD30min确定出所述目标活性成分对应的溶出校正因子D;
测定所述目标活性成分在第三介质中3小时的降解率DP3h;并根据DP3h确定出所述目标活性成分对应的降解校正因子S;
根据已确定的剂量数D0、溶出校正因子D及降解校正因子S,确定所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0,所述Mod-D0=D0×D×S;
确定所述目标活性成分的渗透性参数CLogP;
根据已确定的所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP,采用二维象限法对所述目标活性成分进行分类。
其中,所述剂量数D0的确定方法为:通过公式D0=(M0/V0)/Cs来计算剂量数D0,其中,M0为目标活性成分单次最大口服剂量;V0为250mL。
其中,所述溶出校正因子D的确定方法为:
当所述AD30min>85%时,D=1;
当所述AD30min≤85%时,D=85%/AD30min。
其中,所述降解校正因子S的确定方法为:
当所述DP3h<5%时,S=1;
当所述DP3h≥5%时,S=DP3h/5%。
其中,所述二维象限法为:以修正剂量数Mod-D0为横坐标,以渗透性参数ClogP为纵坐标,将坐标平面分成四个区域,分别为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅳ区,其中,Ⅰ区对应二维象限法的第一象限,Ⅱ区对应二维象限法的第二象限,Ⅲ区对应二维象限法的第三象限,Ⅳ区对应二维象限法的第四象限;
所述对所述目标活性成分通过二维象限法进行分类,具体为:
当所述目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅰ区时,所述目标活性成分为Ⅰ类药物,即高溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅱ区时,所述目标活性成分为Ⅱ类药物,即低溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅲ区时,所述目标活性成分为Ⅲ类药物,即高溶解性、低渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅳ区时,所述目标活性成分为Ⅳ类药物,即低溶解性、低渗透性药物。
其中,所述渗透性参数CLogP具体为:
目标活性成分的油水分配系数;
或
目标活性成分的表观渗透系数。
其中,采用桨法测定所述目标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度AD30min。
其中,采用加速实验法测定所述目标活性成分在第三介质中3小时的降解率DP3h。
在本发明的一种优选实施方式中,采用体外表皮单层细胞培养通透性实验确定目标活性成分的表观渗透系数。
在本发明的一种优选实施方式中,所述目标中药口服速释制剂为三叶片,所述三叶片的活性成分包括:芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷及丹酚酸B。
本发明提供了一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法,采用本发明提供的方法对中药口服速释制剂中活性成分进行分类,可以预测目标中药口服速释制剂中各活性成分的在体内的吸收情况,进而确定目标中药口服速释制剂的类别,且与绝对生物利用度实验得到的结果相关性好,说明本发明提供的方法适应性好,有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为5种活性成分的溶出曲线;
图2为5种活性成分在Caco-2细胞中的累计吸收曲线
图3为对5种活性成分以用二维象限法进行分析的结果示意图;其中,■表示荷叶碱,▲表示芦丁,◆表示芍药苷,﹡表示丹酚酸B,×表示金丝桃苷。
具体实施方式
本发明采用生物药剂学筛选的研究思路,综合考量生物药剂学中溶解度、溶出度、稳定性、透过性等影响口服药物吸收的主要特征对中药口服速释制剂的口服吸收及其发挥药效的影响,建立一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法,以预测各活性成分在体内的吸收情况,进而确定中药口服速释制剂的类别。对中药口服速释制剂的质量控制有指导性的作用。该方法可以包括:
测定目标中药口服速释制剂中目标活性成分在第一介质中的溶解度Cs,并根据已确定的溶解度Cs确定目标活性成分的单次口服最大剂量的剂量数D0;
测定所述目标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度AD30min;并根据AD30min确定出所述目标活性成分对应的溶出校正因子D;
测定所述目标活性成分在第三介质中3小时的降解率DP3h;并根据DP3h确定出所述目标活性成分对应的降解校正因子S;
根据已确定的剂量数D0、溶出校正因子D及降解校正因子S,确定所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0,所述Mod-D0=D0×D×S;
确定所述目标活性成分的渗透性参数CLogP;
根据已确定的所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP,在经典二维象限法基础上进行加权修饰,对所述目标活性成分进行分类。
需要说明的是,本文所述的术语“中药口服速释制剂”泛指服用后能快速崩解或快速溶解的固体制剂,如速崩片、速溶片等。
进一步需要说明的是:
(1)剂量数D0的确定方法可以参考口服药物的生物利用度分类系统中的剂量数D0的计算方法,具体为:通过公式D0=(M0/V0)/Cs来计算剂量数D0,其中,M0为目标活性成分单次最大口服剂量;V0一般为人胃的初始容量(250mL)。
(2)累积溶出度AD30min是标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度,可以通过根据2010版药典二部附录XC溶出度测定法中的第二法桨法进行测定,其中,累积溶出度AD的计算公式为:ADi=Xi+(X1+X2+......+Xi-1)V2/V1计算,其中Xi为i时刻的相对百分溶出度,V1为第二介质总体积,V2为每次取样后所补充的体积数。
(3)降解率DP3h为目标活性成分在第三介质中3小时的降解率,可以采用加速实验法或长期实验法来测定得到;其中,降解率DP的计算公式为:DP=Ct/C0计算,其中Ct为t时刻目标活性成分的剩余浓度,C0为目标活性成分初始浓度。
(4)渗透性参数ClogP是用来描述目标活性成分的渗透性特征的,在实际应用时,可以采用目标活性成分的油水分配系数或表观渗透系数来作为渗透性参数ClogP。
另外,对于一种目标中药口服速释制剂,可能会含有多种活性成分,对其中的一种活性成分进行分类时,该活性成分可以理解为目标活性成分。例如,三叶片中的活性成分包括:芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B。当对芍药苷进行分类时,芍药苷就是目标活性成分。
可以理解的是,油水分配系数可以通过实验来确定,具体的实验方法为本领域的公知常知,本发明在此不作具体限定。油水分配系数也可以通过相关的软件预测,例如可以通过PipelinePilot7.5软件来进行预测,当然,也可以采用其它的软件来进行预测,这些都是本领域的公知技术,本发明在此不作具体限定。表观渗透系数可以通过体外通透性实验(外翻肠囊法)、体外表皮单层细胞培养通透性实验(Caco-2细胞法)等实验方法确定,具体的确定方法可以由本领域技术人员根据实验情况进行选择,本发明在此不用具体限定。
(5)本发明中所采用的二维象限法参考口服药物的生物利用度分类系统中的二维象限法,并根据修正剂量数Mod-D0进行改进,具体可以为:以修正剂量数Mod-D0为横坐标,以渗透性参数ClogP为纵坐标,将坐标平面分成四个区域,分别为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅳ区,其中,Ⅰ区对应第一象限,Ⅱ区对应第二象限,Ⅲ区对应第三象限,Ⅳ区对应第四象限;当所述目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅰ区时,所述目标活性成分为Ⅰ类药物,即高溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅱ区时,所述目标活性成分为Ⅱ类药物,即低溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅲ区时,所述目标活性成分为Ⅲ类药物,即高溶解性、低渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅳ区时,所述目标活性成分为Ⅳ类药物,即低溶解性、低渗透性药物。
(6)第一介质、第二介质及第三介质采用本领域常用的模拟体内胃肠道环境的介质,具体种类本发明在此不作具体限定,可以由本领域技术人员根据药物的吸收特点选择合适的介质。具体的,可以选择0.1%HCl、pH4.5的PBS(磷酸缓冲盐溶液)、pH6.8的PBS等。例如,当药物的主要作用部位是小肠时,第一介质、第二介质及第三介可以采用模拟小肠环境的介质,例如pH6.8的PBS,需要说明的是,一般来说,当口服速释药物无明显靶向吸收部位时,第一介质、第二介质及第三介采用相同的介质即可。
中药六类新药三叶片(原名-三叶糖脂清片,获得临床批件后应国家食品药品监督管理局药品审评中心要求更名-三叶片)由桑叶,荷叶,山楂叶,赤芍和丹参5味中药组成。该方具有升清降浊,化瘀消痞之功效,适用于痰浊内蕴,痞满不畅所致的脾瘅及2型糖尿病前期合并高脂血症患者。现在医学表明,三叶片中的活性成分主要有芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B等。
下面以三叶片中的活性成分芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B为例,对本发明的技术方案进行详细的说明。
仪器与试剂
Hclass超高效液相色谱仪(美国Waters);CH-4123溶出仪(瑞士sotax);Milli-Q超纯水仪(美国MILLIPORE);H1650-W离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
三叶片(由天津中医药大学中医药研究院制得);芍药苷、芦丁、荷叶碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号分别为110736-101035,100080-200707,111566-200703),金丝桃苷对照品(中新药业,批号2013.5.14);乙腈(CHROMASOLV,色谱纯);甲酸(天津市大茂化学试剂厂,色谱纯);无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂,分析纯)。
1.三叶片5种活性成分含量的测定
1.1建立测定方法
1.1.1对照品溶液的制备
分别精密称取芍药苷4.14mg,荷叶碱5.66mg,芦丁4.05mg,金丝桃苷4.07mg、丹酚酸B4.26mg于10mL容量瓶中,甲醇定容得到对照品储备液。
分别精密吸取芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷对照品储备液适量,加30%乙醇制成每mL含芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B分别为103.5μg、28.30μg、5.062μg、20.25μg、105.6μg的混合对照品溶液。
1.1.2供试品溶液的制备
取三叶片10片,精密称定,计算平均片重为0.6344g,除去包衣,精密称定,计算平均片芯重为0.5823g。精密称取适量三叶片100目筛细粉(0.2g),置于100mL具塞锥形瓶中,精密加入30%乙醇(体积分数为30%的乙醇水溶液)20mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用30%乙醇补足减失的重量,摇匀,取适量离心取上清液得到供试品溶液。
1.1.3色谱条件
WatersBEHRPC18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B):0–7min,15%A;7–7.5min,15–19%A;7.5–12min,19%A;12–13min,19–35%A;13–16min,35%A。流速0.3mL·min-1;柱温35℃;进样量5μL;检测波长0~4min,225nm;4-8min,270nm;8-12min,360nm;12-16min,286nm。
1.1.4标准曲线的建立
将1.1.1项下的对照品混合溶液依次精密稀释2,5,10,15,20倍,12000r·min-1离心5min,注入超高效液相色谱仪,按1.1.3项下的色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程、r值及线性范围见表1,结果表明各成分在以下线性范围内线性良好。
表1线性关系考察
1.25种活性成分含量的测定
精密称定三叶片过100目研细粉末6份(约0.2g)于100mL锥形瓶中,加入30%乙醇20mL,超声提取30min,放冷,再称定重量,用30%乙醇补足减失的重量,摇匀,12000r·min-1下离心5min,取上清液5μL,按照1.1.3项下的的色谱条件分析,记录峰面积,计算三叶片中各活性成分含量,见表2。
表2三叶片活性成分含量
2.确定5种活性成分的单次口服最大剂量的剂量数D0
取过量的芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B分别置于10mL的棕色容量瓶中,分别加入5mLpH6.8的PBS,以40r·min-1磁力搅拌48h,以12000r·min-1离心5min,取上清液,经适当稀释后,用0.45μm微孔滤膜过滤,取20μL进样,采用超高效液相色谱(UPLC)进行分析(根据1.1.3项下的色谱条件),用外标法定量计算5种活性成分在pH6.8PBS中的溶解度Cs,如表3所示。
按表2中三叶片各活性成分的含量,根据平均片芯重(0.5823g)计算得到各活性成分每片含量,综合药物说明书标示的每次最大口服量(6片)计算三叶片5种活性成分口服最大剂量M0,如表3所示。
根据公式D0=(M0/V0)/Cs来计算剂量数D0,V0一般为胃的初始容量(250mL)。
结果见表3,除荷叶碱在pH6.8的PBS中的D0大于1外其他各成分在考察的介质中均能达到要求,说明各成分的溶解度不会影响其吸收程度。
表35种活性成分在pH6.8的PBS中的溶解度、口服剂量、及剂量数
3.确定5种活性成分对应的溶出校正因子D
根据2010版药典二部附录XC溶出度测定法,选用第二法桨法测定三叶片溶出度。取三叶片6片,以500mLpH6.8的PBS为溶出介质,转速为120r·min-1,温度(37±0.5)℃,依法测定,不同时间点取样1mL,经10000r·min-1离心5min,每次取样后补加同体积同温度的溶出介质,用UPLC(根据1.1.3项下的色谱条件)测定样品中芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷及丹酚酸B的含量,计算各时间点药效成分的平均累积溶出百分率和标准差,绘制溶出曲线,结果见图1。从图1中可以读出:芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷及丹酚酸B在第30分钟时的累积溶出度,AD30min,并根据公式下列计算得到溶出校正因子D,其中,5种活性成分的累积溶出度AD30min及溶出校正因子D分别如表4所示。
当AD30min>85%时,D=1;
当AD30min≤85%时,D=85%/AD30min。
表45种活性成分的累积溶出度AD30min及溶出校正因子D
4.确定5种活性成分对应的降解校正因子S
精密称取芍药苷4.35mg、荷叶碱4.28mg、芦丁5.06mg、金丝桃苷4.82mg、丹酚酸B4.23mg于10mL容量瓶中,甲醇定容,得到标准品储备液。
精密吸取标准品储备液500μL于10mL容量瓶中,用pH6.8的PBS定容至刻度,摇匀,得到标准品溶液。
将标准品溶液放置于37℃水浴中,于不同时间点取样,采用超高效液相色谱(UPLC)进行分析测定(根据1.1.3项下的色谱条件),用外标法定量,得到相对剩余含量对数值(LnCt/C0)与时间的关系(C0为标准品溶液放置于37℃水浴中的初始浓度,Ct为标准品溶液放置于37℃水浴中t时刻的剩余浓度);并从相对剩余含量对数值(LnCt/C0)与时间的关系可以确定5种活性成分3小时的降解率DP3h,如表5所示,并根据下述公式
DP3h<5%时,S=1;
DP3h≥5%时,S=DP3h/5%。
来确定降解校正因子S,如表5所示。
从表5中可以看出,3h内芍药苷、芦丁、金丝桃苷、降解均未超过5%,丹酚酸B降解略大,荷叶碱在测试过程中未降解。
表55种活性成分的降解率DP3h及降解校正因子S
5.确定5种活性成分的修正剂量数Mod-D0
根据已确定的剂量数D0、溶出校正因子D及降解校正因子S,就可以根据公式Mod-D0=D0×D×S来确定5种活性成分的修正剂量数Mod-D0;如表6所示。
表65种活性成分的修正剂量数Mod-D0
6.确定5种活性成分的渗透性参数ClogP;
采用体外表皮单层细胞培养通透性实验确定目标活性成分的表观渗透系数Papp,并以目标活性成分的表观渗透系数Papp作为渗透性参数CLogP;
6.1仪器(参见表7)
表7实验仪器
6.2细胞来源
人结肠癌上皮细胞(Caco-2)购于中科院上海细胞库,试验中采用20-40代细胞。
6.3实验动物
健康雄性大鼠(♂),品系SD(Spraque-Dawley),级别普通,体重250±10g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可编号SCXK(京:2009-0004)。
6.4基于Caco-2细胞模型的三叶片活性成分透过性研究
6.4.1Caco-2细胞模型培养
根据中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库推荐细胞培养条件,Caco-2细胞用含15%FBS、1%青链霉素的MEM培养基培养,细胞在37℃,5%CO2培养箱中培养,每三或四天传代一次。
细胞传代,传代时弃去原培基,3mLPBS漂洗3次,加入2mL0.25%胰蛋白酶(含EDTA),37℃消化大概2min,轻拍瓶壁使细胞脱落,加入3mLMEM全培养基终止消化。倒入50mL无菌离心管,1000r·min-1离心3min。弃去上清液,加入3mL全培养基重悬均匀后,取1mL细胞悬液加入75cm2培养瓶,补加9mL全培养基,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
用于吸收研究的Caco-2细胞的传代数为20~40代,使用空白培养液将其制成细胞密度约2×105/mL的混悬液,接种在Transwell12孔板上,每个孔由聚碳酯膜分隔成为上下两个室,上侧室为肠腔侧(apicallateral,AP侧)即供给侧,下侧室为基底侧(basallateral,BL侧)即接受侧。接种好的Transwell12孔板置37℃5%CO2孵箱静置培养,每天更换1次培养液,直至形成完全致密的单层细胞膜(21d左右)。
6.4.2Caco-2细胞模型的评价
通过测量单细胞层的跨膜电阻来评价Caco-2细胞是否分化成完整的单层膜,一般而言电阻值大于500Ω·cm2时即表明Caco-2细胞完全分化。本试验中采用电位仪监测Caco-2细胞在聚碳酯膜上生长21d时的电阻值,见表8,试验孔电阻值大于500Ω·cm2并趋于恒定,此时细胞已具有足够的紧密连接和完整性,可用于转运试验研究。用电镜观察,Caco-2单层细胞在培养条件下具有微绒毛、紧密连接。以阳性药普奈洛尔和阿替洛尔通透量以及电阻值作为指标进行了鉴别,结果表明普萘洛尔的渗透系数>10-5cm·s-1,阿替洛尔的渗透系数<10-7cm·s-1,可以作为药物转运过程的研究模型。
表8实验前后各试验孔电阻值R/Ω·cm2(n=3)
6.4.3样品配制
HBSS缓冲液的配制
称取NaCl8.0g,KCl0.4g,CaCl20.14g,MgSO4·7H2O0.2g,Na2HPO4·12H2O0.06g,NaHCO30.35g,葡萄糖1.0g,KH2PO40.06g,加适量超纯水溶解,并定容至1.0L,用HCl/NaOH调节pH至7.4,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,4℃保存,隔天使用。
活性成分样品储备液的配制
分别精密称取芍药苷对照品4.52mg、荷叶碱对照品4.81mg、芦丁对照品4.56mg、金丝桃苷对照品4.61mg、丹酚酸B对照品4.89mg,置10mL棕色容量瓶中,芍药苷和丹酚酸B水溶性良好直接用pH7.4HBSS缓冲液溶解定容至10mL,芦丁、金丝桃苷先用100μLDMSO溶解,再用pH7.4HBSS缓冲液定容至10mL,摇匀即得对照品贮备液,4℃冷藏保存。荷叶碱由于溶解性差,加入200μLDMSO也未能将其完全溶解,由于过多的DMSO会对细胞造成影响故未再增加DMSO的量,用pH7.4HBSS缓冲液定容至10mL为荷叶碱储备液。
活性成分样品溶液的配制
分别取芍药苷、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B贮备液适量,用pH7.4HBSS缓冲液稀释,得40μg·mL-1转运样品溶液;取荷叶碱储备液,12000r·min-1下离心10分钟,取上清为样品溶液,外标法测得浓度为11.32μg·mL-1,得到荷叶碱转运样品溶液。
6.4.4活性成分Caco-2细胞转运试验
吸去培养21d左右、符合转运条件的Transwell膜上的培养基,用37℃的HBSS缓冲液轻柔地清洗细胞单层3次,以洗净细胞单分子层表面的培养基等杂质,最后一次加入HBSS缓冲液后置于37℃培养箱中温孵培养30min以保证细胞适应转运环境。吸去缓冲溶液,在BL侧加入1.5mL空白HBSS缓冲液作为接收液,在AP侧加入含有受试药物的转运样品溶液0.5mL,作为供给液,加完后将Transwell细胞培养板置于37℃环境中,并作为零时间开始计时,分别在0,30,60,90,120min从接受侧精确吸取200μL样品溶液,同时补加200μLHBSS缓冲液,吸取的样品以UPLC进行测定。
6.4.5样品处理方法
跨膜样品经12000r·min-1离心10min后,取上清液5μL进样,按1.1.3项下色谱条件下进行测定,记录各考察成分峰面积,外标法计算浓度。
6.5透过参数的计算
6.5.1药物累积转运量的计算
转运试验中加入空白转运液的一侧为接受室(BL侧),接受室中的药量为吸收量(Qr)。具体计算公式见公式(1)。
Qr=0.2×(Cr1+Cr2+…+C(i-1))+1.5×C(ri)公式(1)
式中,1.5为BL侧室所加的缓冲液初始体积(mL),0.2为取样体积(mL),Cri为接受室第i个时间点的实测浓度(mg·L-1)。
6.5.2表观渗透系数(apparentpermeabilitycoefficients,Papp)的计算
基于接受室药物吸收量计算表观渗透系数Papp(cm·s-1),计算公式见公式(2): 公式(2)
为单位时间药物转运量(μg·s-1),即通透速率,是以时间为横坐标,累计吸收药量为纵坐标所得到直线的斜率;A为Caco-2细胞单层膜的表面积(1.12cm2);C0′为供给室中药物的初始浓度(μg·mL-1)。
6.6基于Caco-2细胞模型的三叶片活性成分透过性结果
根据公式(1)和(2)计算不同时间点各成分从AP侧-BL侧的累积转运量,结果如图2所示。可见,随着时间增加,药物累积转运量逐渐增加。计算得到的Papp值见表9。
表9基于Caco-2细胞试验各成分渗透系数(Papp)
可以理解的是,可以采用目标活性成分的油水分配系数作为5种活性成分的渗透性参数ClogP;例如,可以采用PipelinePilot7.5软件来预测目标活性成分的油水分配系数LogP,实际操作时,输入各活性成分的化学式,即可得到相应的油水分配系数LogP。
通过上面的实施例可以确定5种活性成分的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP,分别对5种目标活性成分通过二维象限法进行类,以修正剂量数Mod-D0为横坐标,以渗透性参数ClogP为纵坐标,将坐标平面分成四个区域,分别为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅳ区,其中,Ⅰ区对应二维象限法的第一象限,Ⅱ区对应二维象限法的第二象限,Ⅲ区对应二维象限法的第三象限,Ⅳ区对应二维象限法的第四象限;其中,渗透性参数以美托洛尔的Papp值18×10-6cm·s-1基准,(参考文献为:FongSYK,LiuM,WeiH,etal.EstablishingthepharmaceuticalqualityofChineseherbalmedicine:aprovisionalBCSclassification.[J].MolecularPharmaceutics,2013,10(5):1623-1643.)。当活性成分的Papp值大于等于18×10-6cm·s-1时为高渗透性物质,低于18×10-6cm·s-1时为低渗透性物质。Ⅰ区的区域为:Mod-D0≤1,ClogP≥18×10-6cm·s-1;Ⅱ区的区域为:Mod-D0≥1,ClogP≥18×10-6cm·s-1;Ⅲ区的区域为:Mod-D0≤1,ClogP≤18×10-6cm·s-1;Ⅳ区的区域为:Mod-D0≥1,ClogP≤18×10-6cm·s-1。
结果如图3所示,荷叶碱位于Ⅱ区,为Ⅱ类药物,即低溶解性、高渗透性药物;芦丁、芍药苷、丹酚酸B、金丝桃苷及均位于Ⅲ区,为Ⅲ类药物,即高溶解性、低渗透性药物;主要限速因素为制剂中的溶解度和稳定性。由于三叶片中主要的目标成分大多为Ⅲ类药物,因此,根据上述各目标成分的物药类别综合考量,三叶片为Ⅲ类药物,对于这类药物,渗透性是影响其作为口服药物进入体内发挥药效的关键因素。适当的促渗制剂手段以及结构改造工作是发挥此类药物的必经之路。因此,对于三叶片后续的质量改进过程中,提高药物的渗透性是其工作重点。
7.5种活性成分的绝对生物利用度的确定
具有生物活性的药物能否在生物体内发挥药效,很大程度上取决于血浆中药物浓度和生物利用度。评价药物吸收最直接、最准确的指标就是应用生物利用度进行评价。本研究采用UPLC分析方法测定大鼠灌胃给药和静脉给予三叶片活性成分后不同时间点的血药浓度,进而研究各活性成分在大鼠体内的口服绝对生物利用度。以此为标准可对要发明提供的体外分类方法的分类结果的体内外相关性予以判断。
7.1仪器(参见表10)
表10实验仪器
7.2实验动物
健康雄性大鼠(♂),品系SD(Spraque-Dawley),级别普通,体重250±10g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可编号SCXK(京:2009-0004)。
7.3三叶片5种活性成分绝对生物利用度研究
7.3.1样品配制
标准溶液的配制
精密称取芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B对照品适量,加甲醇配成480μg·mL-1、479μg·mL-1、412μg·mL-1、441μg·mL-1、475μg·mL-1的储备液,于4℃保存。临用前,取对照品储备液适量,先用50%甲醇稀释20倍,再用大鼠空白血浆按倍数稀释法稀释至所需浓度,即得各成分的标准工作液。
内标溶液的配制精密称取红景天苷适量,加甲醇配成399μg·mL-1的储备液,于4℃保存。临用前,加50%甲醇稀释成500ng·mL-1,即得内标工作液。
5种活性成分注射样品的配制
芍药苷和丹酚酸B水溶性良好,注射样品时直接用适量生理盐水溶解即可;荷叶碱水溶性差,但在酸中溶解良好,配制荷叶碱注射样品时,先用30μL冰醋酸溶解,后用适量生理盐水稀释到合适浓度;芦丁和金丝桃苷的注射样品用吐温:乙醇:生理盐水1:1:8溶液溶解并稀释至刻度。
5种活性成分灌胃样品的配制
称取适量芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B标准品于50mL烧杯中,用0.2%羧甲基纤维素钠水溶液搅拌混匀,呈均匀混悬药液,给药时用注射器吸取适量体积的上述混悬液灌胃。
7.3.2大鼠生物利用度试验
SD大鼠,实验前适应性喂养2d,给药前禁食12h,不禁水,给药后2h内禁水,全程禁食。由已有各活性成分药代动力学报道可知各成分吸收程度不同,则各成分给药剂量有所不同,静脉和口服给药剂量也有所不同,具体方案见表11。静脉给药后于0,5,10,20,30,60min和2,4,6,8,12h目眦取血0.5mL,口服灌胃给药后于15,30,45,60min和2,4,6,8,12,24h目眦取血0.5mL(给药后2h内,每0.5h灌胃补充与取血量等同的生理盐水,2h后允许自由饮水),4℃、8000r·min-1下离心10min,分离血浆,密封后置于-80℃冰箱保存,备用。
表11大鼠给药方式、给药剂量与分组情况
7.3.3血浆样品的处理
芍药苷样品制备取血浆样品或血浆稀释样品100μL,加入内标溶液10μL(10μg·mL-1),混合均匀,加入乙腈溶液500μL,漩涡混合4min沉淀蛋白,12000r·min-1离心10min,取450μL上清液室温下离心浓缩至干,50%甲醇-水100μL复溶,12000r·min-1离心10min,取上清液供UPLC分析。
荷叶碱样品制备取血浆样品或血浆稀释样品100μL,加入内标溶液10μL(10μg·mL-1),混合均匀,加入甲醇溶液500μL,漩涡混合4min沉淀蛋白,12000r·min-1离心10min,取450μL上清液室温下离心浓缩至干,50%甲醇-水100μL复溶,12000r·min-1离心10min,取上清液供UPLC分析。
芦丁、金丝桃苷样品制备取血浆样品或血浆稀释样品100μL,加入10μL冰乙酸,涡漩混合4min,加入内标溶液10μL(10μg·mL-1),混合均匀,加入甲醇溶液500μL,涡漩混合4min沉淀蛋白,12000r·min-1离心10min,取450μL上清液室温下离心浓缩至干,50%甲醇-水100μL复溶,12000r·min-1离心10min,取上清液供UPLC分析。
丹酚酸B样品制备取血浆样品或血浆稀释样品100μL,加入25μL20%HCl,涡漩混合4min,加入内标溶液10μL(10μg·mL-1),混合均匀,加入乙酸乙酯溶液500μL,涡漩混合4min沉淀蛋白,12000r·min-1离心10min,取450μL上清液室温下离心浓缩至干,50%甲醇-水100μL复溶,12000r·min-1离心10min,取上清液供UPLC分析。
7.3.4色谱条件
WatersBEHRPC18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),流速0.2mL·min-1;柱温35℃;进样量5μL。
洗脱条件:芍药苷,0–5min,8%A;5–5.5min,8–20%A;7.5–13min,20%A;检测波长0~6min,275nm;6-13min,225nm。荷叶碱,0–5min,8%A;5–5.5min,8–22%A;7.5–13min,22%A;检测波长0~6min,275nm;6-13min,270nm。芦丁和金丝桃苷,0–5min,8%A;5–5.5min,8–24%A;7.5–13min,24%A;检测波长0~6min,275nm;6-13min,360nm。丹酚酸B,0–5min,8%A;5–5.5min,8–40%A;7.5–13min,40%A;检测波长0~6min,275nm;6-13min,286nm。
7.3.55种活性成分绝对生物利用度考察
取已制备好的血液样品,按“7.3.3”项下条件处理,“7.3.4”项下条件分析后,由标准曲线计算出各成分的血药浓度。以不同取血时间为横坐标,各成分血药浓度为纵坐标,应用Excel绘制出各组药-时曲线,采用梯形面积法计算药时曲线下面积,根据公式(3)式计算各成分在大鼠体内的绝对生物利用度:
公式(3)
5种活性成分两种给药方式的AUC值和给药剂量D见表12。经计算三叶片中芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、丹酚酸B在大鼠体内口服给药绝对生物利用度见表12。
表125种活性成分不同给药方式给药剂量下的AUC和生物利用度
通过表12中5种活性组分的绝对生物利用度可以看出,本发明提供的中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法与绝对生物利用度基本具有良好的相关性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种中药口服速释制剂中活性成分的体外分类方法,其特征在于,包括以下步骤:
测定目标中药口服速释制剂中目标活性成分在第一介质中的溶解度Cs,并根据已确定的溶解度Cs确定目标活性成分的单次口服最大剂量的剂量数D0;
测定所述目标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度AD30min;并根据AD30min确定出所述目标活性成分对应的溶出校正因子D;
测定所述目标活性成分在第三介质中3小时的降解率DP3h;并根据DP3h确定出所述目标活性成分对应的降解校正因子S;
根据已确定的剂量数D0、溶出校正因子D及降解校正因子S,确定所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0,所述Mod-D0=D0×D×S;
确定所述目标活性成分的渗透性参数CLogP;
根据已确定的所述目标活性成分的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP,采用二维象限法对所述目标活性成分进行分类。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述剂量数D0的确定方法为:通过公式D0=(M0/V0)/Cs来计算剂量数D0,其中,M0为目标活性成分单次最大口服剂量;V0为250mL。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述溶出校正因子D的确定方法为:
当所述AD30min>85%时,D=1;
当所述AD30min≤85%时,D=85%/AD30min。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述降解校正因子S的确定方法为:
当所述DP3h<5%时,S=1;
当所述DP3h≥5%时,S=DP3h/5%。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述二维象限法为:以修正剂量数Mod-D0为横坐标,以渗透性参数ClogP为纵坐标,将坐标平面分成四个区域,分别为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅳ区,其中,Ⅰ区对应二维象限法的第一象限,Ⅱ区对应二维象限法的第二象限,Ⅲ区对应二维象限法的第三象限,Ⅳ区对应二维象限法的第四象限;
所述对所述目标活性成分通过二维象限法进行分类,具体为:
当所述目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅰ区时,所述目标活性成分为Ⅰ类药物,即高溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅱ区时,所述目标活性成分为Ⅱ类药物,即低溶解性、高渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅲ区时,所述目标活性成分为Ⅲ类药物,即高溶解性、低渗透性药物;当目标活性成分对应的修正剂量数Mod-D0及渗透性参数ClogP位于Ⅳ区时,所述目标活性成分为Ⅳ类药物,即低溶解性、低渗透性药物。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述渗透性参数CLogP具体为:
目标活性成分的油水分配系数;
或
目标活性成分的表观渗透系数。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:采用桨法测定所述目标活性成分在第二介质中第30分钟的累积溶出度AD30min。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于:采用加速实验法测定所述目标活性成分在第三介质中3小时的降解率DP3h。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于:采用体外表皮单层细胞培养通透性实验确定目标活性成分的表观渗透系数。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述目标中药口服速释制剂为三叶片,所述三叶片的活性成分包括:芍药苷、荷叶碱、芦丁、金丝桃苷及丹酚酸B。
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