CN106706782A - 一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其包括以下步骤：步骤一，对照品溶液的配制；步骤二，样品处理；步骤三，确定液相色谱条件等。本发明可以快速准确测定氨糖含量，减少实验室环境对方法的影响，降低实验室检测成本，提高检测准确度、重现性，本发明对环境要求不高，样品溶液也比较稳定，存在检测精度高，重复性好的优点；同时，该发明减少了溶剂使用量，分析成本大大降低，提供了一种简便、快捷、准确且低成本测定氨糖含量的高效液相色谱分析方法，检测产品可以是原料、纯氨糖片、氨糖MSM片、氨糖软骨素片等产品，适用范围广，实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定氨糖含量的方法，特别是涉及一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法。
背景技术
氨糖的全称是D-氨基葡萄糖，属单糖成份，可从蟹虾壳中萃取，是亲水性极强的蛋白多糖的重要组成部分，是形成软骨细胞的重要营养素之一，也是软骨基质和关节液的基本成分，工业提取的氨糖分为D-氨基葡萄糖盐酸盐、D-氨基葡萄糖硫酸盐 、高纯硫酸氨糖三种，广泛用于骨关节疾病的预防和治疗。
最新医学研究发现，人体内缺乏氨糖会直接导致各种骨关节疾病的发生，而氨糖流失的过程在人们35岁左右就已经开始了。氨糖不仅控制着人体骨关节的健康，还控制着关节软骨滑膜的代谢平衡。氨糖是生物萃取得来，比较安全，没有副作用及药物依赖性，但成年人每日食用量最好控制在2000mg以下。所以任何氨糖补充剂中的氨糖含量还是需要控制测定。
目前国内外都有氨糖含量测定的方法，也包括一些法定方法，主要是HPLC法，它们普遍存在一些缺陷：比如方法对实验室检测环境要求太高（温度控制很严格），检测结果重现性不好等。而很多实验室的环境控制达不到方法的要求，就会出现检测结果偏差大，不稳定等现象，为了解决这一难题，本发明通过对样品处理和色谱条件的改善，运用高效液相色谱仪高效准确的分析氨糖的含量。本方法降低了对实验室的环境控制的要求，提高了样品检测的准确性，也减少了检测成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其准确测定氨糖含量，减少实验室环境对方法的影响，降低实验室检测成本，提高检测准确度、重现性，本发明对环境要求不高，样品溶液也比较稳定，存在检测精度高，重复性好的优点；同时，该发明减少了溶剂使用量，分析成本大大降低，提供了一种简便、快捷、准确且低成本测定氨糖含量的高效液相色谱分析方法，检测产品可以是原料、纯氨糖片、氨糖MSM片、氨糖软骨素片等产品，适用范围广，实用性强。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其包括以下步骤：
步骤一，对照品溶液的配制；
步骤二，样品处理；
步骤三，确定液相色谱条件；
所述，步骤一包括以下步骤：
步骤十一，采用USP 标准品作为氨糖对照品，精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液；吸取适量标准储备液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯，再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤十三，转移上述溶液约适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤二包括以下步骤：
步骤二十一，精密称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入适量醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤二十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；
步骤二十三，吸取适量上述溶液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯，再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤二十四，转移上述溶液适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤三包括以下步骤：
步骤三十一，选择高效液相色谱仪和带紫外检测器；
步骤三十二， 选择产品参数为C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色谱柱；
步骤三十三，设定流速为 1.0mL/min；
步骤三十四，设定第一流动相为磷酸溶液；第二流动相为乙腈；
梯度如下表所示：
| 时间（min） | 第一流动相 | 第二流动相 |
| 0 | 85% | 15% |
| 1.5 | 85% | 15% |
| 2.0 | 0% | 100% |
| 3.5 | 0% | 100% |
| 5.0 | 85% | 15% |
| 7.0 | 85% | 15% |
步骤三十五，设定检测波长为UV240nm；
步骤三十六，设定柱温为25℃；
步骤三十七，设定进样量为2μL。
优选地，所述步骤十一中氨糖的含量的计算公式如下式所示：
其中：A对、A样分别为对照品、样品的峰面积；
W对为对照品的重量，mg；
W样为样品的重量，g；
C对为对照品的含量。
优选地，所述步骤十二中的标准储备液的配制为：精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解，用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液，其浓度约为1.0mg/ml。
优选地，所述步骤一中的溶液的配制为：吸取标准储备液适量至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
优选地，所述步骤二中的样品处理为：称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解；用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯，再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
本发明的积极进步效果在于：本发明准确测定氨糖含量，减少实验室环境对方法的影响，降低实验室检测成本，提高检测准确度、重现性，用醋酸钠、异硫氰酸苯酯对样品进行衍生化处理，再用甲醇水提取，最后用庚烷振摇萃取出未反应的PITC，得到甲醇层溶液分析；对环境要求不高，样品溶液也比较稳定，存在检测精度高，重复性好的优点；采用5cmC18柱代替传统的25cmC18柱，检测速度提高了5倍，同时也减少了溶剂使用量，分析成本大大降低，提供了一种简便、快捷、准确且低成本测定氨糖含量的液相方法，检测产品可以是原料、纯氨糖片、氨糖MSM片、氨糖软骨素片等产品，适用范围广，实用性强。
附图说明
图1A为本发明中实施例1的标准品测定的结果图。
图1B为本发明中实施例1的样品测定的结果图。
图2A为本发明中实施例2的标准品测定的结果图。
图2B为本发明中实施例2的样品测定的结果图。
图3A为本发明中实施例3的标准品测定的结果图。
图3B为本发明中实施例3的样品测定的结果图。
图4为本发明运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
如附图4所示，本发明运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法包括以下步骤：
步骤一，对照品溶液的配制；
步骤二，样品处理；
步骤三，确定液相色谱条件；
所述，步骤一包括以下步骤：
步骤十一，采用USP 标准品作为氨糖对照品，精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液；吸取适量标准储备液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤十三，转移上述溶液约适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤二包括以下步骤：
步骤二十一，精密称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入适量醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤二十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；
步骤二十三，吸取适量上述溶液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯（PITC），再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤二十四，转移上述溶液适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤三包括以下步骤：
步骤三十一，选择高效液相色谱仪和带紫外检测器；
步骤三十二， 选择产品参数为C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色谱柱；
步骤三十三，设定流速为 1.0mL/min；
步骤三十四，设定第一流动相为磷酸溶液；第二流动相为乙腈；
梯度如下表所示
| 时间（min） | 第一流动相 | 第二流动相 |
| 0 | 85% | 15% |
| 1.5 | 85% | 15% |
| 2.0 | 0% | 100% |
| 3.5 | 0% | 100% |
| 5.0 | 85% | 15% |
| 7.0 | 85% | 15% |
步骤三十五，设定检测波长为UV240nm；
步骤三十六，设定柱温为25℃；
步骤三十七，设定进样量为2μL。
所述步骤十一中氨糖的含量的计算公式如下式所示：
其中：A对、A样分别为对照品、样品的峰面积；
W对为对照品的重量，mg；
W样为样品的重量，g；
C对为对照品的含量。
所述步骤十二中的标准储备液的配制为：精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解，用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液，其浓度约为1.0mg/ml。
所述步骤一中的溶液的配制为：吸取标准储备液适量至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
所述步骤二中的样品处理为：称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解；用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
本发明适用于氨糖原料、纯氨糖片、含MSM的氨糖片、含硫酸软骨素的氨糖片。
实施例1
氨基葡萄糖盐酸盐颗粒（21-727）中氨糖含量的测定：
本发明所用试剂及配制： 醋酸钠（分析纯）、异硫氰酸苯酯（分析纯）、甲醇（色谱纯）、庚烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、磷酸（分析纯）；
标准储备液的配制：精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解。用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液，其浓度约为1.0mg/ml。
标准工作溶液的配制：吸取标准储备液适量至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯（PITC）,再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液约5ml溶液至离心管中，加入约5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
样品处理：称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入约0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解。用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯（PITC），再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水（65/35）至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪, 带紫外检测器；
色谱柱：C18柱，50mm×4.6mm，2.7μm
流速： 1.0mL/min
检测波长：UV240nm
柱温：30℃
进样量：2μL
第一流动相：磷酸溶液；第二流动相：乙腈；梯度如下表所示：
| 时间（min） | 第一流动相 | 第二流动相 |
| 0 | 85% | 15% |
| 1.5 | 85% | 15% |
| 2.0 | 0% | 100% |
| 3.5 | 0% | 100% |
| 5.0 | 85% | 15% |
| 7.0 | 85% | 15% |
计算公式如下式所示：
样品检测结果如附图1A、附图1B所示。
实施例2
Glucosamine Sulfate 2KCL 1000mg Tablet（GT2L）（江苏艾兰得营养品有限公司生产）样品中氨糖含量的测定：
具体步骤同第一实施例1，样品检测结果如附图2A、附图2B所示。
实施例3
氨糖软骨素维生素D钙片（GT0Q）（江苏艾兰得营养品有限公司生产）样品中氨糖含量的测定：
具体步骤同第一实施例1，样品检测结果如附图3A、附图3B所示。
以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一，对照品溶液的配制；
步骤二，样品处理；
步骤三，确定液相色谱条件；
所述，步骤一包括以下步骤：
步骤十一，采用USP 标准品作为氨糖对照品，精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液；吸取适量标准储备液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯，再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤十三，转移上述溶液适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤二包括以下步骤：
步骤二十一，精密称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入适量醋酸钠溶液，超声溶解；
步骤二十二，用醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；
步骤二十三，吸取适量上述溶液至另一容量瓶中，加异硫氰酸苯酯，再加甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，水浴中加热，冷却至室温；
步骤二十四，转移上述溶液适量至离心管中，加入庚烷，振摇，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样；
所述，步骤三包括以下步骤：
步骤三十一，选择高效液相色谱仪和带紫外检测器；
步骤三十二， 选择产品参数为C18，50mm×4.6mm，2.7μm的色谱柱；
步骤三十三，设定流速为 1.0mL/min；
步骤三十四，设定第一流动相为磷酸溶液；第二流动相为乙腈；梯度如下表所示：
步骤三十五，设定检测波长为UV240nm；
步骤三十六，设定柱温为25℃；
步骤三十七，设定进样量为2μL。
2.如权利要求1所述的一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其特征在于，所述步骤十一中氨糖的含量的计算公式如下式所示：
其中：A对、A样分别为对照品、样品的峰面积；
W对为对照品的重量，mg；
W样为样品的重量，g；
C对为对照品的含量。
3.如权利要求1所述的一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其特征在于，所述步骤十二中的标准储备液的配制为：精密称定适量的D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解，用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀作为标准储备液，其浓度为1.0mg/ml。
4.如权利要求1所述的一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其特征在于，所述步骤一中的溶液的配制为：吸取标准储备液适量至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯，再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
5.如权利要求1所述的一种运用高效液相色谱法测定氨糖含量的方法，其特征在于，所述步骤二中的样品处理为：称取一定量的供试品置一容量瓶中，加入0.1mol/L醋酸钠溶液，超声溶解；用0.1mol/L醋酸钠溶液稀释至刻度，混匀；吸取上述溶液至另一容量瓶中，加350μl异硫氰酸苯酯，再加10ml甲醇，超声溶解，加甲醇/水至刻度，混匀，80℃水浴中加热10min，冷却至室温；转移上述溶液5ml溶液至离心管中，加入5ml庚烷，振摇2min，将甲醇层转移至HPLC瓶中，进样。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method for determination of ammonia sugar content by high performance liquid chromatography Effective date of registration: 20201021 Granted publication date: 20190226 Pledgee: Jingjiang Branch of Bank of China Ltd. Pledgor: JIANGSU ALAND NOURISHMENT Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006975 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |