CN104833753A - Edc残留的hplc-elsd检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，该方法包括如下步骤：(1)取待测物进行预处理，将待测物中的EDC提取出并富集到溶剂中，得到待测样品；(2)采用HPLC-ELSD检测法检测待测样品中的EDC含量。该方法使得样品检测前的预处理方式不需要采用二甲基巴比妥酸和吡啶进行光学修饰，杜绝使用有机试剂。成本低、检测结果能够满足检测结果质量判定，既适用于实验室的研发，更适用于企业的大规模生产，如应用在采用EDC交联的皮肤修复胶原海绵、胶原硬脑膜补片等胶原蛋白膜产品的生产及检测中。
Description
技术领域
本发明涉及EDC的检测技术领域，具体涉及EDC残留的HPLC-ELSD检测方法。
背景技术
在现今较为稳定的化学交联方法中，碳二亚胺的交联体系越来越受到关注，因为其本身的毒性小，交联效果迅速，结果稳定等优点都极好地弥补了传统采用甲醛，戊二醛等交联方式所带来的毒性问题。相比于诸如热交联等物理交联方法而言，碳二亚胺的交联体系更为稳定，交联出的产品更加符合实际应用。
在交联工艺完成之后，交联剂本身的残留定量检测就成为一个亟待解决的问题，在ICH(The International Conference on Harmonization of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use人用药物注册技术要求国际协调会议)于其《Q3AR2：新原料药中杂质》中规定药品中所涉及到的杂质必须要进行研究和检测。
EDC(1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺，1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC or EDAC)是碳二亚胺系列中活性较高的脱水剂，主要用作生物多糖、多肽、蛋白质、核苷酸合成、高分子改性和有机合成的缩合剂和交联剂。在医疗器械领域，生物高分子材料发展如火如荼，应用前景巨大，比如现今较为热门的胶原蛋白研究领域，该领域中，胶原蛋白膜可以作为包装膜、皮肤替代物、角膜、面膜用于食品、生物医学、化妆品等不同行业，热门的产品包括皮肤修复胶原海绵、胶原硬脑膜补等。尽管研究时日漫长，而在产品交联方面还是存在着较大的问题，传统交联剂诸如甲醛，戊二醛等毒性巨大，EDC作为一种化学交联剂，通过控制交联剂的用量可以实现对胶原蛋白等生物大分子制品交联度的精确控制，能够更好地满足于产品安全性以及有效性的需求，是未来大生产中交联剂发展的主要方向之一。
在2010版中国药典中，EDC的残留检测采用分光光度法，分光光度法本身专一性不高，许多物质均存在紫外吸收，对于样品中就存在吸光的物质很难排除，而HPLC法对于样品的分析专一性更强，分光光度法中使用吡啶以及二甲基巴比妥酸等有毒有机试剂对残留的EDC进行化学修饰，过程繁琐，且不利于人员和环境安全。也有报道显示采用液质联用能够做到更为优良的检测限，检测出痕量EDC残留，但该方法成本较高，不是所有企业或者研究学者能够负担，应用上受到极大限制；况且痕量检测对于常规的研发和企业实际生产的意义不大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种微量EDC残留的HPLC-ELSD检测方法。
本发明提供的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，包括如下步骤：
(1)取待测物进行预处理，将待测物中的EDC提取出并富集到溶剂中，得到待测样品；
(2)采用HPLC-ELSD检测法检测待测样品中的EDC含量。
进一步地，所述步骤(2)中包括如下子步骤：
(2a)配制EDC标准液；
(2b)对EDC标准液进行HPLC-ELSD检测，条件为：
HPLC条件：
色谱柱：采用反相C18柱；
色谱柱温度：10～30℃；
流动相：流动相分为水相和有机相，水相为甲酸水溶液或TFA水溶液，有机相为甲醇；
ELSD条件：雾化器温度：100℃～105℃，蒸发室温度与雾化器温度一致，雾化器气体：氮气，气体流速：1.6～1.8L/min；
(2c)根据标准液检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程，按(2b)中的条件对待测样品检测，计算待测样品的峰面积，代入所得的标准曲线方程，计算出待测样品中EDC的含量。
优选地，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格为4.6mm×250mm×5um。
优选地，水相为0.1％(v/v)的甲酸水溶液。
优选地，所述流动相中0.1(v/v)％甲酸水溶液和甲醇的体积比90～95:10～5。
优选地，色谱柱温度为25℃。
进一步地，HPLC条件中还包括：
进样量：50ul；
流动相流速：1ml/min。
优选地，雾化器温度为105℃。
进一步地，步骤(2a)中的配制方法为：称取0.0965gEDC加水溶解并定容至100ml，再取1ml至10ml容量瓶，加水定容至刻度，得到96.5mg/L EDC对照品贮备液；
标准液梯度浓度配置：取96.5mg/L的EDC对照品储备液，分别移取10ml、20ml、30ml、40ml、50ml，分别定容至100ml，得到浓度分别9.65ug/ml、19.3ug/ml、28.95ug/ml、38.6ug/ml、48.25ug/ml的梯度浓度标准液。
步骤(1)中，若所述待测物为胶原蛋白，所述预处理的方式为：取胶原蛋白膜样品1.5000g，然后将样品剪成为小片，加无水乙醇50ml，在37.5℃下浸提1h，然后将样品挤干，并弃去样品，将浸提后得到的无水乙醇液于37.5℃下进行真空干燥直至乙醇全部除去，再添加1ml纯化水溶解干燥后的样品作为待测样品液。对胶原蛋白采用上述预处理方式处理，EDC残留的检测限度更小、检测结果更加精确。此外，针对其他类型的样品(如疫苗等液体产品)的EDC残留检测，本领域技术人员有能力选择与之相应的预处理方式。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)ELSD检测时样品不要求带有发色团或荧光基团，样品检测前的预处理方式不需要采用二甲基巴比妥酸和吡啶进行光学修饰，杜绝使用有机试剂。样品直接溶解进样分析。
(2)样品检测时间较短，对于产品中控或者清洗验证等能较快检测结果，适用性良好。
(3)检测成本相比较于液质联用来说更为节省，检测结果能够满足检测结果质量判定，既适用于实验室的研发，更适用于企业的大规模生产，可以应用于任何需要进行EDC残留检测产品，尤其对于采用EDC交联的皮肤修复胶原海绵以及胶原硬脑膜补片等采用胶原蛋白为原材料生产的产品，本专利采用的样品前处理方法结合HPLC-ELSD能够较为方便地检测胶原蛋白产品中残留的EDC。
附图说明
图1～5依次是是1号～5号标准液样品的HPLC图谱；
图6为EDC标准曲线；
图7～11为3号标准液样品的5次重复试验的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
术语解释：本发明中所称“待测物”，指的是在检测EDC残留不能直接用于检测的样品，“待测样品”指的是对“待测物”进行预处理后得到的样品，可以直接用于EDC残留的检测；本发明所称“富集”是指将待测物中的EDC集中溶于溶剂(如水)中形成待测样品。
实施例
1：待测样品的制备与标准液配制
1.1胶原蛋白待测样品制备:
取待测物胶原蛋白膜样品1.5000g，于分析天平上精密称定，然后用剪刀将样品修剪成为小片(小片的大概尺寸最好说明)，加无水乙醇50ml，放置于样品浓缩装置的浓缩瓶之中，设置温度为37.5℃浸提1h，然后用镊子将样品挤干，并弃去样品，将浸提的无水乙醇液于37.5℃下进行真空干燥直至乙醇全部除去，再添加1ml纯化水于浓缩瓶中对瓶壁润洗作为待测样品液，采用上述处理方式，将胶原蛋白中残留的微量EDC进行富集，最终富集到1ml纯化水中。
1.2标准液配置
96.5mg/L EDC对照品贮备液配制：称取0.0965gEDC溶解并定容至100ml，再取1ml至10ml容量瓶，加水定容至刻度，得到96.5mg/L EDC对照品贮备液。
标准液梯度浓度配置：取96.5mg/L的EDC对照品贮备液，分别移取适量，配置成为标准曲线浓度梯度见表1
表1：标准曲线配制
2：检测标准液并绘制标准曲线
检测条件为：
色谱仪：安捷伦1260B型色谱仪；
ELSD检测器：1260 infinity ELSD；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm×5um；即内径4.6mm，柱长250mm，填料粒径5μm；
色谱柱温度：25℃；
流动相：水相：0.1％体积浓度的甲酸溶液，有机相：甲醇，以下为简便，将水相称为“A”，有机相称为“B”；
流动相体积比例：A：B＝95:5；
进样量：50ul；
流动相流速：1ml/min；
ELSD检测器雾化器气体为N2，流速1.6～1.8L/min，蒸发室温度100℃～105℃，雾化器温度跟蒸发室温度保持一致。
梯度：采用等度洗脱，水相：有机相＝95:5。
积分时间：5min
2.1流动相比例对于EDC保留时间影响
调节流动相比例对EDC对照储备液进行检测，结果如表2。
表2：流动相比例对EDC保留时间影响
2.2雾化器流速变化对于EDC
雾化器气体(N2)流速1.6L/min，雾化器温度105℃，蒸发室温度跟雾化器温度一致，结果见表3
表3：雾化器温度对于EDC检出限影响
2.3雾化器、蒸发室的温度对检出限影响
表4：雾化器，蒸发室温度对EDC检测限影响结果
2.4.标准曲线结果
不同梯度浓度的标准样按照上述色谱条件进样分析，以峰面积计算并绘制标准曲线，结果见表5，图谱见图1～5所示。标准曲线见图6。
表5：标准曲线结果
2.5样品重复性实验
取3#样品，按照标准曲线的色谱条件进样5针。结果见表6，图谱见图7～11.
表6：样品重复性实验结果
2.6待测样品中EDC残留的检测
取步骤1.1中得到的待测样品液，对待测样品液按和上述标准液相同的检测条件进行检测，计算待测样品的峰面积，代入所得的标准曲线方程，计算出待测样品中EDC的含量。检测结果如下表7所示，其中“检测结果”为从标准曲线中直接计算得到的结果，结果计算是根据人体接收量核算得到的，即：
根据中国药典2010版第三部正文b型流感嗜血杆菌结合疫苗检测项下，EDC的残留限度为10umol/L，该疫苗人体每次接受剂量为0.5ml，即人体每次接受EDC的最大绝对量为0.96ug，硬脑膜样品每片为0.08g，即硬脑膜中EDC的残留限度不得大于12ug/g，样品最终稀释度为1倍，即样品浸提液检测残留不得大于12ug/ml。
表7:EDC残留量检测结果
本发明的保护范围并不局限于对胶原蛋白产品中EDC残留的检测，针对其他类型的样品(如疫苗等液体产品)，本领域技术人员有能力选择与之相应的预处理方式得到待测样品，本实施例中的色谱条件及标准曲线对其也同样适用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取待测物进行预处理，将待测物中的EDC提取出并富集到溶剂中，得到待测样品；
(2)采用HPLC-ELSD检测法检测待测样品中的EDC含量。
2.根据权利要求1所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中包括如下子步骤：
(2a)配制EDC标准液；
(2b)对EDC标准液进行HPLC-ELSD检测，条件为：
HPLC条件：
色谱柱：采用反相C18柱；
色谱柱温度：10～30℃；
流动相：流动相分为水相和有机相，水相为甲酸水溶液或TFA水溶液，有机相为甲醇；
ELSD条件：雾化器温度：100℃～105℃，蒸发室温度与雾化器温度一致。雾化器气体：氮气，气体流速：1.6～1.8L/min；
(2c)根据标准液检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程，按(2b)中的条件对待测样品检测，计算待测样品的峰面积，代入所得的标准曲线方程，计算出待测样品中EDC的含量。
3.根据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格为4.6mm×250mm×5um。
4.据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，水相为0.1％(v/v)的甲酸水溶液。
5.根据权利要求4所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，所述流动相中0.1(v/v)％甲酸水溶液和甲醇的体积比90～95:10～5。
6.根据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，色谱柱温度为25℃。
7.根据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，HPLC条件中还包括：
进样量：50ul；
流动相流速：1ml/min。
8.根据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，雾化器温度为105℃。
9.根据权利要求2所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，步骤(2a)中的配制方法为：称取0.0965gEDC加水溶解并定容至100ml，再取1ml至10ml容量瓶，加水定容至刻度，得到96.5mg/L EDC对照品贮备液；
标准液梯度浓度配置：取96.5mg/L的EDC对照品储备液，分别移取10ml、20ml、30ml、40ml、50ml，分别定容至100ml，得到浓度分别9.65ug/ml、19.3ug/ml、28.95ug/ml、38.6ug/ml、48.25ug/ml的梯度浓度标准液。
10.根据权利要求1-9任一所述的EDC残留的HPLC-ELSD检测方法，其特征在于，步骤(1)中，若所述待测物为胶原蛋白，所述预处理的方式为：取胶原蛋白膜样品1.5000g，然后将样品剪成为小片，加无水乙醇50ml，在37.5℃下浸提1h，然后将样品挤干，并弃去样品，将浸提后得到的无水乙醇液于37.5℃下进行真空干燥直至乙醇全部除去，再添加1ml纯化水作为待测样品液。
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