CN103575835B

CN103575835B - 右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法

Info

Publication number: CN103575835B
Application number: CN201310545294.1A
Authority: CN
Inventors: 刘海静; 王嫦鹤; 王发; 张秉华; 耿庆光; 刘雪峰; 由亚宁; 马鹏飞
Original assignee: Foods In Shaanxi Province Institute For Drug Control
Current assignee: Foods In Shaanxi Province Institute For Drug Control
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-11-05
Also published as: CN103575835A

Abstract

本发明涉及“右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法”，包括固相萃取及液相检测两个步骤，在液相分析前对注射液进行了预处理，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱对糠醛进行富集吸附，并将右旋糖酐40去除，收集到液相样品；同时液相检测中采用梯度洗脱的方式，流动相A：甲醇，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，延长了色谱柱的使用寿命。本发明方法灵敏度高，能同时检测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛，注射液中2-糠醛的最低检出浓度为0.00015μg/mL；重复性好，一批6份注射液测定结果，其含量平均值为0.0889μg/mL，RSD为0.6%；精密度RSD为0.4%，加样回收率平均为93.1%，RSD为0.9%。

Description

右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法

技术领域

本发明涉及一种药物微量杂质成分的HPLC的检测方法，特别是涉及右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法。

背景技术

右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.M-1226号菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得，其分子式为(C₆H₁₀O₅)n。右旋糖酐按照分子量不同分为高分子（10～20万）、中分子量（6万～8万）、低分子量（2～4万）和小分子量（1～2万）右旋糖酐。右旋糖酐40的重均分子量（Mw）为32000～42000，属于低分子右旋糖酐。国内于1952年研制成功，1957年开始应用于临床。右旋糖酐40主要用于增加血浆容量，维持血压，以抗休克为主。广泛应用于各种休克、血栓性疾病、肢体再植和血管外科手术等。右旋糖酐能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外的水分而补充血容量，维持血压；使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性，从而改善微循环，防止休克后期的血管内凝血；抑制凝血因子Ⅱ的激活，使凝血因子Ⅰ和Ⅷ活性降低以及其抗血小板作用均可阻止血栓形成。此外，还具渗透性利尿作用（黄勋,陈槐卿,王玲等.右旋糖酐40,70对红细胞与内皮细胞粘附的影响[J].生物医学工程学杂志,1998,15(3):240～242.）。

可能是由于蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226号菌发酵后生成的右旋糖酐分子量较大，大分子右旋糖酐作为血浆代用品安全性较差，须用稀酸水解以获得较低分子量的药用右旋糖酐，但是水解的同时，也会使部分右旋糖酐分解成低聚糖，经异麦芽三糖、异麦芽二糖，生成葡萄糖（李艳，陈学武，牟德华.右旋糖酐的生产及应用.山西食品工业[J],1998.3:36-37.）。己糖(葡萄糖、果糖等单糖)与氨基酸在高温、酸性条件或微生物的作用下脱水发生美拉德（Maillard）反应生成5-羟甲基糠醛及糠醛（杨朝霞，李梅，董建军等.高效液相色谱同时测定啤酒中的5-羟甲基糠醛和糠醛[J].酿酒科技,2006,9:88-89.）。《中国药典》2010年版二部中只采用紫外法对右旋糖酐40葡萄糖注射液中的5-羟甲基糠醛（以下简称5-HMT）进行了限度检查，而对右旋糖酐40氯化钠注射液未做控制。“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的限量”，建立了用HPLC法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中5-HMT含量的方法，其结果在各批右旋糖酐40氯化钠注射液中均检测出了5-HMT，因此有必要对其进行质量控制。但是在现有的文献中均没有报导右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中有过检测出糠醛的报导。

糠醛为有机化合物，是呋喃2位上的氢原子被醛基取代的衍生物，分子式C5H4O2，又称2-呋喃甲醛。糠醛属中等毒性类物质，其蒸气具有强烈的刺激性，并有麻醉作用。动物吸入、摄入或经皮肤吸收均可引起急性中毒，表现有呼吸道刺激、肺水肿、肝损害、中枢神经系统损害、呼吸中枢麻痹，以致死亡。其急性毒性：LD₅₀为65mg/kg(大鼠经口)，最小致死剂量500mg/kg（人经口），亚急性和慢性毒性：人吸入7.4～52.7mg/m³×3个月，发生粘膜刺激、结膜炎、流泪、头痛。此外糠醛是染色体断裂剂，具有诱发碱基对置换的突变作用，具有诱发精子畸形和精母细胞姊妹染色单体交换的遗传毒性作用，具有诱发脑室扩张的致畸作用等较大的潜在遗传及生殖毒性（牛凤云,王金山,王建刚,魏艳萍.糠醛对大鼠致畸效应的研究,1992,6(4):290；陈卫平,王金山,宋霖.糠醛诱发小鼠精子畸形的实验研究.卫生毒理学杂志,1994,8(2):129）。因此，美国政府工业卫生专家学会(ACGIH)在1981年即通过了2ppm的阈限值（TLV-TWA）的规定。

从现有文献报导来看，对于右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中糠醛的存在是有可能的，即使其含量非常的低，为保证用药安全，对于糠醛检测及限量是必须的。

按照“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的限量”建立的HPLC法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛，由于2-糠醛与5-羟甲基糠醛的结构有差异，而且2-糠醛的含量很低，上述检测方法要同时检测出两种杂质难度较大。前期研究结果表明，采用液相色谱进行测定时，液相色谱对糠醛的最低检出限为0.003μg/mL，即注射液中2-糠醛可检出的最低浓度为0.003μg/mL，糠醛在其氯化钠注射液中含量较低，约为0.008～0.17μg/mL，最低含量接近于最低检出浓度，不便于准确检测。此外，由于该样品中右旋糖酐40的浓度较高，采用文献中流动相等度洗脱方式进行洗脱，将会使右旋糖酐40残留在色谱柱柱头，影响色谱柱的寿命。因此采用检测5-羟甲基糠醛的条件及方法，还不能检测出右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的存在。

发明内容

针对上述领域中的不足，本发明提供一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，通过优化的液相检测条件，检测出右旋糖酐40氯化钠注射液中确有2-糠醛存在，该HPLC检测方法重复性好，且采用梯度洗脱方法，右旋糖酐40的残留少，对色谱柱的使用寿命影响较小。

一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，包括固相萃取及液相检测两个步骤，其特征在于：所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化钠注射液上柱，用水洗涤，去除右旋糖酐及氯化钠，再加甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，真空离心挥干，用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（50:50）溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，作为液相检测的供试品溶液；所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱，所述流动相A：甲醇，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0），0～3.00min采用100%的水相，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10～18.00min采用A-B体积比为30:70的混合流动相，18.10～21.00min采用A-B体积比为50:50的混合流动相，21.10～28.00min采用100%的水相平衡色谱柱。

所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱。

所述固相萃取中，用水洗涤至少三次。

所述液相检测中的色谱柱为MACHEREY-NAGEL C₁₈(250×4.6mm,5μm)，检测波长：275nm。

所述洗脱过程中，柱温为40℃，流动相流速：1.0mL/min。

由于右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛浓度太低，不便于检测，因此本发明在进行液相检测前，进行了预处理，使用固相萃取法将注射液中氯化钠和右旋糖酐去除，同时将糠醛富集吸附，提高其检测浓度。右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐浓度为6%，氯化钠浓度为0.9%，使用固相萃取小柱萃取过程中，需用水洗脱3次，每次3mL，用以去除右旋糖酐及氯化钠，然后用甲醇洗脱糠醛，收集甲醇洗脱液，挥干甲醇，加流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（50:50）溶解，用于液相分析。由于右旋糖酐40易于在色谱柱的柱头残留，从而影响色谱柱的使用寿命，本发明采用了梯度洗脱的方式，0～3.00min采用100%的水相，柱温40℃，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10～18.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（30:70）对样品中的糠醛进行分析测定；18.10～21.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（50:50），增加流动相中有机相的比例，洗脱样品中的极性较弱的杂质；21.10～28.00min采用100%的水相平衡色谱柱。

本发明方法在采用液相分析前对样品溶液进行了预处理，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱对糠醛进行富集吸附，并将右旋糖酐40去除，收集到液相样品溶液；同时液相检测中采用梯度洗脱的方式，去除残留，延长了色谱柱的使用寿命。采用本发明的方法，能同时检测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛，对于该注射剂安全性评价有重要依据。本发明方法灵敏度高，注射液中2-糠醛的最低检出量为0.00015μg/mL，特别适用于注射液中2-糠醛含量较低样品的检测，测定结果更准确；重复性好，一批6份注射液测定结果，其含量平均值为0.0889μg/mL，RSD为0.6%；精密度RSD为0.4%，加样回收率平均为93.1%，RSD为0.9%。

附图说明

图1空白色谱图，

图22-糠醛对照品色谱图，

其中峰1为2-糠醛，

图3右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图，

其中峰1为5-羟甲基糠醛，峰2为2-糠醛

图4右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图，

其中峰1为5-羟甲基糠醛，峰2为2-糠醛。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1.仪器与试药

仪器:Waters Alliance HT系统；检测器：Waters2487紫外检测器。

固相萃取柱:Oasis HLB,60mg,3cc,使用时依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。

试药：糠醛为分析纯，甲醇为色谱纯，水为高纯水。

2.方法与结果

2.1色谱条件：Waters Alliance HT系统；检测器：Waters2487紫外检测器；色谱柱：MACHEREY-NAGEL C₁₈(250×4.6mm,5μm)；洗脱程序采用梯度洗脱，流动相A：甲醇，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）；梯度洗脱程序见表1。柱温：40℃；流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量20μL。

表1注射液梯度洗脱程序

时间(min)	流速（mL/min）	流动相A(%)	流动相B(%)
				0.00	1.0	0	100
3.00	1.0	0	100
				3.10	1.0	30	70
18.00	1.0	30	70
				18.10	1.0	50	50
21.00	1.0	50	50
				21.10	1.0	0	100
28.00	1.0	0	100

0～3.00min采用100%的水相，柱温40℃，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10～18.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（30:70）对样品中的糠醛进行分析测定；18.10～21.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）(50:50），增加流动相中有机相的比例，洗脱样品中的极性较弱的杂质；21.10～28.00min采用100%的水相平衡色谱柱。

2.2对照品溶液的制备：精密称取糠醛对照品10.10mg，用甲醇稀释并定容于100mL量瓶中，摇匀，浓度为101μg/mL，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，用流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（50:50）稀释制成质量浓度分别为0.01，0.10，0.50，1.01，5.05，10.10μg/mL的系列对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备：取经活化的Waters Oasis HLB固相萃取小柱，精密量取右旋糖酐40氯化钠注射液2mL上柱，抽干，用水洗涤3次，每次3mL，抽干，去除右旋糖酐及氯化钠，加3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，真空离心挥干，用流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH为3.0）（50:50）100μL溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4线性实验：分别精密量取系列对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，采用Waters2487紫外检测器，按2.1项下色谱条件分别测定，以峰面积Y对质量浓度X作线性回归，线性方程为Y=193499.7X-4378.4（R=0.9999），线性范围：0.01～10.00μg/mL。

2.5系统适用性：取空白溶液、对照溶液（浓度为1.01μg/mL）、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，经Waters2487紫外检测器记录色谱图。结果显示，空白溶液对糠醛测定无干扰，各色谱峰分离良好，且能同时测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛。空白溶液、对照溶液、供试品溶液的色谱图见图1～3。

2.6最低检测限和最低定量限：根据色谱图的信噪比，仪器最低检测限（S/N=3）为0.003μg/mL，最低定量限（S/N=10）为0.01μg/mL，即注射液中2-糠醛的最低检出量为0.00015μg/mL。

2.7精密度实验：取线性实验项下质量浓度为1.01μg/mL对照品溶液，连续进样6次，按2.1项下色谱条件测定，RSD为0.4%。

2.8重复性实验：取同一批注射液6份，采用2.3项下的操作过程制备样品，按2.1项下色谱条件测定，其含量平均值为0.0889μg/mL，RSD为0.6%。

2.9加样回收率试验：精密称取糠醛对照品适量，用已知糠醛浓度的注射液稀释至糠醛浓度为0.1μg/mL的溶液，按照2.3项下的操作过程，制备加样回收率样品，平行6份，精密进样20μL。按2.1项下色谱条件进行分析，记录色谱图，根据对照品的标准线性方程，计算回收率，得糠醛的平均回收率为93.1%，RSD为0.9%。

2.10供试品中糠醛的检测及结果

分别精密量取供试品溶液20μL，按2.1项下色谱条件进行分析。（色谱图见图4）。

右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛含量见表2。

表2右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛含量的测定结果

本发明采上述方法测定到多家医药公司生产的右旋糖酐40氯化钠注射液中均有糠醛存在，且固相萃取与非固相萃取的含量检测有一定的差别，采用固相萃取后提高了检测的灵敏度，注射液中2-糠醛的最低检出量由非固相萃取时的0.003μg/mL降低至0.00015μg/mL，特别适用于注射液中2-糠醛含量较低样品的检测，测定结果更为准确。本发明方法灵敏度高，重复性好，值得推广。

Claims

1.一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，包括固相萃取及液相检测两个步骤，其特征在于：所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化钠注射液上柱，用水洗涤，去除右旋糖酐及氯化钠，再加甲醇洗脱，收集洗脱液，挥干甲醇，用混合溶剂溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，作为液相检测的制剂供试品溶液；所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱，所述流动相A：甲醇，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，0～3.00min采用100％的水相，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10～18.00min采用A-B体积比为30:70的混合流动相，18.10～21.00min采用A-B体积比为50:50的混合流动相，21.10～28.00min采用100％的水相平衡色谱柱，所述混合溶剂为甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，甲醇与0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液的体积比为50:50，所述液相检测中的色谱柱为MACHEREY-NAGEL C₁₈色谱柱，检测波长：275nm。

2.根据权利要求1所述测定方法，所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱。

3.根据权利要求1所述的测定方法，所述固相萃取中，用水洗涤至少三次。

4.根据权利要求1所述的测定方法，所述洗脱过程中，柱温为40℃，流动相流速：1.0mL/min。