CN105372337A - 一种检测维生素d滴剂中维生素d含量的方法 - Google Patents

一种检测维生素d滴剂中维生素d含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法。本发明通过大量优选出最佳的流动相组成，流速，检测波长和色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的维生素D滴剂的含量检测控制方法稳定性和重复性好、分析效率高、分离度好，可以灵敏准确的定性、定量检测维生素D3，从而客观、全面、准确的评价维生素D滴剂的质量，对控制维生素D滴剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。

Description

一种检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法
技术领域
本方法属于药物分析技术领域，涉及一种检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法。
背景技术
维生素D滴剂是一种用于儿童佝偻病的预防和治疗的药物。经过大量循证医学研究和基础研究发现，维生素D滴剂对癌症、高血压、糖尿病、结核病、免疫功能异常的治疗具有一定的疗效。目前，美国药典、英国药典、欧盟药典及中国药典中收载的维生素D滴剂含量检测方法，相当繁琐，检验效率低。经国内外文献专利检索，尚未发现有关维生素D滴剂含量快速检测文献及专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法。
本发明提供的检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法，包括如下步骤：
1)将已知浓度的维生素D对照品的正己烷溶液进行HPLC检测，并记录每个浓度的维生素D对照品的峰面积，按照如下公式计算对照品校正因子：
对照品校正因子＝浓度/峰面积
2)将待测维生素D滴剂溶于正己烷中，进行HPLC检测，并记录所述待测维生素D滴剂中维生素D的峰面积；
3)按照外标法的方法，将步骤2)所得待测维生素D滴剂中维生素D的峰面积乘以步骤1)所得对照品校正因子，得到所述待测维生素D滴剂中维生素D的浓度，进而得到所述待测维生素D滴剂中维生素D的含量。
上述方法的步骤1)和2)HPLC检测步骤中，检测条件均如下所示：
所用色谱柱的固定相为硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为100～250mm，内径为4.6mm；
进样量均为20-120μL，具体为100μL；
流动相均为由体积比为994～996：6～4的正己烷和异丙醇组成的混合液，具体为由体积比为995∶5的正己烷和异丙醇组成的混合液；所述流动相的流动方式为匀速流动；
流速均为1.0～2.0mL/min，具体为1.5mL/min；
柱温为25～35℃，具体为30℃；
检测波长均为250～270nm，具体为265nm；
保留时间均为10-30min，具体为20min。
所述步骤1)中，所述线性回归方程为Y＝190.57X-5.42。所述步骤2)中，待测维生素D滴剂与正己烷的用量比为720mg：20mL。
具体的，所述维生素D为维生素D3。
本发明通过大量优选出最佳的流动相组成，流速，检测波长和色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的维生素D滴剂的含量检测控制方法稳定性和重复性好、分析效率高、分离度好，可以灵敏准确的定性、定量检测维生素D3，从而客观、全面、准确的评价维生素D滴剂的质量，对控制维生素D滴剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为维生素D3含量测定谱图；
图2为对照品线性图；
图3为维生素D3对照品溶液的液相色谱图；
图4为维生素D3供试品溶液的液相色谱图；
图5为维生素D3阴性对照溶液的液相色谱图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1、维生素D滴剂中维生素D3含量测定
仪器采用Agilent1200高效液相色谱仪；METTLERXP205电子天平。
材料为本公司软胶囊车间生产的维生素D滴剂。
维生素D3对照品购自中国药品生物制品检定所，批号为100061-201208；
正己烷为色谱纯；
其他试剂为分析纯。
一、配制供试品溶液
精密量取720mg左右(含20μg维生素D3)维生素D滴剂内容物，置20mL棕色容量瓶中，加正己烷溶解，定容，摇匀即得供试品溶液。
共设置两个供试品；其中，供试品1的称样量为719.5mg；供试品2的称样量为720.3mg；
二、配制维生素D3对照品溶液
精密称取10mg左右维生素D3对照品，置100mL棕色容量瓶中，加正己烷溶解，定容，摇匀即得维生素D3对照品储备液，然后精密量取1mL储备液至100mL棕色容量瓶中，加正己烷稀释定容至刻度，摇匀即得维生素D3对照品溶液。
共设置两个对照品；其中，对照品1中维生素D3的浓度为1.371ug/ml；对照品2中维生素D3的浓度为1.263ug/ml；
三、供试品溶液中维生素D3含量的测定
按照如下方法检测供试品溶液中维生素D3的含量：
将维生素D3对照品溶液和供试品溶液进行HPLC检测，检测条件均如下所示：
所用色谱柱的固定相为硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为100mm，内径为4.6mm；
进样量均为100μL；
流动相为由体积比为995∶5的正己烷和异丙醇组成的混合液；流动方式为匀速流动；
流速均为1.5mL/min；
柱温为30℃；
检测波长为265nm；
保留时间为20min；
VWD检测器；理论塔板数按维生素D3峰计算应不低于2000。
记录每个浓度(也即1.371ug/ml和1.263ug/ml)的维生素D对照品的峰面积，按照如下公式计算对照品校正因子：
对照品校正因子＝浓度/峰面积
根据图1所得对照品1和2的液相色谱图可知，
由对照品1所得对照品校正因子f1＝1.371/244＝0.005619；
由对照品2所得对照品校正因子f2＝1.263/222.6＝0.005674；
将f1和f2取平均值，得F＝0.005646；
按外标法计算供试品中维生素D3的含量：
对于供试品1：
根据图1所得供试品1的液相色谱图可知，供试品1中维生素D3的峰面积176.8，将其乘以对照品校正因子F＝0.005646，得到供试品1中维生素D3的浓度0.9982ug/ml，进而得到供试品中维生素D3的含量99.90％；
对于供试品2：
根据图1所得供试品2的液相色谱图可知，供试品2中维生素D3的峰面积174.2，将其乘以对照品校正因子F＝0.005646，得到供试品2中维生素D3的浓度0.9835ug/ml，进而得到供试品中维生素D3的含量98.32％；
所得结果如表1所示。
表1、维生素D3含量测定
实施例2、线性试验
一、配制一系列不同浓度的维生素D3对照品溶液
精密量取维生素D3对照品溶液(20μg/ml)0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL分别置于20ml棕色量瓶中，加正己烷稀释至刻度摇匀，即得维生素D3对照品溶液。
二、将维生素D3对照品溶液进行HPLC检测，检测条件均如下所示：
所用色谱柱的固定相为硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为100mm，内径为4.6mm；
进样量均为100μL；
流动相为由体积比为995∶5的正己烷和异丙醇组成的混合液；
流速均为1.5mL/min；
柱温为30℃；
检测波长为265nm；
保留时间为20min；
VWD检测器；理论塔板数按维生素D3峰计算应不低于2000。
HPLC检测完毕记录每个浓度的维生素D3对照品的峰面积，以浓度为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到线性回归方程；
所得结果如表2所示。
表2、维生素D3线性关系
结果表明：维生素D3在0.636～1.484μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。线性回归方程：Y＝190.57X-5.42，R＝0.999，该方程对应的线性曲线见图2。
实验例3、专属性试验
一、配制供试品溶液
同实施例1；
二、配制维生素D3对照品溶液
精密称取10mg维生素D3对照品，置100mL棕色容量瓶中，加正己烷溶解，定容，摇匀即得维生素D3对照品储备液，然后精密量取1mL储备液至100mL棕色容量瓶中，加正己烷稀释定容至刻度，摇匀即得维生素D3对照品溶液。
三、供试品溶液和阴性对照溶液中维生素D3含量的测定
对上述供试品溶液、维生素D3对照品溶液、阴性对照溶液进行色谱分析，色谱图见图4、3、5，表明阴性对照溶液对测定基本无干扰，供试品溶液中维生素D3与杂质峰分离良好，不干扰测定。
实验例4、精密度试验
精密吸取对照品溶液100μL，按实施例1的色谱条件，重复进样6次，峰面积平均值为205.8，RSD％为0.30％。表明本方法精密度较好。结果见表3。
表3、精密度试验结果
实验例5、稳定性试验
同一供试品溶液，按实施例1的色谱条件，分别于配置后0,2,4,8,12小时进样，每次进样量为100μL，测定峰面积积分值平均为186.9，RSD％为0.73，结果见表4。
表4、维生素D3稳定性试验结果
由表3可知，供试品溶液具有很好的稳定性。
实验例6、重复性试验
取同一批供试品6份，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，进样测定，结果见表5，平均含量为99.6％，RSD％为0.37，表明本法有良好的重复性。
表5、重复性试验结果
实验例7、回收率试验
精密称取维生素D3对照10mg，置100ml棕色量瓶中，加正己烷溶解稀释，摇匀即得对照品储备液。
取储备液10ml置50ml棕色量瓶中，加正己烷稀释定容至刻度，摇匀即得维生素D3对照溶液。
分别称取9份720mg辅料花生油，置20ml棕色量瓶中，分别加入0.8ml、1.0ml、1.2ml维生素D3对照品溶液，每种浓度各3份。然后加正己烷稀释定容至刻度，摇匀即得，回收率供试品溶液。
所得结果见表6。
表6、回收率试验结果
由表6可知，9份样品的平均回收率为99.2％，RSD％为1.38％，表明该方法准确度较好。

Claims (4)

1.一种检测维生素D滴剂中维生素D含量的方法，包括如下步骤：
1)将已知浓度的维生素D对照品的正己烷溶液进行HPLC检测，并记录每个浓度的维生素D对照品的峰面积，按照如下公式计算对照品校正因子：
对照品校正因子＝浓度/峰面积
2)将待测维生素D滴剂溶于正己烷中，进行HPLC检测，并记录所述待测维生素D滴剂中维生素D的峰面积；
3)按照外标法的方法，将步骤2)所得待测维生素D滴剂中维生素D的峰面积乘以步骤1)所得对照品校正因子，得到所述待测维生素D滴剂中维生素D的浓度，进而得到所述待测维生素D滴剂中维生素D的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和2)HPLC检测步骤中，检测条件均如下所示：
所用色谱柱的固定相为硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为100～250mm，内径为4.6mm；
进样量均为20-120μL，具体为100μL；
流动相均为由体积比为994～996：6～4的正己烷和异丙醇组成的混合液，具体为由体积比为995∶5的正己烷和异丙醇组成的混合液；所述流动相的流动方式为匀速流动；
流速均为1.0～2.0mL/min，具体为1.5mL/min；
柱温为25～35℃，具体为30℃；
检测波长均为250～270nm，具体为265nm；
保留时间均为10-30min，具体为20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，待测维生素D滴剂与正己烷的用量比为720mg：20mL。
4.据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述维生素D为维生素D3。
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