CN115308338A - 一种维生素d3滴剂中维生素d3有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，属于化学检测技术领域，本发明方法：将维生素D3滴剂内容物与无水乙醇通过震摇低温超声充分混合，得到溶液需低温放置离心提取上清液；上清液加水和正己烷充分混合萃取；将所述正己烷萃取溶液进行SPE净化处理，得到维生素D3及其杂质洗脱液，经过高效液相色谱进行维生素D3有关物质分析。本发明利用维生素D3及其相关杂质与植物油在乙醇中溶解度差别进行提取，再通过加水降低维生素D3及相关杂质的溶解度用正己烷萃取，将含有维生素D3及其相关杂质萃取液经过SPE固相萃取柱进一步净化处理去除无关干扰，并浓缩维生素D3及其有关杂质。经过高效液相色谱法分析。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种维生素D3滴剂(软胶囊)中维生素D3有关物质的前处理及检测方法。
背景技术
维生素D3是一类脂溶性维生素，能作用钙、磷代谢的激素前体，促进机体对钙的吸收。维生素D滴剂是一种用于儿童佝偻病的预防和治疗的药物。经过大量循证医学研究和基础研究发现，维生素D3滴剂对癌症、高血压、糖尿病、结核病、免疫功能异常的治疗具有一定的疗效。我国目前市面上的维生素D3滴剂(软胶囊)多为400IU，800IU。滴剂/软胶囊均制成油溶性的内容物，维生素D3溶于植物油，直接进行有关物质测定，植物油的干扰严重。现有的从维生素D3油中提取维生素D3的方法多为碱性条件皂化后提取测定，但是提取步骤较多，皂化加热会影响有关物质检测的结果的准确性。由于维生素D3对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成多种产物，其中前维生素D3为有效成分。原维生素、反式维生素D3、光甾醇、异速甾醇和速甾醇为维生素D3主要降解杂质。现有专利CN109490435A公开的一种检测复方碳酸钙咀嚼片中维生素D3杂质的方法，现有专利CN111239272A公开的一种检测含维生素D3的制剂中有关杂质的方法适用范围都是检测复方碳酸钙咀嚼片中维生素D3杂质的方法，目前还未有维生素D3滴剂(软胶囊)中维生素D3有关物质的报道。
发明内容
本发明提供了一种维生素D3滴剂(软胶囊)的维生素D3有关物质的前处理及检测方法。本发明提供的前处理方法能够高效提取待测物中维生素D3及其相关杂质，确保了待测物中的维生素D3及其相关杂质提取完全，以保证有关物质检测结果的准确性。
本发明的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，是按照以下步骤进行的：
将维生素D3滴剂内容物与无水乙醇通过震摇低温超声充分混合，得到溶液低温放置后，离心提取上清液；上清液加水和正己烷充分混合萃取；将所述正己烷萃取溶液进行SPE净化处理，得到维生素D3及其杂质洗脱液，经过高效液相色谱进行维生素D3有关物质分析。
进一步地，所述维生素D3滴剂内容物与无水乙醇震摇时间为2～3min。
进一步地，所述低温超声温度为4～8℃，低温超声时间10分钟功率100Hz。
进一步地，所述溶液低温放置为：将溶液在-18～-22℃温度下放置1h。
进一步地，所述离心提取的条件为离心转数为2000rpm，离心时间5min。
进一步地，所述上清液、水和正己烷的体积比为2:1:1。
进一步地，所述上清液加水和正己烷充分混合萃取中需充分震摇2～3min静止分层后吸取正己烷上清液。
进一步地，所述正己烷萃取液进行SPE净化处理，SPE固相萃取柱为硅胶柱，淋洗条件为正己烷：乙酸乙酯体积比为9:1，洗脱条件乙酸乙酯。
进一步地，所述液相色谱检测条件包括：色谱柱填充剂为硅胶柱，柱温为25～35℃；以正己烷和环己烷混合异丙醇为流动相，正己烷：环己烷：异丙醇的体积比为59.3：40：0.7；流速为1.0mL/min；检测波长为265nm。
进一步地，经SPE净化洗脱液经过氮气吹干正己烷复溶为待测液；将所述待测液注入液相色谱仪，得到待测液液相色谱图；将维生素D3杂质对照品溶液注入液相色谱仪，得到杂质对照品液相色谱图；按照外标法计算待测物中维生素D3有关物质。
本发明利用维生素D3及其相关杂质与植物油在乙醇中溶解度差别进行提取，再通过加水降低维生素D3及相关杂质的溶解度用正己烷萃取，将含有维生素D3及其相关杂质萃取液经过SPE固相萃取柱进一步净化处理去除无关干扰，并浓缩维生素D3及其有关杂质。经过高效液相色谱法分析，从而建立待测物中维生素D3有关物质的方法。
附图说明
图1为实施例1的维生素D3滴剂(软胶囊)空白丸及样品经过处理液相色谱谱图；
图2为杂质对照品和维生素D3混标液相色谱谱图；
图3为单个杂质对照品重叠峰时间定位液相色谱谱图；
图4为实施例2破坏实验高温条件液相色谱谱图；
图5为实施例2破坏实验光照条件液相色谱谱图；
图6为实施例2破坏实验碱破坏条件液相色谱谱图；
图7为实施例2破坏实验酸破坏条件液相色谱谱图；
图8为实施例2破坏实验氧化条件液相色谱谱图；
图9为实施例2破坏实验酸破坏条件液相色谱谱图；
图10为实施例2破坏实验氧化条件液相色谱谱图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
1、仪器与试药
高效液相仪(Agilent)；8W紫外灯；干燥鼓风箱；纯化水；正己烷、环己烷为色谱纯；其他试剂均为分析纯。维生素D3标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100061-201208，99.8％)；维生素D滴剂(软胶囊型)(400IU，批号22062901/22070101/22070501)；维生素D滴剂(软胶囊型)(国内厂家，400IU，批号129214011/2102282/20201002)；
2、方法与结果
1)对照品及杂质储备液制备
将维生素D3及杂质A，B，C，D，E分别取5mg加入100ml棕色容量瓶用正己烷定容混匀，作为维生素D3及杂质对照品储备液。
2)系统适用性溶液
取维生素D3对照品储备液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°并距灯管5～6cm，照射5分钟，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3。
3)样品溶液制备
在暗室中称量4g维生素D3滴剂(软胶囊)内容物样品至50ml离心管中，加入无水乙醇25ml，充分混匀震摇2min，4～8℃低温超声10分钟超声功率100Hz，-20℃低温放置1小时，2000rpm离心5分钟，取上清液20ml。上清液加水10ml，正己烷10ml，剧烈震摇2min，静止分层后萃取正己烷上层液。将正己烷萃取溶液加入固相萃取柱中，弃去流出液；取10mL淋洗液(正己烷：乙酸乙酯＝9:1)淋洗，弃去流出液；抽干小柱；取5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，(整个上样、洗脱过程控制流速在1mL/min内)经过氮气吹干2ml正己烷复溶，0.22um过滤，注入高效液相色谱进行维生素D3有关物质分析。
4)空白辅料溶液制备
在暗室中称量4g维生素D3滴剂(软胶囊空白丸)内容物样品至50ml离心管中，加入无水乙醇25ml，充分混匀震摇2min，4～8℃低温超声10分钟超声功率100Hz，-20℃低温放置1小时，2000rpm离心5分钟，取上清液20ml。上清液加水10ml，正己烷10ml，剧烈震摇2min，静止分层后萃取正己烷上层液。将正己烷萃取溶液加入固相萃取柱中，弃去流出液；取10mL淋洗液(正己烷：乙酸乙酯＝9:1)淋洗，弃去流出液；抽干小柱；取5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，(整个上样、洗脱过程控制流速在1mL/min内)经过氮气吹干2ml正己烷复溶，0.22um过滤，注入高效液相色谱记录空白丸色谱图。
5)混合对照品溶液制备
分别精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、维生素D3的对照品贮备液各10mL，置于同一个100mL量瓶，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液，该混合对照品贮备液杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的含量均为5μg/mL。
所用色谱柱的固定相为硅胶，硅胶的粒径为1.8μm；柱高为100mm，内径为3mm；
进样量均为10μL；
流动相为由正己烷：环己烷：异丙醇的体积比为59.3：40：0.7混合液；
流速均为1mL/min；
柱温为30℃；
检测波长为265nm；
保留时间为50min；
VWD检测器；理论塔板数按维生素D3峰计算应不低于5000。
HPLC检测完毕记录维生素D3及每个杂质对照品的峰面积，以浓度为自变量，以其对应的峰面积为因变量，外标法计算维生素D3有关物质(如图1)。
6)结果分析：
将混合对照品贮备液注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，如图6所示，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E对维生素D3峰的相对保留时间分别约为0.56、1.60、0.70、0.89、1.11。
将系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，如图7所示。前维生素D3峰(与维生素D3相对保留时间约为0.5)与反式维生素D3峰(与维生素D3相对保留时间约为0.6)以及维生素D3峰与速甾醇D3峰(与维生素D3相对保留时间约为1.1)的分离度均应大于1.0。
将供试品溶液，空白辅料溶液注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，如图7所示。
实施例2
取维生素D 3滴剂(软胶囊)样品按以下方法进行高温、光照、酸、碱和氧化破坏性实验，用实施例1的色谱条件检查降解产物。
1)高温样品溶液配制
取维生素D 3滴剂(软胶囊)样品20粒，在90℃加热1h，取内容物。
2)光降解样品溶液的配制
取维生素D 3滴剂(软胶囊)样品20粒，光照24h，取内容物。
3)碱降解样品溶液的配制
取取维生素D 3滴剂(软胶囊)样品20粒，取内容物，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液5mL，加0.5mol/L盐酸溶液5mL中和。
4)酸降解样品溶液的配制
取取维生素D 3滴剂(软胶囊)样品20粒，取内容物，加0.5mol/L盐酸溶液5mL加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液5mL中和。
5)氧化样品溶液的配制
取维生素D3滴剂(软胶囊)样品20粒，取内容物，加入5％双氧水10mL，室温放置24h，
6)结果分析
如图3至10所示，空白辅料溶液在各杂质对照品的出峰位置处没有干扰，进行酸、碱、氧化、高温、光照降解试验，各个条件下的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、与相邻峰的分离度大于1.0，主峰(维生素D3)的峰纯度角大于纯度阈值，表明本发明方法能够使维生素D3滴剂(软胶囊)在酸、碱、氧化、高温、光照条件下降解的各杂质峰均可有效分离。
实施例3重复性试验
取维生素D 3滴剂(软胶囊)6份，按照实施例1的方法分别配制系统适用性溶液、混合杂质对照品溶液、空白溶液和样品溶液，分别注入液相色谱仪，按照实施例1提供的色谱条件进行测定，结果表明，6份样品的杂质A杂质结果的RSD％为1.5％，杂质B杂质结果的RSD％为2.6％，杂质C杂质结果的RSD％为0％，杂质D杂质结果的RSD％为1.8％，杂质E杂质结果的RSD％为0％，可见，本发明检测方法重复性好。
本发明的方法只用于含油性基质的维生素D3滴剂(软胶囊)的杂质检测，并不仅限用于其他杂质检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于是按照以下步骤进行的：
将维生素D3滴剂内容物与无水乙醇通过震摇低温超声充分混合，得到溶液低温放置后，离心提取上清液；上清液加水和正己烷充分混合萃取；将所述正己烷萃取溶液进行SPE净化处理，得到维生素D3及其杂质洗脱液，经过高效液相色谱进行维生素D3有关物质分析。
2.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述维生素D3滴剂内容物与无水乙醇震摇时间为2～3min。
3.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述低温超声温度为4～8℃，低温超声时间10分钟功率100Hz。
4.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述溶液低温放置为：将溶液在-18～-22℃温度下放置1h。
5.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述离心提取的条件为离心转数为2000rpm，离心时间5min。
6.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述上清液、水和正己烷的体积比为2:1:1。
7.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述上清液加水和正己烷充分混合萃取中需充分震摇2～3min静止分层后吸取正己烷上清液。
8.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述正己烷萃取液进行SPE净化处理，SPE固相萃取柱为硅胶柱，淋洗条件为正己烷：乙酸乙酯体积比为9:1，洗脱条件乙酸乙酯。
9.根据权利要求1所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于所述液相色谱检测条件包括：色谱柱填充剂为硅胶柱，柱温为25～35℃；以正己烷和环己烷混合异丙醇为流动相，正己烷：环己烷：异丙醇的体积比为59.3：40：0.7；流速为1.0mL/min；检测波长为265nm。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的一种维生素D3滴剂中维生素D3有关物质的检测方法，其特征在于经SPE净化洗脱液经过氮气吹干正己烷复溶为待测液；将所述待测液注入液相色谱仪，得到待测液液相色谱图；将维生素D3杂质对照品溶液注入液相色谱仪，得到杂质对照品液相色谱图；按照外标法计算待测物中维生素D3有关物质。
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