CN110031573A - 二维柱切换高效液相色谱法测定维生素d含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法，其采用二次切换的正相色谱进行检测，可实现样品中前维生素D和维生素D的同时测定，且待测样品用正己烷溶解后可直接进行测定，避免了复杂的样品前处理步骤，其适用于植物油制剂中微量维生素D的准确检测。

Description

二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法。

背景技术

经查阅国内外五大药典，维生素D测定法只在CHP2015年版和USP41中有收载。而除了药典中收载的维生素D的含量测定方法，食品中也收载了两个测定方法。但比较现阶段的各个维生素D含量测定方法发现，在测定样品中微量维生素D含量的时候，均需要不同程度的前处理。特别是药品植物油制剂中维生素D的含量测定（即现行CHP2015年版中0722 维生素D测定法），整个实验过程繁琐复杂，需多次转移复溶，并且都是使用极少量的溶剂，这导致测定结果的准确性和重现性把握难度较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用二维柱切换高效液相色谱法测定植物油制剂中微量维生素D含量的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法，其包括如下步骤：

1）对照品溶液的配制：在避光条件下，取维生素D₃对照品约25mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入异辛烷80ml，超声处理（避免加热）1分钟使其完全溶解，然后用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，0℃以下保存，作为对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₁对照品溶液；另精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液A；精密量取校正因子f₂对照品溶液A 2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液B；

2）样品溶液的配制：精密称取供试样品适量，置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；

3）色谱检测：采用二维柱切换高效液相色谱法分别对校正因子f₁对照品溶液、校正因子f₂对照品溶液B及样品溶液进行检测；

4）计算：依据色谱检测结果，先按式a和b分别计算获得校正因子f₁和校正因子f₂，再利用所得样品溶液的前维生素D和维生素D峰面积，按式c计算样品中维生素D及前维生素D的总含量c_i；

f₁=c₁/A₁ 式a，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；A₁为校正因子f₁对照品溶液色谱图中维生素D的峰面积；

f₂=(c₁-f₁A₁`)/A₂ 式b，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；f₁为维生素D的校正因子；A₁`为校正因子f₂对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积；A₂为校正因子f₂对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积；

ci=f₁A_i1+f₂A_i2 式c，

式中，A_i1为样品溶液中维生素D峰的峰面积；A_i2为样品溶液中前维生素D峰的峰面积。

步骤2）中所取供试样品的量应相当于维生素D 150-700单位。

步骤3）中二维柱切换高效液相色谱的检测条件为：检测波长265nm，柱温40℃，流速0.5ml/min；收集管为聚醚醚酮（peek）管，内径0.0762厘米（0.03英寸），20米，容积约9ml；第一维液相色谱采用脲基键合硅胶色谱柱，其规格为150mm×2.1mm，3μm；以正己烷为流动相A、以正己烷-正戊醇-异丙醇按体积比98:1:1混合作为流动相B进行梯度洗脱，其洗脱程序为：0-30min，流动相B的体积保持在5%，30-35min，流动相B的体积由5%升至100%，35-60min，流动相B的体积保持在100%，60-65min，流动相B的体积由100%降至5%，并保持至80min；

第二维液相色谱采用Agilent Zorbax RX-SIL硅胶色谱柱，其规格为100mm×3mm，1.8μm；以正己烷-正戊醇-异丙醇按体积比996:2:2混合作为流动相洗脱80min。

其中切换程序为：第一维液相色谱中前维生素D主峰的保留时间为16-18min，维生素D主峰的保留时间为24-26min，第一维液相色谱中前维生素D的切换时间设为其保留时间的前后各1.5min；第一维液相色谱中维生素D的切换时间设为维生素D出峰开始时间前和出峰完毕时间后各1.5min。

本发明的有益效果在于：

与现有技术采用一次切换反相色谱测定维生素D不同，本发明通过使用二次切换的正相色谱，可实现样品中前维生素D和维生素D的同时测定（这两个成分在药品中均属于有效成分）。同时，与现有技术需将样品进行复杂前处理不同，本发明将样品用正己烷溶解后可直接进行测定，有效简化了样品的前处理过程，可大幅减少人工操作，缩短实验时间，降低人为误差，并大幅提高检验结果的准确性和重现性。

本发明第一维色谱系统能实现前维生素D、维生素D与杂质较好的分离，切换时根据前维生素D和前维生素D的保留时间分段截取，在柱切换后，在第二维色谱系统中也无杂质干扰，能实现准确测定。

附图说明

图1为本发明所用二维柱切换系统流程图。

图2为校正因子f₁对照品溶液的第一维液相色谱图。

图3为校正因子f₁对照品溶液的第二维液相色谱图。

图4为校正因子f₂对照品溶液B的第一维液相色谱图。

图5为校正因子f₂对照品溶液B的第二维液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

一、仪器与试药

（1）材料与试剂

维生素D滴剂、维生素AD滴剂、鱼肝油（样品为市售）；正己烷、异丙醇、异辛烷（色谱纯，德国默克）；正戊醇（高级纯，阿拉丁）；维生素D₃对照品（批号：100061-201208，中国食品药品检验研究院提供，纯度99.8%）。

（2）仪器

双三元高效液相色谱仪（ThermoFisher U3000 DGLC），配双三元色谱泵，DAD检测器，紫外检测器，柱温箱（配有2个位置十通阀、9ml收集管）；十万分之一分析天平（Mettler-Toledo，XS205）。

二、方法与结果

（1）对照品溶液的制备

精密称取维生素D₃对照品约25mg，置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，超声处理1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，精密量取对照品贮备溶液2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₁对照品溶液。

另精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液A。精密量取对照品贮备溶液2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液B。

（2）供试品溶液的制备

精密称取供试品适量（相当于维生素D 500单位），置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

（3）色谱条件与系统适用性试验

检测波长265nm，柱温40℃，流速为每分钟0.5ml，收集管为聚醚醚酮（peek）管，内径0.0762厘米（0.03英寸），20米，容积约9ml。

第一维液相色谱：Thermo Acclaim HILIC-10色谱柱（150mm×2.1mm，3μm）；以正己烷为流动相A，以正己烷-正戊醇-异丙醇（98:1:1，v/v/v）为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱；

表1 梯度洗脱程序

第二维液相色谱：Agilent Zorbax RX-SIL硅胶色谱柱（100mm×3mm，1.8μm）；以正己烷-正戊醇-异丙醇（996:2:2）为流动相。

取校正因子f₂对照品溶液B 100μl注入第一维液相色谱仪，对前维生素D峰和维生素D峰进行定位。调节第一维液相色谱流动相A和流动相B的初始比例使前维生素D主峰的保留时间约16-18分钟，维生素D主峰的保留时间约24-26分钟，第一维液相色谱中前维生素D切换时间设为保留时间的前后各约1.5分钟；第一维液相色谱中维生素D切换时间设为维生素D出峰开始时间前和出峰完毕时间后各约1.5分钟；取校正因子f₂对照品溶液A和供试品溶液各5ml混匀，作为系统适用性溶液。结果见表2。

表2 系统适用性实验结果

由表2可见，第一维液相色谱系统中前维生素D峰与维生素D的分离度均不小于5，理论板数按维生素D峰计算均不低于2300；第二维液相色谱系统中维生素D峰与相邻峰的分离度以及前D峰和相邻峰的分离度均符合规定。

同时，依据色谱检测结果，先按式a和b分别计算获得校正因子f₁和校正因子f₂，再利用所得样品溶液的前维生素D和维生素D峰面积，按式c计算样品中维生素D及前维生素D的总含量c_i；

f₁=c₁/A₁ 式a，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；A₁为校正因子f₁对照品溶液色谱图中维生素D的峰面积；

f₂=(c₁-f₁A₁`)/A₂ 式b，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；f₁为维生素D的校正因子；A₁`为校正因子f₂对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积；A₂为校正因子f₂对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积；

ci=f₁A_i1+f₂A_i2 式c，

式中，A_i1为样品溶液中维生素D峰的峰面积；A_i2为样品溶液中前维生素D峰的峰面积。

三、线性关系考察

取维生素D₃对照品25.25 mg，置100ml量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液1ml、3ml、5ml、7ml、9ml，至25ml容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述溶液100μl，按上述选定的条件进样。

以维生素D₃峰面积Y为纵坐标，以浓度X（μg/ml）为横坐标，进行线性回归。所得维生素D₃回归方程分别为：y = 9.2279x+0.0301，r值为0.9997。结果说明维生素D₃在0.1008μg/ml～0.9072μg/ml范围内呈良好的线性关系。

四、重复性试验

取样品（维生素D滴剂，批号12981032；维生素AD滴剂，批号11482007；鱼肝油，批号20770405）6份，依法测定，结果见表3。

表3 重复性实验结果

由表3可见，该方法重复性良好。

五、回收率试验

（1）维生素D滴剂回收率

取维生素D₃对照品25.25mg，置100ml量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml、5ml、6ml各三份，分别置25ml量瓶中，另取除维生素D₃外维生素D滴剂的所有辅料适量，共9份，分别置同一25ml量瓶中，制成浓度80%、100%、120%的模拟溶液各三份，依法测定计算回收率，结果见表4。

表4 维生素D滴剂维生素D₃含量测定回收率实验结果

由表4可见，维生素D滴剂的平均回收率为100.5%（RSD＝0.78％，n＝9），表明回收率良好。

（2）维生素AD滴剂回收率

取维生素D₃对照品25.34mg，置100ml量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml、5ml、6ml各三份，分别置25ml量瓶中，另取除维生素D₃外维生素AD滴剂的所有原辅料适量，共9份，分别置同一25ml量瓶中，制成浓度80%、100%、120%的模拟溶液各三份，依法测定计算回收率，结果见表5。

表5 维生素AD滴剂维生素D₃含量测定回收率实验结果

由表5可见，维生素AD滴剂的平均回收率为100.7%（RSD＝1.59％，n＝9），表明回收率良好。

（3）鱼肝油回收率

取维生素D₃对照品24.95mg，置100ml量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml、5ml、6ml各三份分别置25ml量瓶中，另取除维生素D₃外鱼肝油的所有原辅料适量，共9份，分别置同一25ml量瓶中，制成浓度80%、100%、120%的模拟溶液各三份，依法测定计算回收率，结果见表6。

表6 鱼肝油维生素D₃含量测定回收率实验结果

由表6可见，鱼肝油的平均回收率为99.5%，（RSD＝0.86％，n＝9），表明回收率良好。

六、稳定性试验

供试品溶液室温放置，在第0、2、4、6、8、10、12、18、24h进行测定并计算维生素D含量，结果见表7。

表7 供试品溶液稳定性试验测定结果

由表7可见，维生素D滴剂、维生素AD滴剂和鱼肝油维生素D₃含量平均值分别为103.6%、100.9%、103.2%，RSD分别为0.7%、0.7%、0.5%，表明样品在24h内稳定性较好。

七、样品测定：

取不同批次维生素D滴剂、维生素AD滴剂和鱼肝油样品依法进行测定，结果见表8～10。

表8 样品维生素D滴剂维生素D₃含量测定结果

表9 样品维生素AD滴剂维生素D₃含量测定结果

表10 样品鱼肝油维生素D₃含量测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）对照品溶液的配制：在避光条件下，精密称取维生素D₃对照品25mg，置100ml棕色量瓶中，加入异辛烷80ml，超声处理1分钟使其完全溶解，然后用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，0℃以下保存，作为对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₁对照品溶液；另精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液A；精密量取校正因子f₂对照品溶液A 2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f₂对照品溶液B；

2）样品溶液的配制：精密称取供试样品适量，置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；

3）色谱检测：采用二维柱切换高效液相色谱法分别对校正因子f₁对照品溶液、校正因子f₂对照品溶液B及样品溶液进行检测；

4）计算：依据色谱检测结果，先按式a和b分别计算获得校正因子f₁和校正因子f₂，再利用所得样品溶液的前维生素D和维生素D峰面积，按式c计算样品中维生素D及前维生素D的总含量c_i；

f₁=c₁/A₁ 式a，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；A₁为校正因子f₁对照品溶液色谱图中维生素D的峰面积；

f₂=(c₁-f₁A₁`)/A₂ 式b，

式中，c₁为校正因子f₁对照品溶液的浓度，μg/ml；f₁为维生素D的校正因子；A₁`为校正因子f₂对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积；A₂为校正因子f₂对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积；

ci=f₁A_i1+f₂A_i2 式c，

式中，A_i1为样品溶液中维生素D峰的峰面积；A_i2为样品溶液中前维生素D峰的峰面积。

2. 根据权利要求1所述的二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法，其特征在于：步骤2）中所取供试样品的量应相当于维生素D 150-700单位。

3.根据权利要求1所述的二维柱切换高效液相色谱法测定维生素D含量的方法，其特征在于：步骤3）中二维柱切换高效液相色谱的检测条件为：检测波长265nm，柱温40℃，流速0.5ml/min；收集管为聚醚醚酮管，内径0.0762厘米，20米，容积9ml；第一维液相色谱采用脲基键合硅胶色谱柱，其规格为150mm×2.1mm，3μm；以正己烷为流动相A、以正己烷-正戊醇-异丙醇按体积比98:1:1混合作为流动相B进行梯度洗脱，其洗脱程序为：0-30min，流动相B的体积保持在5%，30-35min，流动相B的体积由5%升至100%，35-60min，流动相B的体积保持在100%，60-65min，流动相B的体积由100%降至5%，并保持至80min；

第二维液相色谱采用Agilent Zorbax RX-SIL硅胶色谱柱，其规格为100mm×3mm，1.8μm；以正己烷-正戊醇-异丙醇按体积比996:2:2混合作为流动相洗脱80min；

其中切换程序为：第一维液相色谱中前维生素D主峰的保留时间为16-18min，维生素D主峰的保留时间为24-26min，第一维液相色谱中前维生素D的切换时间设为其保留时间的前后各1.5min；第一维液相色谱中维生素D的切换时间设为维生素D出峰开始时间前和出峰完毕时间后各1.5min。