CN113917020A - 一种同时测定七制香附丸中4种活性成分含量的gc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定七制香附丸中4种活性成分含量的GC方法，所述方法测定的4种活性成分分别为：石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α‑香附酮，其测定步骤如下：(1)供试品溶液的制备；(2)色谱条件：色谱柱为Αgilent HP‑5，柱温采用程序升温：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min的速度升至150℃，再以3.0℃/min的速度升至210℃，最后以30℃/min的速度升至250℃，保持10min，FID检测器温度为280℃，载气为氮气，柱流量为1.0mL/min，进样量为1μL，分流比为5:1；(3)4种活性成分含量测定标准曲线的建立；(4)样品中活性成分含量的测定。本发明操作简便，准确、快速、高效，能同时测定七制香附丸中4种活性成分的含量，具有较大的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂质量控制技术领域，涉及同时测定七制香附丸中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮4种活性成分。
背景技术
七制香附丸收载于《中国药典》(2020年版)一部，全方由醋香附、地黄、茯苓、当归、熟地黄、川芎、炒白术、白芍等22味药材组成，具有舒肝理气、养血调经的功效，用于气滞血虚所致的痛经、月经量少、闭经，症见胸胁胀痛、经行量少、行经小腹胀痛、经前双乳胀痛、经水数月不行，是女性的常用药物之一。七制香附丸含有多种有效成分，主要包括挥发油类、黄酮类、生物碱类及糖类等。α-香附酮、香附烯酮和石竹素是方中君药香附挥发油中的主要活性成分，具有解热镇痛、抗痛经的作用；篙本内酯是方中臣药当归和川芎挥发油中的主要活性成分之一，具有抗镇痛、抗炎以及抑制子宫平滑肌收缩等功效。挥发油类是七制香附丸发挥药理活性的主要成分之一，所以对其含量进行控制具有重要意义。
关于七制香附丸的质量控制，我国2020版药典中，含量测定项仅采用液相色谱法(HPLC)对臣药白芍中芍药苷的含量作为有效成分质量控制指标，中药复方制剂有效成分众多，各成分之间相互协调、相互制约，单一成分难以全面评价七制香附丸的整体质量。目前，只有少量文献报道了采用HPLC法对七制香附丸中有效成分进行含量测定的研究，还未见采用气相色谱法(GC)测定七制香附丸中挥发性成分含量的质量控制研究。挥发油类是七制香附丸发挥药理活性的主要成分之一，因此，为了更好的控制和评价七制香附丸的质量，保证药品的安全性、有效性，有必要进行七制香附丸中挥发性成分的质量控制研究。本发明采用GC法同时测定七制香附丸中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮4种有效成分的含量，该方法具有操作简便、结果准确和灵敏度高的优点，可以弥补七制香附丸挥发性成分质量控制的缺陷，为七制香附丸的质量控制提供参考。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种灵敏度高、专属性强的同时测定七制香附丸提取物中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮含量的GC方法。
为了实现本发明目的，提供了一种同时测定七制香附丸中4种活性成分含量的GC方法，包括以下步骤：
内标溶液的制备：精密称取正十八烷对照品适量，加甲醇溶解，制得内标溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮对照品适量，加甲醇溶解，制得含有石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮的混合对照品储备液。
样品溶液的制备：取七制香附丸，研细，加甲醇，称重，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，静置，滤过，将滤液过0.22μm有机相微孔滤膜，续滤液加内标溶液，再加甲醇定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液。
采用气相色谱法进行测定，该气相色谱法的色谱条件如下：色谱柱为ΑgilentHP-5(30.0m×0.25mm×0.25μm)，柱温采用程序升温：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min的速度升至150℃，再以3.0℃/min的速度升至210℃，最后以30℃/min的速度升至250℃，保持10min，分流比为5:1，进样口温度为为280℃，FID检测器温度为280℃，载气为氮气，柱流量为1.0mL/min，进样量为1μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明首次应用气相色谱检测法，同时测定七制香附丸中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮4种挥发性活性成分的含量。
2.本发明操作简便，准确度高，分离快速，4种活性成分的理论塔板数均大于3000，分离度均大于1.5，4种活性成分在各自浓度范围内线性良好，相关系数r＞0.9990，回收率在99.04％～101.12％之间。
3.能准确、快速的测定七制香附丸中4种活性成分的含量，可以弥补七制香附丸挥发性成分质量控制的缺陷，为七制香附丸质量控制奠定一定的基础。
附图说明
图1为本发明实施例中混合对照品溶液色谱图(1.石竹素，2.香附烯酮，3.蒿本内酯，4.α-香附酮，5.正十八烷)。
图2为本发明实施例中七制香附丸提取物色谱图(1.石竹素，2.香附烯酮，3.蒿本内酯，4.α-香附酮，5.正十八烷)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
＜实施例＞
1仪器与试剂
Shimαdzu 2010型气相色谱仪(日本岛津公司)；SQP型十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；LS220Α型万分之一电子分析天平(普利赛斯有限公司)；KQ-2200B型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限责任公司)。
七制香附丸(批号分别为200102、201001、200501、200302、200301、200101、191103、191101、191004、190703、190702、190701，依次标记为S1-S12，河南省宛西制药股份有限公司)；正十八烷(山东西亚化学股份有限公司)；α-香附酮(中国食品药品检定研究院)；香附烯酮(上海源叶生物科技有限公司)；石竹素、蒿本内酯(四川省维克奇生物科技有限公司)；甲醇(重庆川东化工集团有限公司)。
2方法与结果
2.1内标溶液的制备
取正十八烷，精密称定73.01mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇制成1.4602mg/mL的内标溶液。
2.2对照品溶液的制备
精密称取石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1mL含石竹257.60μg、香附烯酮1803.52μg、蒿本内酯13188.00μg、α-香附酮579.60μg的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液0.5mL，置5mL量瓶中，精密加入内标溶液0.3mL，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL含石竹素25.76μg、香附烯酮180.35μg、蒿本内酯1318.80μg、α-香附酮57.96μg的混合对照品溶液，存放于4℃冰箱，备用。
2.3样品溶液的制备
分别取七制香附丸样品，研细，取药品5.0g，精密称定，置50mL锥形瓶中，加入甲醇10mL，混匀，称量，超声(频率40Hz，功率100W)处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，静置，滤过，过0.22μm有机相微孔滤膜，取2.5mL滤液置于5mL量瓶中，精密加入内标溶液0.3mL，加甲醇定容，摇匀，即得。
2.4气相色谱测定条件
色谱柱为Αgilent HP-5(30.0m×0.25mm×0.25μm)，柱温采用程序升温：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min的速度升至150℃，再以3.0℃/min的速度升至210℃，最后以30℃/min的速度升至250℃，保持10min；FID检测器温度：280℃；载气为氮气，柱流量为1.0mL/min；进样量为1μL，分流比为5:1。
2.5系统适用性试验及专属性试验
在该色谱条件下，取空白溶液、混合对照品溶液和样品溶液进样测定，在空白溶剂的色谱图中，在待测物的保留时间处，未见峰，表明此方法具有良好的专属性。石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮的理论塔板数均大于3000，分离度均大于1.5，符合分析要求。
2.6线性关系考察
精密量取混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置5mL量瓶中，精密加入内标溶液0.3mL，加甲醇定容，得到不同浓度的混合对照品溶液，按色谱条件分别进样测定。以4种活性成分对照品溶液的浓度X(μg/mL)为横坐标，对照品与内标峰面积之比Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。
表1 4种活性成分的线性回归方程、相关系数及线性范围
2.7精密度试验
取混合对照品溶液，按色谱条件连续进样6次，分别计算各成分峰面积与内标峰面积之比，结果石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮峰面积比值的RSD分别为1.31％、1.71％、1.56％、1.16％，表明仪器的精密度良好。
2.8稳定性试验
取七制香附丸样品溶液，室温下放置0，2，4，6，8，12，24小时，按色谱条件分别进样测定，计算样品中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮峰面积与内标峰面积比值。结果石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮峰面积比值的RSD分别为2.22％、1.91％、0.90％、1.66％，表明样品溶液在室温下24小时基本稳定，符合分析试验要求。
2.9重复性试验
按样品溶液制备方法平行配制6份，按色谱条件进样分析，结果石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮与内标峰面积比值的RSD分别为2.72％、2.58％、2.58％、2.00％，表明该方法的重复性良好。
2.10回收率试验
称取已知含量的七制香附丸粉末约2.5g，精密称定，共9份，精密加入各成分对照品溶液，加入量为七制香附丸粉末中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮含量约80％、100％、120％，按供试品溶液制备方法制备，按色谱条件分析测定，记录峰面积，石竹素、香附烯酮、蒿本内酯、α-香附酮的平均回收率分别为99.04％、100.23％、101.12％、99.56％，RSD分别为1.78％，0.92％，1.13％，1.02％，结果表明该方法具有良好的准确性和可靠性。
2.11含量测定
取12个不同批次七制香附丸样品溶液，按色谱条件进样分析，按内标法计算待测成分的含量，结果石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮的平均含量(mg/g)见表2。
表2 12个不同批次七制香附丸中活性成分含量测定结果(mg/g)(n＝3)
3讨论
3.1样品提取方法的选择
采用水蒸气蒸馏法、超声提取法提取七制香附丸，结果显示超声提取法效果较好。再单因素考察提取溶剂(甲醇、乙醇、水)和提取时间(30、45、60min)，以4种成分的含量为评价指标，最终确定了甲醇作为提取溶剂，超声提取30min作为样品前处理方法，此条件下各成分提取较完全，提取效率较高。
3.2内标参照峰的选择
正十八烷在气相色谱法测定中常作为内标参照峰，其性质稳定且易获得，对待测成分峰无干扰，因此，选择正十八烷为内标参照峰。
3.3气相色谱条件程序升温的优化
本品为中药复方制剂，成分复杂，根据文献资料，采用程序升温试验效果较好，故本试验采用的程序升温为：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min的速度升至150℃，再以3.0℃/min的速度升至210℃，最后以30℃/min的速度升至250℃，保持10min。在此条件下，石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮4种成分的色谱峰均达到基线分离，峰形对称，分离度均大于1.5，理论塔板数不小于3000，符合分析要求。
由以上实例可以看出，本发明实施例对七制香附丸中石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮的含量进行了检测，该方法具有操作简便、结果准确和灵敏度高的优点，可以弥补七制香附丸挥发性成分质量控制的缺陷，可更全面、更准确的用于七制香附丸的质量控制，从而确保七制香附丸的安全性和有效性。
Claims (1)
1.一种同时测定七制香附丸中4种活性成分含量的GC方法，同时测定的4种活性成分分别为石竹素、香附烯酮、蒿本内酯和α-香附酮，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)样品提取
取七制香附丸，研细，加甲醇，称重，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，静置，滤过，将滤液过0.22μm有机相微孔滤膜，续滤液加内标溶液(正十八烷)，再加甲醇定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液，保存备用；
(2)气相分离
色谱柱为：Αgilent HP-5(30.0m×0.25mm×0.25μm)；
柱温采用程序升温：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min的速度升至150℃，再以3.0℃/min的速度升至210℃，最后以30℃/min的速度升至250℃，保持10min；
分流比为5:1；
进样口温度为280℃；
FID检测器温度为280℃；
载气为氮气，柱流量为1.0mL/min；
进样量为1μL；
(3)样品中各活性成分的含量测定
以待测物与内标物质的峰面积之比，采用内标法定量。
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