CN105301123A - 一种良附类制剂的hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种良附类制剂的HPLC检测方法，它是同时测定良附类制剂中高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮5种成分含量的HPLC方法，包括以下步骤：(1)高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮标准曲线的建立：(2)待测样品中的高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮含量测定。本发明的HPLC检测方法，可以同时测定良附类制剂中的多种成分。该方法专属性强、信息反映全面，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控良附类制剂的质量，提高了药物的安全性。

Description

一种良附类制剂的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及药物质量控制方法技术领域，具体涉及一种良附类制剂的质量检测方法。

背景技术

良附丸首载于清·谢元庆之《良方集腋》，是由高良姜、醋香附两味中药等份、粉碎、混合而制成的水泛丸，为治疗寒凝气滞胃脘疼痛的代表制剂，在中医临床应用已有近千年的历史。作为典型的中药复方传统制剂，良附丸药味组成固定，制备工艺简单，临床疗效显著，极具开发的潜力。

作为一种中药复方制剂，良附丸具有多成分、多靶点、多层次、整体作用的特点，但中国药典2010年版一部中仅测定了α-香附酮的含量，对于良附丸中的其他成分并没有进行检测。

因此，目前需要一种能全面反映良附类制剂质量的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种良附类制剂的HPLC检测方法，它是同时测定良附类制剂中高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮5种成分含量的HPLC方法，包括以下步骤：

(1)高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮标准曲线的建立：

a、对照品溶液的制备：

取高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；

b、对照品溶液的测定：

取不同进样量的混合对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，测定各色谱峰峰面积，得到高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的标准曲线；

色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料；

检测波长：242nm；

流动相：甲醇-0.2％磷酸水溶液；

梯度洗脱程序：

(2)待测样品中的高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮含量测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测良附类制剂或其粉末，加入提取溶媒，称定重量，超声或回流提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的质量，过滤，取滤液作为供试品溶液；所述提取溶媒选自乙醇或50％-100％甲醇，优选100％甲醇；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的含量。

进一步优选地，步骤a中，所述对照品溶液中，每1mL溶液含高良姜素0.254mg、山柰素0.032mg、香附烯酮0.051mg、圆柚酮0.005mg和α-香附酮0.021mg。更进一步优选地，步骤b中，所述不同进样量的混合对照品溶液分别为2、4、6、8、10μL。

进一步优选地，所述步骤c中，提取溶媒与良附类制剂或其粉末的体积重量比为25:1mL/g。

进一步优选地，所述色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。更进一步优选地，所述色谱柱为PhenomenexC18色谱柱

进一步优选地，所述色谱条件的柱温为30℃。

进一步优选地，所述色谱条件的体积流量为1.0mL/min。

进一步优选地，所述良附类制剂包括良附丸、良附滴丸或良附软胶囊。

本发明的HPLC检测方法，可以同时测定良附类制剂中的多种成分。该方法专属性强、信息反映全面，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控良附类制剂的质量，提高了药物的安全性。

发明人通过研究发现，α-香附酮、香附烯酮、圆柚酮均是醋香附的含量较高且药效显著的特征活性成分，可以作为醋香附的指标成分。

在高良姜中，其活性成分较多，包括原儿茶酸、槲皮素、山柰素(kaempferide)、山柰酚(kaempferol)、高良姜素(galangin)、姜黄素和大黄素等，通常，高良姜素是高良姜的特征性成分且其含量较高，可以作为高良姜的指标成分；发明人意外地发现，山柰素含量实际上远高于山柰酚，在特定条件下，以山柰素作为附加的指标成分来控制含有高良姜的制剂的质量显然更为合适。

但是，软件ChemBioDrawUltra(12.0版)分子模拟显示，高良姜素LogP(疏水常数)为1.13，山柰素LogP为1，两者极性相当，理论上极难通过HPLC将两者分离。因此，分离高良姜素和山柰素是发明人需要攻克的一大难点，需要反复试验来摸索出合适的色谱条件。在色谱条件的摸索过程中，需要使用正确的山柰素对照品。

已有文献报道(YOtake等，OxidationoftheflavonoidsgalanginandkaempferidebyhumanlivermicrosomesandCYP1A1,CYP1A2,andCYP2C9，DrugMetabolismandDisposition，30(2)：103-105)，高良姜素(galangin)、山柰素(kaempferide)和山柰酚(kaempferol)的结构式如下所示：

然而，发明人发现，中国食品药品检定研究院(即原中国药品生物制品检定所，简称中检所)将山柰(奈)素和山柰酚视为同一物质，其目前在售的两个批次标准品说明书分别如图1和图2所示。

截止目前，通过中检所官网显示的信息，中检所提供的“山柰素”依然是山柰酚kaempferol而非山柰素kaempferide。

在山柰素对照品不正确的情况下，现有技术对高良姜成分的分离测定就难免出现偏差，例如：

在《HPLC法测定高良姜中高良姜素和山柰素的含量》(李智勇等，中华中医药杂志，2010年9月第25卷第9期，第1368-1370页)和《RP-HPLC法同时测定高良姜中槲皮素等4种黄酮的含量》(刘原作等，沈阳药科大学学报，2014年1月第31卷第1期，第13-20页)中，“山柰素对照品”均来自于中检所，这个对照品实际上是山柰酚。因此，其测定的并非作者所认为的山柰素含量，而是山柰酚的含量，其实验结果显示，山柰酚含量极低。

发明人通过软件ChemBioDrawUltra(12.0版)模拟出山柰酚的LogP为0.74，其极性远大于相同软件模拟下的高良姜素(模拟LogP为1.13)。上述文献采用的均为反相色谱，在保留时间方面，理论上极性大的山柰酚应当远早于高良姜素出峰，而上述文献的色谱图正是符合上述理论的推导。

因此，上述文献的作者的确是将山柰酚误认为了山柰素，从另一方面看，山柰酚如此低的含量，的确也不适合在良附类制剂的质量控制体系中，作为指标成分。

本发明筛选到了正确的指标成分，同时采用了合适的色谱条件，不仅可以将高良姜素和山柰素完全分离开来，还进一步准确测定了高良姜素的含量，同时还将它们与醋香附中的指标成分：香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮一一分离，可以准确而全面的反映良附丸的整体质量，取得了良好的监测效果。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为中检所110861-201310批标准品说明书。

图2为中检所110861-201209批标准品说明书。

在下述附图中，1为高良姜素、2为山柰素、3为香附烯酮、4为圆柚酮、5为α-香附酮。

图3为实施例1参考文献条件下的山柰素HPLC图谱。

图4为实施例1参考文献条件下的高良姜素HPLC图谱。

图5为实施例1参考文献条件下将图3和图4统一在相同坐标轴下的HPLC图谱，上方的为山柰素，下方的为高良姜素。

图6为对照品溶液的HPLC图谱。

图7良附丸供试品溶液的HPLC图谱。

图8检测波长235nm下的HPLC图谱。

图9检测波长242nm下的HPLC图谱。

图10检测波长254nm下的HPLC图谱。

图11检测波长266nm下的HPLC图谱。

图12检测波长280nm下的HPLC图谱。

图13为条件1下的HPLC图谱。

图14为条件2下的HPLC图谱。

图15为条件3下的HPLC图谱。

图16为条件4下的HPLC图谱。

图17为条件5下的HPLC图谱。

图18为条件6下的HPLC图谱。

图19为条件7下的HPLC图谱。

图20为条件8下的HPLC图谱。

图21为条件9下的HPLC图谱。

具体实施方式

仪器与试药：

Agilent1200Series高效液相色谱仪(G1312B四元梯度泵、G1322A脱气机、G1316B柱温箱、G1329B自动进样器、G1315C二极管阵列紫外检测器)，赛多利斯Bp211DAG电子天平(德国Sartorius)，超声波清洗器KQ5200DB(昆山市超声仪器有限公司)。

高良姜素(中国药品生物制品检定所，批号111699-200501)、山柰素(C₁₆H₁₂O₆,CASNO:491-54-3,成都曼思特生物科技有限公司，批号must-12020812)，圆柚酮对照品(美国Sigma公司，批号10112423)，香附酮(江西本草天工科技有限责任公司，批号1443-080529)，香附烯酮(自制,纯度>98％)。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。良附丸购于北京同仁堂制药有限公司，批号分别：2083024、2083025、3088042、3082248、3083042、4082082、4082083、4082016。

实施例1本发明检测方法的预试验

由于高良姜素与山柰素极性相当，在预试验中，发明人尝试了包括已知文献在内的多种色谱条件，均难以将高良姜素与山柰素分离。例如：

参照文献《HPLC法测定高良姜中高良姜素和山柰素的含量》(李智勇等，中华中医药杂志，2010年9月第25卷第9期，第1368-1370页)中的方法，在下述色谱条件中对高良姜素和山柰素对照品进行了测定：

色谱柱：PhenomenexC₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)

检测波长：360nm；

流动相：甲醇-0.4％磷酸(60：40)

体积流量：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

结果分别如图3-5所示，图5为将图3和图4统一在相同坐标轴下的色谱图，上方的为山柰素，下方的为高良姜素。结果显示，山柰素和高良姜素出峰时间分别为23.556min和23.688min，几乎完全一致，未能分开。

可以看出，在山柰素对照品不正确的情况下，现有技术对高良姜成分的分离测定就难免出现偏差。正如本实施例中参考文献的方法，其在实际上并没有通过HPLC分离出将高良姜中的高良姜素和山柰素分离开来，不但没有测出山柰素的含量，其测得的高良姜素含量也实为高良姜素与山柰素的含量之和。

因此，由于本发明良附丸类制剂是醋香附和高良姜通过一定工艺制备得到的混合物，其更不可能准确得到良附类制剂中的高良姜素和山柰素含量。

实施例2本发明的检测方法及方法学考察

1、对照品溶液的制备

取高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮对照品适量，精密称定，置于50mL量瓶内，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，得混合对照品储备液。精密量取上述储备液1mL，置10mL量瓶内，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液，质量浓度分别为0.254、0.032、0.051、0.005、0.021mg/mL。

2、供试品溶液的制备

取良附丸粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

3、色谱条件

色谱柱：PhenomenexC₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

检测波长：242nm；

流动相：甲醇-0.2％磷酸水溶液；

体积流量：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

梯度洗脱程序：

对照品溶液和供试品溶液的结果分别如图6和图7所示。

结果显示，在本发明的方法各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离，其理论塔板数(N)均大于4000，能使高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮有效分离，且不受待测样品中的其他组分干扰，专属性强。

4、线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10μL，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1线性范围考察

结果表明，证明本发明方法线性范围广，准确度高。

5、精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液10μL，重复进样6次，测定高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮峰面积，其RSD分别为0.76％、0.64％、0.82％、1.04％、0.38％，表明仪器的精密度良好。

6、重复性试验

取同一批样品6份，分别按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算。高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮含量RSD分别为0.94％、0.87％、1.15％、0.86％、1.43％，证明本发明方法重复性良好。

7、稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24h进样10μL，测定峰面积，计算。高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮RSD分别为0.96％、1.17％、1.33％、1.25％、1.48％，表明供试品溶液在24h内稳定。

8、加样回收率试验

取6份已知含有量的样品(批号：3083042)约0.50g，精密称定，分别加入对照品储备液1mL。按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算回收率，结果见表2

表2良附丸中5种成分加样回收率试验结果

9、样品测定

取不同批次良附丸，按照本发明的方法进行样品处理和成分定量测定,结果见表3。

表3良附丸含量测定结果

实施例3本发明检测方法的筛选试验

1、检测波长的筛选

在以下色谱条件下，比较235nm、242nm、254nm、266nm、280nm波长.

色谱柱：PhenomenexC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-水；

体积流量：1.0mL/min；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序：

结果如图8-12所示。

结果显示，在242nm下，各待测成分均有较大紫外吸收，故选择242nm作为检测波长。

2、流动相和梯度洗脱程序的筛选

分别考察了甲醇-水，甲醇-0.2％磷酸，乙腈-0.2％磷酸等多个种流动相及梯度洗脱程序，条件分别如下：

条件1：

条件2：

条件3：

条件4：

条件5：

条件6：

条件7：

条件8：

条件9：

结果如图13-21所示。

结果显示，条件4，即本发明的流动相和梯度洗脱程序的分离效果最佳。而条件3虽然分离效果好，但山柰素和高良姜素重合在一起。

3、供试品溶液制备方法的筛选

①提取溶媒种类的考察:

分别精密称取良附丸粉末1g，置于锥形瓶中，分别加入甲醇、乙醇25mL，称定质量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。结果如表4所示：

表4不同提取溶剂测定结果

结果表明，甲醇和乙醇均能有效提取良附丸粉末中的各成分。其中，甲醇提取总成分含量较乙醇高，故优选甲醇作为提取溶媒。

②提取溶媒浓度的考察:

分别精密称取良附丸粉末1g，置于锥形瓶中，分别加入50％、70％甲醇、甲醇各25mL，称定质量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。结果如表5所示：

表5不同浓度甲醇测定结果

结果表明，50-100％的甲醇均能有效提取良附丸粉末中的各成分。其中，随着甲醇增大，总成分含量逐渐提高，故优选100％甲醇作为提取溶媒。

③提取方法考察:

分别精密称取良附丸粉末1g，置于锥形瓶中，加入甲醇各25mL，称定质量，分别超声、回流处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。结果如表6所示：

表6不同提取方法测定结果

结果表明，回流和超声提取均能有效提取良附丸粉末中的各成分。

回流提取较超声法总成分含量稍偏高，但考虑到回流法操作较复杂，系统误差较大，故优选超声法。

④提取时间考察:

分别精密称取良附丸粉末1g，置于锥形瓶中，分别加入50％、70％甲醇、甲醇各25mL，称定质量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。结果如表7所示。

表7不同提取时间测定结果

结果表明，提取时间对总成分含量影响不大，考虑时间成本，选择超声30min。

综上所述，本发明的HPLC检测方法，可以同时测定良附类制剂中的多种成分。该方法专属性强、信息反映全面，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控良附类制剂的质量，提高了药物的安全性。

Claims (10)

1.一种良附类制剂的HPLC检测方法，其特征在于：它是同时测定良附类制剂中高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮5种成分含量的HPLC方法，包括以下步骤：

(1)高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮标准曲线的建立：

a、对照品溶液的制备：

取高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；

b、对照品溶液的测定：

取不同进样量的混合对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，测定各色谱峰峰面积，得到高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的标准曲线；

色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料；

检测波长：242nm；

流动相：甲醇-0.2％磷酸水溶液；

梯度洗脱程序：

(2)待测样品中的高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮含量测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测良附类制剂或其粉末，加入提取溶媒，称定重量，超声或回流提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的质量，过滤，取滤液作为供试品溶液；所述提取溶媒选自乙醇或50％-100％甲醇；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中高良姜素、山柰素、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的含量。

2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤a中，所述对照品溶液中，每1mL溶液含高良姜素0.254mg、山柰素0.032mg、香附烯酮0.051mg、圆柚酮0.005mg和α-香附酮0.021mg。

3.根据权利要求2所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤b中，所述不同进样量的混合对照品溶液分别为2、4、6、8、10μL。

4.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述步骤c中，所述提取溶媒选自100％甲醇。

5.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述步骤c中，提取溶媒与良附类制剂或其粉末的体积重量比为25:1mL/g。

6.根据权利要求1-5任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。

7.根据权利要求6所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱为PhenomenexC18色谱柱。

8.根据权利要求1-5任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为30℃。

9.根据权利要求1-5任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱条件的体积流量为1.0mL/min。

10.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述良附类制剂包括良附丸、良附滴丸或良附软胶囊。