CN109917041A - 消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法，该方法包括冰片、川芎和丹参的鉴别，以及人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测方法；本发明提供的消栓通络片中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测方法无阴性干扰，专属性强，分离效果好、准确度高、重现性好；本发明还增加了对消栓通络片中冰片、川芎和丹参的鉴别，以及人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测，该方法准确度、重现性等均符合要求，可更好地控制消栓通络片的质量。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法
背景技术
消栓通络片由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、郁金、桂枝、木香、冰片和山楂组成。具有活血化瘀，温经通络之功效。用于血脂增高，脑血栓引起的精神呆滞，舌质发硬，言语迟涩，发音不清，手足发凉，活动疼痛等病症的治疗。
众所周知，现行中药质量控制的基本模式是参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式建立的，化学定性鉴别与指标成分检测是其主要内容。对于化学药品而言，其分子结构清楚，构效关系明确，鉴别、检查、含量测定可以直接作为疗效评价的指标，但对于中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，检测任何一种活性成分均不能体现其整体疗效，这是中药与化学药品质量标准的根本区别。更何况至今为止，大部分中药的有效成分仍未得以阐明。
据统计，中国药典2005年版一部共收载中药材(含饮片和提取物)572种，其中只有60％有过化学成分研究报道，约20％进行过较系统的化学成分研究，至今已阐明其有效成分的品种不到5％。即使明确了有效成分的中药，也存在量效关系不明确，或者本身就没什么量效关系等问题。因此，有相当一部分中药材和中成药的质量标准中尚无完善的含量测定方法，更毋提确保临床的安全有效。
中药的质量控制和评价是制约中药现代化发展的关键问题之一，也一直是中医药研究的难点和热点。因此，从中药研究的技术要求方面，将来的新药研究有必要在质量标准中建立多指标含量测定，目的之一是实现对多数成份指标的控制，并将对中药制剂工艺过程的控制直接在质量标准中得到体现。即处方中含有多个明确有效成分的，或者处方中药味分别按不同路线提取等各种不同情况下，均有必要研究建立多个指标的含量测定。
目前，已公开多种中药活性成分的检测方法，例如中国专利申请201510676644.7中共开了一种消栓通络片中主要活性成分的含量测定方法。所述测定方法通过HPLC法可同时对消栓通络片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1进行含量测定，根据色谱条件，将对照品混合溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，对照品混合溶液进样量分别为10μL，供试品液进样量为5μL，记录色谱峰面积，外标法计算含量。同时，所述测定方法通过ELSD法对黄芪甲苷进行含量测定，根据色谱条件，将对照品混合溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，对照品进样量分别为5μL、10μL，供试品液进样量为10～20μL，记录色谱峰面积，外标两点法对数方程计算含量。但是根据对专利申请文件的解读发现该申请中并没有涉及黄芪甲苷的含量测定方法。
又如，中国专利申请201310578946.1中公开了一种香菊片有效成分的检测方法。目前其含量测定通过薄层色谱法检测黄芪甲苷，但其重现性较差，准确性和灵敏度都不高。该发明的目的是：提供一种香菊片有效成分的检测方法。采用高效液相色谱法检测黄芪甲苷，照高效液相色谱法测定；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：乙腈和磷酸二氢钾溶液混合，加三乙胺，用磷酸调pH值至2.5至3.5；流速1mL/min；柱温20℃；紫外检测波长为208nm，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。本发明效果达到方便的、准确的对香菊片产品中每片制剂含黄芪以黄芪甲苷计不少于0.010mg的定量检测的目的。
但是现有技术中并没有对消栓通络片中有效成分进行鉴别和含量测定的记载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法，以完善现有药品含量检测不准确的问题，其中对消栓通络片中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1含量的检测方法，以及黄芪的含量检测方法，本发明提供的检测方法准确度高、重现性强，稳定性高。
本发明的技术方案提供了一种消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法，其包括冰片、川芎和丹参的鉴别，以及人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测方法；
其中，所述的冰片、川芎和丹参的鉴别采用薄层色谱法，其中，所述的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测采用高效液相色谱法；
其中，本发明所述的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，用甲醇溶解，甲醇与消栓通络片的体积质量比为25：1(mL/g)，超声后过滤，将滤液蒸干后用水溶解，之后用饱和的正丁醇振摇提取，合并提取液后用氨试液洗涤，然后用饱和的正丁醇洗涤，蒸干后残渣用甲醇溶解；
(2)对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂制备人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的混合溶液，即为对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-水(B)作为流动相进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于2000。
进一步地，所述的超声的频率为60-80kHz，时间为30min。
上述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，精密称定，研细，充分混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声(频率60-80kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL，蒸干，残渣用水20mL分2次溶解，转移至分液漏斗中，用饱和的正丁醇振摇提取4次(30mL，30mL，20mL，20mL)，分别得到正丁醇提取液，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，弃去氨试液，再用25mL饱和的正丁醇洗涤，然后蒸干正丁醇，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；
(2)对照品溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇分别制成每1mL含人参皂苷Rg1 1.0mg，人参皂苷Rb1 1.0mg，三七皂苷R10.2mg的混合溶液，制得对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Capcell Pak C18,5μm，4.6×150mm)；以乙腈(A)-水(B)作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0mL/min；检测波长：203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于2000；
表1
| 时间(min) | 流动相A乙腈(％) | 流动相B水(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 20 | 40 | 60 |
| 21 | 20 | 80 |
| 26 | 20 | 80 |
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明所述的黄芪甲苷的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，用甲醇溶解，甲醇与消栓通络片的体积质量比为25：1(mL/g)，超声后过滤，将滤液蒸干后用水溶解，之后用饱和的正丁醇振摇提取，合并提取液后用氨试液洗涤，然后用饱和的正丁醇洗涤，蒸干后残渣用甲醇溶解；
(2)对照品溶液的制备：称取黄芪甲苷对照品，即为对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32：68的乙腈(A)-水(B)作为流动相进行洗脱；流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度为100℃；载气流速为2.5L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于1800。
上述黄芪甲苷的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，精密称定，研细，充分混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声(频率60-80kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL，蒸干，残渣用水20mL分2次溶解，转移至分液漏斗中，用饱和的正丁醇振摇提取4次(30mL，30mL，20mL，20mL)，分别得到正丁醇提取液，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，弃去氨试液，再用25mL饱和的正丁醇洗涤，然后蒸干正丁醇，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；
(2)对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂制备黄芪甲苷溶液，加甲醇分别制成每1mL含黄芪甲苷0.5mg的溶液，制得对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32：68的乙腈(A)-水(B)作为流动相进行洗脱；流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度为100℃；载气流速为2.5L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于1800。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明中所述的冰片的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以乙醇为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用体积比为8：2的石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯混合溶液为展开剂展开，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
优选地，上述冰片的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，研细，置水浴上升华，收集升华物加入1mL乙醇使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取冰片对照品，加入甲醇制成每1mL含5mg冰片的溶液，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含冰片的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比为8：2的石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯混合溶液；
本发明中所述的川芎的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以乙酸乙酯为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用体积比为9：1的正己烷-乙酸乙酯混合溶液为展开剂展开，晾干，加热至斑点显色清晰。
优选地，上述川芎的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，研细，加入20mL乙醚溶解，超声20min，放冷后过滤，蒸干滤液，残渣用2mL乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取川芎对照品1.0g，加入20mL乙醚溶解，超声20min，放冷后过滤，蒸干滤液，残渣用2mL乙酸乙酯溶解，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含川芎的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，晾干，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比9：1的正己烷-乙酸乙酯混合溶液；
其中，所述的展开条件为：温度29℃、湿度50％。
本发明中所述的丹参的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以甲醇为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用体积比为8：1：0.8的三氯甲烷-丙酮-甲酸混合溶液为展开剂展开，晾干，加热至斑点显色清晰。
优选地，上述丹参的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，研细，加入20mL水溶解，超声30min，放冷后过滤，滤液加2mL盐酸，用乙醚提取两次，分别得到乙醚提取液，每次30mL，合并乙醚提取液并蒸干，残渣用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取原儿茶酸对照品，加入甲醇制成每1mL含丹参1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含丹参的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，用展开剂展开，晾干，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比8：1：0.8的三氯甲烷-丙酮-甲酸混合溶液；
其中，检视条件为254nm；
其中，所述的展开条件为：温度29℃、湿度50％。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的消栓通络片中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测方法无阴性干扰，专属性强，分离效果好、准确度高、重现性好。
本发明根据处方组分的特点，增加了对消栓通络片中冰片、川芎和丹参的鉴别，以及人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测，该方法准确度、重现性等均符合要求，可更好地控制消栓通络片的质量。
本发明提供的消栓通络片中活性成分的检测方法，该方法确度高、稳定性好、重现性好；改善了消栓通络片无准确质量控制方法的现状，保证了消栓通络片中有效成分含量检测的准确性和全面性；确保了消栓通络片的质量，从而保证了患者用药安全、有效。
附图说明
图1三七对照品的HPLC色谱图；
图2三七供试品的HPLC色谱图；
图3不包含三七的阴性对照品的HPLC色谱图；
图4人参皂苷Rg1的线性关系图；
图5人参皂苷Rb1的线性关系图；
图6三七皂苷R1的线性关系图；
图7过色谱柱Agilent C18柱的三七对照品的色谱图；
图8过色谱柱Agilent C18柱的三七供试品的色谱图；
图9黄芪甲苷对照品的HPLC色谱图；
图10黄芪甲苷供试品的HPLC色谱图；
图11不包含黄芪甲苷的阴性对照品的HPLC色谱图；
图12黄芪甲苷标准曲线图；
图13过色谱柱Agilent C18柱的黄芪甲苷对照品的色谱图；
图14过色谱柱Agilent C18柱的黄芪甲苷供试品的色谱图；
图15冰片的薄层色谱图，图中1、6冰片对照品溶液，图中2-4供试品溶液，图中5阴性供试品溶液；
图16川芎的薄层色谱图，图中1、3、5供试品溶液，图中2、6川芎对照品溶液，图中4川芎阴性供试品溶液；
图17丹参的薄层色谱图，图中1丹参阴性供试品溶液，2-4丹参供试品溶液，5-原儿茶酸对照品溶液；
其中，附图15-17是在薄层色谱图消除了背景的基础上绘制的图片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施参数范围作进一步详细描述，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明所使用的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1分别购自中国药品生物制品鉴定所，批号分别为：110703-200424，110704-200318，110745-200312。所使用的消栓通络片为哈尔滨市康隆药业有限责任公司生产，批号为20100301；20100302；20100303。
本发明所使用的乙腈为色谱纯，使用的其他试剂均为分析纯。
实施例1
人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量检测方法以及方法学考察
包括下述步骤：
(1)仪器：安捷伦HP1100高效液相色谱仪；AS10200A型超声波振荡仪；LABOROTA-4000型旋转蒸发仪。色谱柱Capcell Pak C18，填料粒径5μm，长度150mm，内径4.6mm；
(2)供试品溶液的制备：取消栓通络片20片(批号：20100301)，除去包衣，精密称定，研细，充分混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声(频率70kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL，蒸干，残渣用水20mL分2次溶解，转移至分液漏斗中，用饱和的正丁醇振摇提取4次(30mL，30mL，20mL，20mL)，分别得到正丁醇提取液，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，弃去氨试液，再用25mL饱和的正丁醇洗涤，然后蒸干正丁醇，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；
(3)对照品溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇分别制成每1mL含人参皂苷Rg1 1.0mg，人参皂苷Rb11.0mg，三七皂苷R10.2mg的混合溶液，制得对照品溶液；
(4)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Capcell Pak C18,5μm，4.6×150mm)；以乙腈(A)-水(B)作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0mL/min；检测波长：203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于2000。
表1梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A乙腈(％) | 流动相B水(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 20 | 40 | 60 |
| 21 | 20 | 80 |
| 26 | 20 | 80 |
(5)阴性对照试验：按照供试品消栓通络片的处方配比，制备不含三七的消栓通络片，之后按照步骤(2)中供试品的制备方法制备阴性对照液，按上述色谱检测方法测定，结果表明消栓通络片中其他成分对人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的测定无干扰。
三七对照品的HPLC色谱图如图1，三七供试品的HPLC色谱图如图2，不包含三七的阴性对照品的HPLC色谱图如图3；
结果：从色谱图可以看出，三七皂苷R1对照品色谱峰保留时间在8分钟中左右，人参皂苷Rg1对照品色谱峰保留时间在10分钟中左右，人参皂苷Rb1对照品色谱峰保留时间在18分钟中左右，供试品色谱图中在相应保留时间处有三种成分的色谱图且与其他色谱峰分离良好；阴性对照品色谱图中在相应保留时间处无吸收峰，表明该含量测定方法无阴性干扰，专属性强。
(6)方法学考察
(6.1)线性关系考察
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1 0.956mg，人参皂苷Rb1 1.251mg，三七皂苷R1 0.2295mg的混合溶液，吸取2、5、10、15、20μL，注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算回归方程，结果见表2-4，人参皂苷Rg1的线性关系图如图4，人参皂苷Rb1的线性关系图如图5，三七皂苷R1的线性关系图如图6。
表2人参皂苷Rg1线性关系
| 序号 | 进样量(μL) | 进样量(μg) | 平均峰面积(A) |
| 1 | 2 | 1.912 | 711.5045 |
| 2 | 5 | 4.78 | 1721.96 |
| 3 | 10 | 9.56 | 3379.16 |
| 4 | 15 | 14.34 | 5097.9 |
| 5 | 20 | 19.12 | 6665.46 |
如图4所示，以进样量为横坐标，平均峰面积为纵坐标，建立标准曲线方程：回归方程为Y＝347.42X+60.959，结果表明人参皂苷Rg1在1.912-19.12μg范围内呈良好的线性关系。
表3人参皂苷Rb1线性关系
| 序号 | 进样量(μL) | 进样量(μg) | 平均峰面积(A) |
| 1 | 2 | 2.502 | 711.185 |
| 2 | 5 | 6.255 | 1742.16 |
| 3 | 10 | 12.51 | 3398.34 |
| 4 | 15 | 18.765 | 5196.23 |
| 5 | 20 | 25.02 | 6786.94 |
如图5所示，以进样量为横坐标，平均峰面积为纵坐标，建立标准曲线方程：回归方程为Y＝271.14X+39.345，结果表明人参皂苷Rb1在2.502-25.02μg范围内呈良好的线性关系。
表4三七皂苷R1线性关系
如图6所示，以进样量为横坐标，平均峰面积为纵坐标，建立标准曲线方程：回归方程为Y＝332.02X+9.7939，结果表明人参皂苷Rb1在0.459-4.59μg范围内呈良好的线性关系。
(6.2)重复性试验
分别同一批(批号：20100301)按照供试品制备方法制备的6份样品溶液，分别注入液相色谱仪测定三种成分的峰面积，计算总含量以及RSD值，具体数据见下表5。
表5
检测结果显示，重复测定6次的平均值为每片8.11mg，RSD为1.3％，由此可知，此含量测定方法的重复性良好。
(6.3)仪器精密性考察
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇分别制成每1mL含人参皂苷Rg1 1.0mg，人参皂苷Rb1 1.0mg，三七皂苷R1 0.2mg的混合溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Capcell Pak C18,5μm，4.6×150mm)；以乙腈(A)-水(B)作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0mL/min；检测波长：203nm进行检测，每次进样10μL，重复5次，测定三种成分的峰面积，结果见下表6-8。
表6人参皂苷Rg1精密度
表7人参皂苷Rb1精密度
表8三七皂苷R1精密度
由上表6-8的检测结果可知，重复检测5次人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三种成分的峰面积RSD均小于2.0％，此测定方法的精密性良好。
(6.4)准确性试验
取同一批次已知含量的样品(人参皂苷Rg19.8464mg/g、人参皂苷Rb17.8074mg/g和三七皂苷R11.9103mg/g)6份，精密称定，分别精密加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，摇匀，过滤，取滤液，分别注入液相色谱仪中测定含量，按下列公式计算回收率，结果见下表9-11。
回收率＝[(测得量-已知样品量)/加入对照品量]×100％
表9人参皂苷Rg1准确度试验测定结果
由上表9得检测数据可以看出，人参皂苷Rg16次准确度检测得平均回收率为95.42％，RSD为2.5％，说明此测定方法的准确度良好。
表10三七皂苷R1准确度试验测定结果
由上表10得检测数据可以看出，三七皂苷R1 6次准确度检测得平均回收率为93.58％，RSD为2.0％，说明此测定方法的准确度良好。
表11人参皂苷Rb1准确度试验测定结果
由上表11得检测数据可以看出，人参皂苷Rb1的6次准确度检测得平均回收率为94.20％，RSD为1.7％，说明此测定方法的准确度良好。
(6.5)溶液稳定性试验
取消栓通络片样品，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液分别在放置0小时、4小时、8小时、12小时、27小时后，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量，结果见表12。
表12溶液稳定性试验(n＝2)
根据上表12的检测结果可知，供试品溶液在室温条件下放置27小时，样品含量无显著变化，其RSD为0.8％，表明样品中三种成分的含量在27小时内稳定性良好。
(6.6)耐用性考察
分别在Capcell Pak C18(5μm，150mm×4.6mm)和Agilent C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱进行试验，结果色谱峰的峰形、分离度、理论塔板数均可达到满意的效果，具体检测结果见附图1-3和7-8。
(6.7)样品含量测定及限度的确定
取3批样品(批号：20100301；20100302；20100303)按照对照品溶液、供试品溶液的制备方法制备对照品溶液和供试品溶液，并按上述色谱条件测定三种样品成分的含量，结果分别为每片8.02、8.17、8.20mg。
通过3批样品三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量测定，结果表明：消栓通络片3批样品中三种成分的含量测定的平均含量为每片8.13mg，考虑到大生产过程中每批三七药材的差异以及损耗对样品中三七含量测定的影响，将样品的平均含量下浮25％，制定本品的含量限度为：每片不得少于6.0mg。
市售消栓通络片样品中三期的含量测定，取市售样品，按三七的含量测定方法进行实验，结果见表13。
表13市售消栓通络片样品中三七的含量测定结果
| 样品来源 | 批号 | 测定结果(mg/片) |
| 通州金恺威药业有限公司 | 100102 | 3.34 |
| 河北兆康制药有限公司 | 090707 | 5.49 |
| 哈药集团人民同泰制药厂 | 20100304 | 6.90 |
| 黑龙江天宏药业有限公司 | 20090201 | 6.61 |
实施例2
所述的黄芪甲苷的含量检测方法包括下述步骤：
(1)仪器：高效色谱仪：HP1100；蒸发光散射检测仪：ALLTELL-ELSD-2000ES；
黄芪甲苷对照品：购自中国药品生物检定所，批号：100781-200613；所使用的消栓通络片为哈尔滨市康隆药业有限责任公司生产，批号为20100301；20100302；20100303。
本发明所使用的乙腈为色谱纯，使用的其他试剂均为分析纯。
(2)供试品溶液的制备：取消栓通络片20片(批号：20100301)，除去包衣，精密称定，研细，充分混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声(频率60-80kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL，蒸干，残渣用水20mL分2次溶解，转移至分液漏斗中，用饱和的正丁醇振摇提取4次(30mL，30mL，20mL，20mL)，分别得到正丁醇提取液，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，弃去氨试液，再用25mL饱和的正丁醇洗涤，然后蒸干正丁醇，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；
(3)对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂制备黄芪甲苷溶液，加甲醇制成每1mL含黄芪甲苷0.5mg的溶液，制得对照品溶液；
(4)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32：68的乙腈(A)-水(B)作为流动相进行洗脱；流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度为100℃；载气流速为2.5L/min；；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于1800。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。
(5)阴性对照试验：按照供试品消栓通络片的处方配比，制备不含黄芪甲苷的消栓通络片，之后按照步骤(2)中供试品的制备方法制备阴性对照液，分别精密吸取对照样品溶液5μL、阴性对照品10μL和供试品溶液20μL，注入液相色谱仪。
黄芪甲苷对照品的HPLC色谱图如图9，黄芪甲苷供试品的HPLC色谱图如图10，不包含黄芪甲苷的阴性对照品的HPLC色谱图如图11。
结果：从色谱图可以看出，黄芪甲苷对照品色谱峰保留时间在15分钟中左右，供试品色谱图中在相应保留时间处有黄芪甲苷的色谱图且与其他色谱峰分离良好；阴性对照品色谱图中在相应保留时间处无吸收峰，表明该含量测定方法无阴性干扰，专属性强。
(6)方法学考察
(6.1)线性关系考察
精密吸取上述步骤(3)中的对照品溶液
(0.503mg/mL)2、5、10、15、20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算回归方程，结果见下表14，标准曲线图见附图12。
表14线性关系试验结果(0.2mg/mL，n＝2)
| 序号 | 进样量(μg) | 进样量常用对数 | 峰面积(A) | 峰面积常用对数 |
| 1 | 1.006 | 0.002598 | 343.60 | 2.5361 |
| 2 | 2.515 | 0.4005 | 1887.45 | 3.2759 |
| 3 | 5.03 | 0.7016 | 4306.40 | 3.6341 |
| 4 | 7.545 | 0.8777 | 9929.24 | 3.9969 |
| 5 | 10.06 | 1.0026 | 15231.35 | 4.1827 |
如附图12所示，以进样量的常用对数为横坐标X，峰面积的常用对数为纵坐标Y建立标准曲线方程：回归方程：Y＝1.623X+2.555，结果表明黄芪甲苷在1.006-10.06μg范围内成良好的线性关系。
(6.2)仪器精密度试验
以甲醇为溶剂制备黄芪甲苷溶液，加甲醇制成每1mL含黄芪甲苷0.5mg的溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32：68的乙腈(A)-水(B)作为流动相进行洗脱；流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度为100℃；载气流速为2.5L/min，每次进样10μL，重复5次，测定峰面积，结果见表15。
表15仪器精密度试验
由上表15检测结果显示，重复5次峰面积的平均值为4306.4，RSD为1.0％，说明此仪器的精密度良好。
(6.3)重复性检测
取消栓通络片样品，按供试品溶液制备方法制备6份样品溶液，分别注入液相色谱仪中测定峰面积，计算含量，计算结果见表16。
表16重复性试验
由上表16的检测结果可以看出，6次测定黄芪甲苷的含量均值为每片0.32mg，RSD为4.3％，说明此方法检测的重复性良好。
(6.4)回收率检测
取同一批次已知含量的样品，由重复性试验可知黄芪甲苷含量为0.7657mg/g，共6份，每份取约1.0g，精密称定，分别精密加入黄芪甲苷对照品适量，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，摇均，过滤，取滤液，分别注入液相色谱仪测定含量，按下列公式计算，结果见表17。
回收率＝[(测得量-已知样品量)/加入对照品量]×100％
表17黄芪甲苷回收率实验测定结果(n＝2)
由上表17的检测结果可以看出，黄芪甲苷6次准确性测定的平均回收率为100.97％，RSD为2.0％，说明该检测方法准确性良好。
(6.5)稳定性检测
取消栓通络片样品按供试品溶液的制备方法制备样品溶液分别在放置0小时、4小时、8小时、14小时后，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果见表18。
表18溶液稳定性试验(n＝2)
由上表18的检测结果可知，供试品室温放置14小时，黄芪甲苷的含量无显著变化，表明黄芪甲苷溶液在14小时内性质稳定。
(6.6)耐用性考察
分别在Capcell Pak C18(5μm，150mm×4.6mm)、Agilent C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱进行试验，结果色谱峰的峰形、分离度、理论塔板数均可达到满意的效果，具体检测结果见附图9-11和13-14。
(6.7)样品含量测定及限度的确定
取3批样品(批号：20100301；20100302；20100303)按照对照品溶液、供试品溶液的制备方法制备对照品溶液和供试品溶液，并按上述色谱条件测定样品中黄芪甲苷的含量，结果分别为每片0.31、0.34、0.33mg。
结果表明：消栓通络片3批样品中黄芪甲苷含量测定的平均含量为每片0.3mg左右，将样品的黄芪甲苷含量限度按实际值下浮20％，确定为本品每片含黄芪甲苷不得少于0.25mg。
市售消栓通络片样品中三期的含量测定，取市售样品，按三七的含量测定方法进行实验，结果见表19。
表19市售消栓通络片样品中黄芪甲苷的含量测定结果
| 样品来源 | 批号 | 测定结果(mg/片) |
| 通州金恺威药业有限公司 | 100102 | 0.20 |
| 河北兆康制药有限公司 | 090707 | 0.22 |
| 哈药集团人民同泰制药厂 | 20100304 | 0.11 |
| 黑龙江天宏药业有限公司 | 20090201 | 0.12 |
实施例3
所述的冰片的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片10片(批号：20100301)，除去包衣，研细，置水浴上升华，收集升华物加入1mL乙醇使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取冰片对照品，加入甲醇制成每1mL含5mg冰片的溶液，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含冰片的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比为8：2的石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯混合溶液；
检测结果：供试品色谱中，在与对照片色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性供试品溶液在对照品色谱相应的位置上未显示相同颜色的斑点，检测结果见附图15。
实施例4
所述的川芎的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片4片(批号：20100301)，除去包衣，研细，加入20mL乙醚溶解，超声20min，放冷后过滤，蒸干滤液，残渣用2mL乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取川芎对照品1.0g，加入20mL乙醚溶解，超声20min，放冷后过滤，蒸干滤液，残渣用2mL乙酸乙酯溶解，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含川芎的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，晾干，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比9：1的正己烷-乙酸乙酯混合溶液；
其中，所述的展开条件为：温度29℃、湿度50％。
检测结果：供试品色谱中在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性供试品溶液在与对照品色谱相应的位置上未显相同颜色的斑点，检测结果见附图16。
实施例5
所述的丹参的鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片10片(20100301)，除去包衣，研细，加入20mL水溶解，超声30min，放冷后过滤，滤液加2mL盐酸，用乙醚提取两次，分别得到乙醚提取液，每次30mL，合并乙醚提取液并蒸干，残渣用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取原儿茶酸对照品，加入甲醇制成每1mL含丹参1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：按照供试品消栓通络片的配方，制备不含丹参的消栓通络片，之后按照步骤(1)中供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液；
(4)薄层色谱鉴别方法：按照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，将供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，用展开剂展开，晾干，在105℃条件下加热至斑点显色清晰。
其中，所述的展开剂为：体积比8：1：0.8的三氯甲烷-丙酮-甲酸混合溶液；
其中，检视条件为254nm；
其中，所述的展开条件为：温度29℃、湿度50％。
检测结果：供试品色谱中在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性供试品溶液在与对照品色谱相应的位置上未显相同颜色的斑点，检测结果见附图17。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种消栓通络片中多种活性成分含量的测定方法，其特征在于：其包括冰片、川芎和丹参的鉴别，以及人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测方法；
其中，所述的冰片、川芎和丹参的鉴别采用薄层色谱法；
其中，所述的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的检测采用高效液相色谱法；
其中，本发明所述的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，用甲醇溶解，甲醇与消栓通络片的体积质量比为25：1(mL/g)，超声后过滤，将滤液蒸干后用水溶解，之后用饱和的正丁醇振摇提取，合并提取液后用氨试液洗涤，然后用饱和的正丁醇洗涤，蒸干后残渣用甲醇溶解；
(2)对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂制备人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的混合溶液，即为对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-水(B)作为流动相进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：203nm。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的超声的频率为60-80kHz，超声的时间为30min。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的梯度洗涤条件为：
。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的黄芪甲苷的含量检测方法包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取消栓通络片，除去包衣，用甲醇溶解，甲醇与消栓通络片的体积质量比为25：1(mL/g)，超声后过滤，将滤液蒸干后用水溶解，之后用饱和的正丁醇振摇提取，合并提取液后用氨试液洗涤，然后用饱和的正丁醇洗涤，蒸干后残渣用甲醇溶解；
(2)对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂制备黄芪甲苷溶液，加甲醇分别制成每1mL含黄芪甲苷0.5mg的溶液，制得对照品溶液；
即为对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32：68的乙腈(A)-水(B)作为流动相进行洗脱；流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度为100℃；载气流速为2.5L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于1800。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的冰片的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以乙醇为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用展开剂展开，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于：所述的展开剂为体积比为8：2的石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯混合溶液。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的川芎的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以乙酸乙酯为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用展开剂展开，晾干，加热至斑点显色清晰。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：所述的展开剂为体积比为9：1的正己烷-乙酸乙酯混合溶液。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的丹参的鉴别方法包括以下步骤：
吸取以甲醇为溶剂的供试品溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液分别点于同一硅胶薄层板上，用展开剂展开，晾干，加热至斑点显色清晰。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于：所述的展开剂为体积比为8：1：0.8的三氯甲烷-丙酮-甲酸混合溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190621 |
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