CN109932443B - 一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用 - Google Patents

一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用，涉及药材质量法，所述一测多评法以23‑乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23‑乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11‑去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23‑乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11‑去氧泽泻醇B的含量，上述用于不同等级泽泻的一测多评法可应用于泽泻不同等级样品的测定评价。本发明公开的用于不同等级泽泻的一测多评法能够更好的体现泽泻的整体质量且检测时操作简便且成本较低，可为不同等级泽泻多成分含量范围划分提供参考。

Description

一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用
技术领域
本发明涉及药材质量检测方法，具体涉及一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用。
背景技术
泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.的干燥块茎，具有利水渗湿，泄热，化浊降脂的功效。泽泻作为福建省著名道地药材被纳入国家第一批中药标准化项目研究药材之一，旨在切实提高中药产品质量水平，如何更好地制定泽泻药材质量标准及其等级标准显得尤为迫切和重要。基于中药质量标志物Q-marker理论为泽泻及其等级标准的质控指标选择提供了理论依据：泽泻的主要活性成分分为两类，一类为三萜类化合物，其中含量较高的成分23-乙酰泽泻醇B具有降血脂、降血糖、利尿等作用，23-乙酰泽泻醇C具有促进葡萄糖摄取活性和体外抗结石作用，泽泻醇B具有抗草酸钙结晶和利尿等作用，11-去氧泽泻醇B具有抗炎活性，泽泻醇A具有抗草酸钙结石作用，在加工炮制过程中，泽泻三萜类成分不稳定，能发生互相转化。泽泻另外一类重要成分为倍半萜类成分，其中泽泻烯醇具有较高的含量，具有明显的降压活性，与泽泻临床上降压应用相一致；倍半萜类成分环氧泽泻烯具有显著抗炎作用，亦是泽泻的重要活性成分。这两大类成分均是泽泻功能属性密切相关的化学物质，并且具有独特的生源合成途径，具有化学专属性，同时能够反映泽泻临床疗效，应该作为泽泻的重要Q-marker成分。2015版《中国药典》仅以23-乙酰泽泻醇B作为泽泻质控指标难以体现泽泻的整体质量，同时泽泻这些活性成分的对照品制备困难，价格相对昂贵，尤其倍半萜类成分，较难分离制备，获取困难。因此，有待为泽泻的内在质量控制和等级标准研究有待提升提供新的依据。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是；提供一种用于不同等级泽泻的一测多评法及其应用，为泽泻的内在质量控制和等级标准研究提供依据。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，加入乙腈，进行超声处理后离心处理，然后用滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.2-0.5mL·min-1；检测波长为207-209nm；柱温20-40℃；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量。
本发明提供的另一种技术方案，将上述用于不同等级泽泻的一测多评法，应用于泽泻不同等级的划分。
本发明的有益效果在于：本发明建立了以易得且性质稳定并具有法定来源的23-乙酰泽泻醇B成分为内参物，测定泽泻中其他萜类成分环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B含量的一测多评法(QAMS)，大幅节省了时间和资金成本，方法快速准确。通过本申请建立的QAMS来测定泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量时，具有较高的重现性、稳定性以及可靠度，为今后在泽泻外观等级划分的基础上，利用内在活性成分对泽泻不同等级进行划分，使结果更为精准，本发明提供的QAMS可应用于泽泻不同商品规格等级样品的测定评价，为不同等级泽泻多成分含量范围划分提供参考，提示QAMS在中药泽泻的多指标质量控制和等级评价模式中具有良好的应用前景。本发明提供的用于不同等级泽泻的QAMS能够更好的体现泽泻的整体质量且检测时操作简便且成本较低。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的混合对照品和65批泽泻样品超高效液相色谱叠加图；
图2所示为本发明具体实施方式的不同等级泽泻样品中7个成分含量；
图3所示为本发明具体实施方式的不同等级泽泻样品中7个成分含量。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：采用超高效液相色谱法，以23-乙酰泽泻醇B为内参物计算其他6种成分的质量分数，同时利用外标法测定泽泻药材中7个成分的质量分数，比较一测多评法的计算结果与外标法实测值，验证一测多评法的可行性和准确性。
本发明的用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，加入乙腈，进行超声处理后离心处理，然后用滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.2-0.5mL·min-1；检测波长为207-209nm；柱温20-40℃；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量。
上述用于不同等级泽泻的一测多评法，可应用于泽泻不同等级的划分。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明建立了以易得且性质稳定并具有法定来源的23-乙酰泽泻醇B成分为内参物，测定泽泻中其他萜类成分环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B含量的一测多评法，大幅节省了时间和资金成本，方法快速准确。通过本申请建立的QAMS来测定泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量时，具有较高的重现性、稳定性以及可靠度，为今后在泽泻外观等级划分的基础上，利用内在活性成分为更精准的等级划分提供方法。本发明提供的QAMS可应用于泽泻不同商品规格等级样品的测定评价，为不同等级泽泻多成分含量范围划分提供参考，提示QAMS法在中药泽泻的多指标质量控制和等级评价模式中具有良好的应用前景。本发明提供的用于不同等级泽泻的一测多评法，能够更好的体现泽泻的整体质量且检测时操作简便且成本较低。
进一步的，所述步骤(1)中具体为，精密称量1g泽泻样品，精密加入乙腈25ml，密塞后称定重量，超声处理后再次称重，使用乙腈补足减失重，摇匀后进行离心，离心后用滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液；
所述泽泻样品为粒径小于80目的泽泻粉末。
进一步的，所述步骤(1)中超声处理的功率为250W、频率为50kHz、时间为30min。
进一步的，所述步骤(2)中离心处理的转速为10 000r·min-1、时间为离心10min，所述滤膜过滤的滤膜为0.22μm的滤膜。
从上述描述可知，通过上述处理可将泽泻内23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B充分的溶解在乙腈中，保证后续检测的准确性。
进一步的，所述色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(50mm×2.1mm，1.8μm)、CORTECS UPLC C18(100mm×2.1mm，1.6μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Uitimate UHPLC XB-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)、Uitimate UHPLC AQ-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)或Syncronis aQ(100mm×2.1mm，1.7μm)。
进一步的，所述色谱柱优选的为CORTECS UPLC C18(100mm×2.1mm，1.6μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Uitimate UHPLC XB-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)或Syncronis aQ(100mm×2.1mm，1.7μm)。
进一步的，所述色谱仪为Waters ACQUITY UPLC H-Class、Waters ACQUITY UPLCI-Class或Agilent 1290。
进一步的，所述超高效液相色谱仪测定的条件为：色谱柱：Waters CORTECS C18柱，所述色谱柱的规格为：2.1mm×100mm×1.6μm；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.3mL·min-1；检测波长为208nm；柱温35℃；进样量：5μL。
进一步的，以23-乙酰泽泻醇B为内参物，环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子分别为0.946、4.183、0.915、1.039、0.923和1.244。
进一步的，所述步骤(3)中使用相对保留值定位环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的色谱峰，以23-乙酰泽泻醇B为内参物，环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的相对保留值分别为3.673、1.706、1.489、1.270、1.133和0.8949。
本发明的方法验证过程如下：
1仪器、试药与泽泻样品
1.1仪器与试药
Agilent 1290超高效液相色谱仪；Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(低压四元梯度泵)；Waters ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(高压二元梯度泵)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DFY-500型中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；Centrifuge5418型离心机(eppendorf公司)；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)，其余试剂均为分析纯。
对照品环氧泽泻烯(批号：MUST-14101616)、23-乙酰泽泻醇C(批号：MUST-17040506)，泽泻醇A(批号：MUST-14052416)、泽泻醇B(批号：MUST-17032208)和11-去氧泽泻醇B(批号：155073-73-7)均购自成都曼思特生物科技有限公司；23-乙酰泽泻醇B(批号111846-201504)购自中国食品药品检定研究院；泽泻烯醇(批号：87827-55-2)购于昆明植物研究所云南西力生物技术股份有限公司，以上标准品纯度均大于98％。
1.2泽泻样品
收集主产地四川、道地产区福建、江西产区、广西产区、国内四大药市广西玉林、河北安国、安徽亳州和四川成都荷花池药材主流市场和福建承天农林科技发展有限公司光泽崇仁泽泻种植基地2017年采收的不同等级泽泻药材共计65个采样点，批次S1～S65，每个产区采样点每级样品收集3批，其中S66和S67与S1产地信息相同，以此类推共收集不同来源不同等级泽泻样品共计195批(S1～S195)，每个批次收集1kg。
所有批次经鉴定为泽泻科植物泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.的干燥块茎，其中S1～S12、S66～S89和S32～S43、S128～S151产区泽泻为川泽泻，而S13～S31、S90～S127和S61～S65、S186～S195产区泽泻为建泽泻，药材市场来源的样品均为川泽泻(S44～S60，S152～S185)。样品按照国家商务部国药联材字(84)第72号文《76种药材商品规格标准》，根据文件规定及市场调研等级划分，进行所有批次样品的等级划分，其中S1-S65信息见表1，用于一测多评方法(QAMS)验证，S66～S195用于QAMS方法的应用。
表1
Figure BDA0001999121300000061
Figure BDA0001999121300000071
1.3溶液的制备
1.3.1混合对照品溶液的制备
精密称取环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B对照品适量，加入乙腈超声溶解，制成质量浓度分别为1.020、1.021、0.436、1.005、0.966、1.130和0.858mg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入50％乙腈至刻度，即得环氧泽泻烯20.40μg·mL-1、23-乙酰泽泻醇C102.1μg·mL-1、泽泻醇A 109.0μg·mL-1、泽泻烯醇100.5μg·mL-1、泽泻醇B 241.5μg·mL-1、23-乙酰泽泻醇B 141.3μg·mL-1和11-去氧泽泻醇B171.6μg·mL-1的混合对照品溶液。
1.3.2供试品溶液的制备
取泽泻样品研磨为粉末，过80目筛，1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10 000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2相对校正因子(fs/i)的建立及耐用性评价
2.1相对校正因子(fs/i)的建立
精密吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液1、2、3、4、5、6、8和10μL注入液相色谱仪中，记录峰面积，根据QAMS的相对校正因子(fs/i)计算公示fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)(式中Ci为待测组分浓度，Ai为待测组分峰面积，Cs为内参物s浓度，As为内参物s峰面积)，以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算23-乙酰泽泻醇B(f)与环氧泽泻烯(a)，23-乙酰泽泻醇C(b)、泽泻醇A(c)、泽泻烯醇(d)、泽泻醇B(e)和11-去氧泽泻醇B(g)的相对校正因子分别为0.946、4.183、0.915、1.039、0.923和1.244。
2.2不同高效液相色谱仪和色谱柱对fs/i的影响
在Waters ACQUITY UPLC H-Class，Waters ACQUITY UPLC I-Class，Agilent1290 3种高效液相色谱系统考察了
Figure BDA0001999121300000081
C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.6μm)、
Figure BDA0001999121300000082
BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)、
Figure BDA0001999121300000083
UHPLC XB-C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)和Syncronis aQ色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)4种色谱柱对fs/i的影响，各成分在不同色谱仪和不同色谱柱上的fs/i的RSD均小于5％，结果见表2，表明不同色谱仪和不同色谱柱所得的相对校正因子无明显差异。
表2
Figure BDA0001999121300000084
Figure BDA0001999121300000091
2.3不同色谱柱柱温对fs/i的影响
采用Agilent 1290高效液相色谱系统，
Figure BDA0001999121300000092
C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.6μm)。考察不同柱温(20、25、30、35、40℃)对fs/i的影响，结果显示，fs/i无显著性差异，RSD＜2％，结果见表3。
表3
柱温/℃ f<sub>f/a</sub> f<sub>f/b</sub> f<sub>f/c</sub> f<sub>f/d</sub> f<sub>f/e</sub> f<sub>f/g</sub>
20 0.929 1 4.207 0.953 2 1.040 0.915 6 1.233
25 0.921 1 4.216 0.970 7 1.043 0.920 0 1.238
30 0.919 9 4.295 0.985 2 1.056 0.924 5 1.247
35 0.933 7 4.267 0.948 5 1.029 0.928 5 1.252
40 0.939 4 4.303 0.939 7 1.023 0.911 7 1.252
平均值 0.928 7 4.257 0.959 4 1.038 0.920 1 1.245
RSD/％ 0.89 1.03 1.91 1.24 0.73 0.70
2.4不同流动相体积流量对fs/i的影响
考察不同体积流量(0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mL·min-1)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入Agilent 1290超高效液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜3％，表明不同体积流量对各成分fs/i无显著影响，结果见表4。
表4
Figure BDA0001999121300000093
Figure BDA0001999121300000101
2.5不同流动相组成比例对fs/i的影响
考察了不同流动相组成比例(±1％乙腈比例)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入Agilent 1290超高效液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜5％，表明不同体积流量对各成分fs/i无显著影响，结果见表5。
表5
梯度比例 f<sub>f/a</sub> f<sub>f/b</sub> f<sub>f/c</sub> f<sub>f/d</sub> f<sub>f/e</sub> f<sub>f/g</sub>
-1％ 0.898 1 4.483 0.904 3 1.010 0.922 2 1.323
0％ 0.929 1 4.321 0.891 0 1.021 0.933 1 1.237
+1％ 0.876 6 4.296 0.879 7 0.979 3 0.865 1 1.281
平均值 0.901 3 4.367 0.891 7 1.004 0.906 8 1.281
RSD/％ 2.93 2.33 1.38 2.16 4.03 3.39
2.6不同检测波长对fs/i的影响
考察不同波长(207nm、208nm和209nm)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入Agilent 1290超高效液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜5％，表明不同体积流量对各成分fs/i无显著影响，结果见表6。
表6
检测波长 f<sub>f/a</sub> f<sub>f/b</sub> f<sub>f/c</sub> f<sub>f/d</sub> f<sub>f/e</sub> f<sub>f/g</sub>
207 0.900 2 4.433 0.896 0 1.051 0.926 1 1.289
208 0.933 0 4.251 0.887 6 1.054 0.923 0 1.269
209 0.962 9 4.188 0.874 3 1.067 0.925 0 1.221
平均值 0.932 0 4.291 0.886 0 1.057 0.924 7 1.260
RSD/％ 3.37 2.97 1.24 0.78 0.17 2.80
2.7不同pH值对fs/i的影响
考察了pH值(6.0、7.0和8.0)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入Agilent 1290超高效液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜5％，表明不同体积流量对各成分fs/i无显著影响，结果见表7。
表7
Figure BDA0001999121300000102
Figure BDA0001999121300000111
2.8待测组分色谱峰的定位
通过考察在不同色谱柱中各待测色谱峰与参照物峰的ts/i进行各成分定位。结果表明ts/i的RSD小，对色谱峰定位较为稳定，可利用ts/i进行色谱法定位。实验所得23-乙酰泽泻醇B与环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B ts/i为3.673、1.706、1.489、1.270、1.133和0.8949。
2.9结论
根据以上结果建立优化色谱条件；
优选了CORTECS UPLC C18(100mm×2.1mm，1.6μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Uitimate UHPLC XB-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)和Syncronis aQ(100mm×2.1mm，1.7μm)用于一测多评法的建立；采用乙腈-水作为流动相；采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.3mL·min-1；检测波长为208nm；柱温35℃；进样量：5μL。
3方法学验证
3.1色谱条件
色谱柱：Waters CORTECS C18柱(2.1mm×100mm，1.6μm)；使用Agilent 1290超高效液相色谱仪对方法学验证进行研究；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.3mL·min-1；检测波长为208nm；柱温35℃；进样量：5μL。理论塔板数按23-乙酰泽泻醇B峰计算应不低于5000，见图1所示。
3.2线性和范围
取环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的混合对照品溶液，用50％乙腈混合溶液稀释配制为梯度浓度的混合溶液，按照“3.1”项下色谱条件进行测定。以环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程，结果见表8。
表8
成分 线性方程 线性范围/μg·mL<sup>-1</sup> r
环氧泽泻烯 Y＝18.38X+0.956 9 0.408～20.40 0.997 8
23-乙酰泽泻醇C Y＝4.359X-0.259 3 2.042～102.1 1.000 0
泽泻醇A Y＝19.86X-0.748 5 2.180～109.0 0.999 8
泽泻烯醇 Y＝17.99X-0.149 7 2.010～100.5 0.999 8
泽泻醇B Y＝19.48X+0.191 7 4.830～241.5 0.999 9
23-乙酰泽泻醇B Y＝18.20X-1.933 1 2.825～141.3 0.999 9
11-去氧泽泻醇B Y＝14.40X-0.056 1 3.432～171.6 0.999 8
3.3精密度
精密吸取混合对照品溶液5μL，1d内连续进样6次，分别计算环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B峰面积的相对标准偏差(RSD)见表9，表明精密度良好。
3.4稳定性
取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24h按“3.1”项下测定各成分的峰面积，计算峰面积的RSD见表9，结果表明供试液在24h内稳定。
3.5重复性
精密称取同一批泽泻样品(编号S13)6份，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下测定各成分的峰面积，带入线性曲线计算环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的质量分数，各成分的质量分数的RSD见表9，结果表明该法重复性良好。
表9
Figure BDA0001999121300000121
Figure BDA0001999121300000131
3.6回收率
精密称取重复性实验同批泽泻药材(编号S13)粉末6份，各精密称取0.5g，根据重复性实验测定的含量，按照1:1分别依次精密加入7个单一对照品溶液，N2气流挥干溶剂后，按“1.3.2”项下依法制备供试品溶液，按“3.1”项下测定各成分的峰面积，分别计算7个化合物的回收率及其回收率的均值和RSD，结果见表10，表明该方法回收率良好。
表10
Figure BDA0001999121300000132
Figure BDA0001999121300000141
4QAMS与外标法(EMS)测定的比较
取泽泻样品S1-S65，分别按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次样品，采用外标法计算泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量；并运用23-乙酰泽泻醇B对环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子计算各成分的量，各批次样品测定2次，取平均值。比较QAMS与外标法的含量。结果表明，2种方法所得到的泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B含量基本一致，RSD小于5％，认为QAMS可以代替外标法进行多成分质量评价。
本发明的实施例一为：
一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取S66-S195的130批泽泻样品，分别研磨成粉末，过80目筛，然后精密成定1.0g置于具塞三角瓶中，精密加入乙腈25ml mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10 000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪测定按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量；
条件为：色谱柱：Waters CORTECS C18柱(2.1mm×100mm，1.6μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.3mL·min-1；检测波长为208nm；柱温35℃；进样量：5μL；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量；
经过测定130个泽泻样品中的23-乙酰泽泻醇B、环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B为表11所示。
表11
Figure BDA0001999121300000151
Figure BDA0001999121300000161
Figure BDA0001999121300000171
Figure BDA0001999121300000181
将上述用于不同等级泽泻的一测多评法应用于泽泻不同等级的划分，结合S1-S195的195批泽泻样本，对泽泻样本进行等级的划分，结果如图2-图3所示；可以看出，三萜类成分总含量最高的来自河北安国药材市场，总含量达7.432mg/g；其次是四川产地和四川成都荷花池，三萜类总含量大于5.48mg/g；广西产地、广西玉林药材市场和安徽亳州药材市场的三萜类总含量达5.0mg/g，而江西和福建产地的三萜类成分总含量低于5.0mg/g，且川泽泻的总三萜含量总体高于建泽泻，进一步分析发现原因为福建和江西的建泽泻中的泽泻醇A和泽泻醇B含量显著低于四川和广西产地的川泽泻；
采用SPSS 18.0软件对不同等级泽泻药材中各成分与等级间的相关性进行双变量相关分析，析结果显示建泽泻等级与环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B和7个萜类成分总含量的Pearson相关系数分别为0.005、-0.485(P<0.05)、0.001、0.343(P<0.05)、0.198、-0.023、0.222和0.073，其中，23-乙酰泽泻醇C和泽泻烯醇两个成分含量与等级之间具有递减和递增趋势；川泽泻等级与环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B和7个萜类成分总含量的Pearson相关系数分别为-0.342(P<0.05)、0.297(P<0.05)、0.042、-0.349(P<0.05)、-0.415(P<0.05)、-0.126、-0.256(P<0.05)和-0.375(P<0.05)，其中，23-乙酰泽泻醇C与川泽泻等级之间呈正相关趋势，环氧泽泻烯、泽泻烯醇、泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B和7个萜类成分总含量与川泽泻等级之间呈负相关趋势；
运用DPS 14.50数据处理软件分析，采用系统聚类法，以195批样品的7个被测物含量为变量，数据转换方式为主成分转换、聚类距离为卡方距离、聚类方法为离差平方和法对195批泽泻药材进行聚类分析，结果如图3所示，结合等级样品与7个特征萜类成分含量测定结果，泽泻萜类成分与仅仅以个头大小作为区分泽泻药材的等级之间没有直接的相关性，但是有明显的地域性差异，因此可对建泽泻和川泽泻进行分别的等级划分，并且在外观等级划分的基础上综合萜类成分含量测定的限度。
本发明的实施例二为：
一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，研磨成粉末，过80目筛，然后精密成定1.0g置于具塞三角瓶中，精密加入乙腈25ml mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：色谱柱：Waters CORTECS C18柱(2.1mm×100mm，1.6μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.2mL·min-1；检测波长为208nm；柱温20℃；进样量：5μL；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量。
本发明的实施例三为：
一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，研磨成粉末，过80目筛，然后精密成定1.0g置于具塞三角瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10 000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：色谱柱：ACQUITY
Figure BDA0001999121300000201
BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.5mL·min-1；检测波长为208nm；柱温30℃；进样量：5μL；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，使用相对保留值定位环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的色谱峰，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量。
本发明的实施例四为：
一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，研磨成粉末，过80目筛，然后精密成定1.0g置于具塞三角瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10 000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：色谱柱：
Figure BDA0001999121300000211
UHPLC XB-C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.35mL·min-1；检测波长为207nm；柱温40℃；进样量：5μL；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量。
本发明的实施例五为：
一种用于不同等级泽泻的一测多评法，包括以下步骤：
(1)取批泽泻样品，研磨成粉末，过80目筛，然后精密成定1.0g置于具塞三角瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，再次称重，乙腈补足减失重，摇匀，提取液于10000r·min-1离心10min，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：色谱柱：Syncronis aQ色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.4mL·min-1；检测波长为209nm；柱温25℃；进样量：5μL；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，使用相对保留值定位环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的色谱峰，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量；
其中，环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子分别为0.946、4.183、0.915、1.039、0.923和1.244；相对保留值分别为3.673、1.706、1.489、1.270、1.133和0.8949。
综上所述，本发明建立了以易得且性质稳定并具有法定来源的23-乙酰泽泻醇B成分为内参物，测定泽泻中其他萜类成分环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B含量的一测多评法(QAMS)，确定其相对校正因子(RCF)分别为0.9462、4.183、0.9145、1.039、0.9225和1.244。通过本申请建立的QAMS来测定泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量时，具有较高的重现性、稳定性以及可靠度，为今后在泽泻外观等级划分的基础上，利用内在活性成分为更精准的等级划分提供方法。本发明提供的QAMS可应用于泽泻不同商品规格等级样品的测定评价，为不同等级泽泻多成分含量范围划分提供参考，提示QAMS法在中药泽泻的多指标质量控制和等级评价模式中具有良好的应用前景。本发明提供的用于不同等级泽泻的一测多评法，能够更好的体现泽泻的整体质量且检测时操作简便且成本较低。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取泽泻样品，加入乙腈，进行超声处理后离心处理，然后用滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液；
(2)使用超高效液相色谱仪按以下条件对供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定；
条件为：流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.2-0.5mL·min-1；检测波长为207-209nm；柱温20-40℃；色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3、CORTECS UPLC C18、ACQUITY UPLCBEH C18、Uitimate UHPLC XB-C18、Uitimate UHPLC AQ-C18或Syncronis aQ；
(3)以23-乙酰泽泻醇B为内参物，计算环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子，再使用相对校正因子计算样品中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量；
在泽泻外观等级划分的基础上综合泽泻中环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的含量测定进行泽泻等级划分。
2.根据权利要求1所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，所述步骤(1)具体为，精密称量1g泽泻样品，精密加入乙腈25ml，密塞后称定重量，超声处理后再次称重，使用乙腈补足减失重，摇匀后进行离心，离心后用滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液；
所述泽泻样品为粒径小于80目的泽泻粉末。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，所述步骤(1)中超声处理的功率为250W、频率为50kHz、时间为30min。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，所述步骤(2)中离心处理的转速为10 000r·min-1、时间为离心10min，所述滤膜过滤的滤膜为0.22μm的滤膜。
5.根据权利要求1所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，所述超高效液相色谱仪测定的条件为：色谱柱：Waters CORTECS C18柱，所述色谱柱的规格为：2.1mm×100mm×1.6μm；流动相为水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：0～0.2min，35％～35％B；0.2～2.5min，35％～55B；2.5～3.5min，55％～55％B；3.5～6.5min，55％～73％B；6.5～9.5min，73％～87％B；9.5～14min，87％～87％B；流速0.3mL·min-1；检测波长为208nm；柱温35℃；进样量：5μL。
6.根据权利要求1所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，以23-乙酰泽泻醇B为内参物，环氧泽泻烯，23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的相对校正因子分别为0.946、4.183、0.915、1.039、0.923和1.244。
7.根据权利要求1所述的用于不同等级泽泻的一测多评法，其特征在于，所述步骤(3)中使用相对保留值定位环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的色谱峰，以23-乙酰泽泻醇B为内参物，环氧泽泻烯、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻烯醇、泽泻醇B和11-去氧泽泻醇的相对保留值分别为3.673、1.706、1.489、1.270、1.133和0.8949。
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