CN116754665A - 泽泻汤的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药质量检测技术领域，具体公开了一种泽泻汤的检测方法，其包括：以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23‑乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23‑乙酰泽泻醇B、11‑去氧泽泻醇B的相对校正因子；采用液相色谱仪测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；按照各相对校正因子计算得到泽泻汤中环氧泽泻烯、泽泻醇C、23‑乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23‑乙酰泽泻醇B、11‑去氧泽泻醇B的含量。本发明的检测方法实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域，尤其涉及一种泽泻汤的检测方法。
背景技术
泽泻汤出自东汉张仲景《金匮要略·痰饮咳嗽病》篇，“心下有支饮，其人苦冒眩，泽泻汤主之”。由泽泻、白术配伍组成，具有利水除饮、健脾制水的功效，为历代医家治疗痰饮眩晕的效方。相关研究表明，方中泽泻的醇提物、水提物及一些单体类化合物都具有利尿、抗结石、保肾护肝、降血脂、降血糖、抗炎的功效，白术中所含主要为挥发油、多糖及内酯类成分，具有抗炎抗肿瘤、降血糖、降血脂、保肝免疫调节的作用，两者相须为用，扩大其功效主治，现广泛应用于高血压、高血脂、眩晕病和脑供血不足相关病症的治疗。同时，泽泻汤收载于2018年国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中，其使用与研究一直受到重视。
目前，对于泽泻汤整方研究，主要是通过几个指标性成分考察泽泻汤的质量控制标准。文献《不同干燥方式泽泻汤指纹图谱的建立及2种成分测定》(中成药)在建立不同干燥方式的泽泻汤指纹图谱研究中，对12批不同干燥方式的泽泻汤进行含有量的测定，以23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ为测定指标，通过其含有量测定结果的相对标准偏差(RSD)作为不同干燥方式对泽泻汤标准煎液质量影响的判断因素之一。文献《HPLC法测定泽泻汤中泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B含量》(上海中医药大学学报)以主要活性成分泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B为指标，探索泽泻汤的质量控制标准，研究中缺乏白术的指标性成分；文献《经典名方泽泻汤的HPLC指纹图谱及多指标含量测定研究》(中草药)补充了这个空白，在建立泽泻汤的HPLC指纹图谱中选择23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C和白术内酯III作为泽泻汤质量评价的依据，进行相关定性定量研究；文献《经典名方泽泻汤UPLC指纹图谱的建立》(中国现代应用药学)建立的泽泻汤指纹图谱中共标定23个共有峰，其中15个化合物峰来自泽泻，8个化合物峰来自白术，指认了白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B共6个共有峰，体现了泽泻汤的整体化学成分特征。但由于中药化学成分对照品分离难度大或单体不稳定、难以供应、成本高等因素，因此限制了外标法在中药复方制剂多指标质量控制和评价中的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种泽泻汤的检测方法，该方法测定组分多，且测定工序简单，检测成本低。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种泽泻汤的检测方法，其包括：
以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
采用液相色谱仪测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
按照各相对校正因子计算得到泽泻汤中环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的含量。
作为上述技术方案的改进，所述以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子的步骤包括：
(1)取环氧泽泻烯对照品、泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅲ对照品、23-乙酰泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅱ对照品、泽泻醇A对照品、泽泻醇B对照品、23-乙酰泽泻醇B对照品、11-去氧泽泻醇B对照品，加60～80vol％的甲醇水溶液溶解，得到第一混合对照品溶液；
(2)将所述第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
(3)采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15vol％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱曲线为：
0～5min，流动相A为30％，流动相B为70％；
5～10min，流动相A从30％→35％，流动相B从70％→65％；
10～25min，流动相A从35％→45％，流动相B从65％→55％；
25～30min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；
30～33min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；
33～38min，流动相A从62％→75％，流动相B从38％→25％；
38～45min，流动相A从75％→90％，流动相B从25％→10％；
45～46min，流动相A为90％，流动相B为10％；
46～50min，流动相A从90％→30％，流动相B从10％→70％；
50～55min，流动相A为30％，流动相B为70％。
作为上述技术方案的改进，所述固定相的粒径为1.6～1.8μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100～150mm，直径为2～4mm，柱温为32～38℃，流速为0.18～0.22mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长为210～235nm。
作为上述技术方案的改进，所述固定相的粒径为1.7μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100mm，直径为2.1mm，柱温为35℃，流速为0.2mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长按下述程序设置：
0～10min，检测波长为210nm；
10～30.4min，检测波长为235nm；
30.4～55min，检测波长为210nm。
作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，采用70vol％的甲醇水溶液溶解对照品。
作为上述技术方案的改进，所述采用液相色谱仪测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量的步骤包括：
(i)取白术内酯Ⅲ对照品，加甲醇水溶液溶解，得到白术内酯Ⅲ对照品溶液；
(ii)取泽泻汤，加浓度为70～100vol％的甲醇水溶液提取，得到供试品溶液；
(iii)吸取所述白术内酯Ⅲ对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15vol％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱曲线为：
0～5min，流动相A为30％，流动相B为70％；
5～10min，流动相A从30％→35％，流动相B从70％→65％；
10～25min，流动相A从35％→45％，流动相B从65％→55％；
25～30min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；
30～33min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；
33～38min，流动相A从62％→75％，流动相B从38％→25％；
38～45min，流动相A从75％→90％，流动相B从25％→10％；
45～46min，流动相A为90％，流动相B为10％；
46～50min，流动相A从90％→30％，流动相B从10％→70％；
50～55min，流动相A为30％，流动相B为70％。
作为上述技术方案的改进，所述固定相的粒径为1.6～1.8μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100～150mm，直径为2～4mm，柱温为32～38℃，流速为0.18～0.22mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长为210～235nm。
作为上述技术方案的改进，所述固定相的粒径为1.7μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100mm，直径为2.1mm，柱温为35℃，流速为0.2mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长按下述程序设置：
0～10min，检测波长为210nm；
10～30.4min，检测波长为235nm；
30.4～55min，检测波长为210nm。
作为上述技术方案的改进，步骤(ii)中，取泽泻汤，加入70vol％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
作为上述技术方案的改进，所述泽泻汤主要包括以下组分：泽泻、白术、辅料；
所述泽泻汤被制备成汤剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明采用以白术内酯Ⅲ作为内标物的一测多评法(即QAMS法)，获得了泽泻汤中环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B等9种成分含量，实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本。
附图说明
图1是泽泻汤的检测方法中采用梯度洗脱程序1时所得的色谱图；
图2是泽泻汤的检测方法中采用梯度洗脱程序2时所得的色谱图；
图3是本发明中泽泻汤的检测方法专属性考察中混合对照品、泽泻汤颗粒、缺白术阴性样品、缺泽泻阴性样品的色谱图(梯度洗脱程序3)；
图4是本发明中泽泻汤的检测方法专属性考察中混合对照品、泽泻汤颗粒、空白溶剂的色谱图；
图5是本发明中泽泻汤的检测方法中采用不同柱温时所得的色谱图；
图6是本发明中泽泻汤的检测方法中采用不同检测波长时所得的色谱图；
图7是本发明中泽泻汤的检测方法中采用0.30mL/min时所得的色谱图；
图8是本发明中泽泻汤的检测方法中采用0.25mL/min时所得的色谱图；
图9是本发明中泽泻汤的检测方法中采用0.20mL/min时所得的色谱图；
其中，峰1为环氧泽泻烯，峰2为泽泻醇C，峰3为白术内酯Ⅲ，峰4为23-乙酰泽泻醇C，峰5为白术内酯Ⅱ，峰6为泽泻醇A，峰7为泽泻醇B，峰8为23-乙酰泽泻醇B，峰9为11-去氧泽泻醇B。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明中泽泻汤主要包括以下组分：泽泻和白术。此外，在一些实施方式中，还包括适量的辅料。其中，辅料是制备泽泻汤各剂型时按需添加的组分，例如制备丸剂时可添加水、蜂蜡等，又如制备胶囊剂可添加微晶纤维素、硬脂酸镁、聚山梨酸酯等，但不限于此。泽泻汤的剂型可为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。本发明的泽泻汤的检测方法对任意剂型的泽泻汤均可以起到良好的检测效果。
具体的，本发明中泽泻汤的检测方法包括以下步骤：
S100：以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
具体的，建立相对校正因子的方法可参考《中国药典》(2020版)第四部通则0512高效液相色谱法，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，建立相对校正因子包括以下步骤：
S101：取环氧泽泻烯对照品、泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅲ对照品、23-乙酰泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅱ对照品、泽泻醇A对照品、泽泻醇B对照品、23-乙酰泽泻醇B对照品、11-去氧泽泻醇B对照品，加60～80vol％的甲醇水溶液溶解，得到第一混合对照品溶液；
具体的，可先将各对照品先混合后，再采用甲醇水溶液溶解；也可将各对照品分别采用甲醇水溶液溶解，然后混合。溶解所用甲醇水溶液的浓度为60～80vol％，优选的为70vol％。
S102：将第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
具体的，采用甲醇水溶液将第一混合对照品溶液进行梯度稀释，稀释所用甲醇水溶液的浓度为60～80vol％，优选的为70vol％。
S103：采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
其中，液相色谱仪可采用Waters H-class型高效液相色谱仪或Agilent 1290型高效液相色谱仪，但不限于此。液相色谱仪的色谱柱的柱长为100～150mm，直径为2～4mm，色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，其粒径为1.6～1.8μm。示例性的为色谱柱可选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)、Waters CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm，1.6μm)，但不限于此。
其中，液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.08～0.15vol％的磷酸水溶液为流动相B；测定时，色谱柱的柱温为32～38℃，流速为0.18～0.22mL/min，进样量为1～5μL。优选的，液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.1vol％的磷酸水溶液为流动相B；测定时，色谱柱的柱温为35℃，流速为0.2mL/min，进样量为2μL。
其中，液相色谱仪的检测波长为210～235nm，优选的，液相色谱仪的检测波长按下述程序设置：0～10min，检测波长为210nm；10～30.4min，检测波长为235nm；30.4～55min，检测波长为210nm。
其中，梯度洗脱按照下述程序进行：
0～5min，流动相A为30％，流动相B为70％；
5～10min，流动相A从30％→35％，流动相B从70％→65％；
10～25min，流动相A从35％→45％，流动相B从65％→55％；
25～30min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；
30～33min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；
33～38min，流动相A从62％→75％，流动相B从38％→25％；
38～45min，流动相A从75％→90％，流动相B从25％→10％；
45～46min，流动相A为90％，流动相B为10％；
46～50min，流动相A从90％→30％，流动相B从10％→70％；
50～55min，流动相A为30％，流动相B为70％。
具体的，测定后记录各成分的峰面积，以白术内酯Ⅲ为内标物，计算其他8种(环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B)的相对校正因子(fs/k)，fs/k＝fs/fk＝(As×Ck)/(Ak×Cs)，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度。
S200：采用高效液相色谱法测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
具体的，可采用内标法、外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法或面积归一化法进行白术内酯Ⅲ含量的测定。优选的，在本发明的一个实施例之中，白术内酯Ⅲ含量的测定方法如下：
S201：取白术内酯Ⅲ对照品，加甲醇水溶液溶解，得到白术内酯Ⅲ对照品溶液；
其中，甲醇水溶液的浓度为60～80vol％，优选的为70vol％。
需要说明的是，本发明的白术内酯Ⅲ含量的测定方法中，也可采用步骤S102制备得到的第二混合对照品溶液。
S202：取泽泻汤，加70～100vol％的甲醇水溶液提取，得到供试品溶液；
其中，甲醇水溶液的浓度为70～100vol％，优选的为70vol％。提取的方式可为加热回流提取或超声提取，但不限于此；优选的为超声提取。
优选的，在本发明的一个实施例之中，取泽泻汤，加入浓度为70vol％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
S203：吸取白术内酯Ⅲ对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
具体的，测试条件与第二混合对照品溶液的测试条件相同。需要说明的是，在此步骤中，白术内酯Ⅲ对照品溶液和供试品溶液的进样量分别为1～5μL，优选的为2μL。
S300：按照各相对校正因子计算得到泽泻汤中环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的含量。
下面以具体实施例对本发明进行进一步说明：
本发明实施例中所用到的仪器、药品如下：
1、仪器
Waters H-class型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(瑞士METTLERTDLEDO公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司)。
2、试剂
甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
3、试药
9批泽泻汤颗粒由广东一方制药有限公司制备。
对照品：环氧泽泻烯(上海诗丹德标准服务技术有限公司，批号10557，纯度98％)、泽泻醇C(Chem Faces，批号CFS202101，纯度98％)、白术内酯Ⅲ(中国食品药品检定研究院，批号111978-201501，纯度99.9％)、23-乙酰泽泻醇C(成都普菲德生物技术有限公司，批号21020101，纯度99.93％)、白术内酯Ⅱ(中国食品药品检定研究院，批号111976-201501，纯度99.9％)、泽泻醇A(四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkq20091403，纯度98.67％)、泽泻醇B(四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkq21050701，纯度98.45％)、23-乙酰泽泻醇B(中国食品药品检定研究院，批号111846-202006，纯度98.3％)、11-去氧泽泻醇B(成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-21090214，纯度98.37％)。
实施例1泽泻汤一测多评含量检测方法
1色谱条件、对照品溶液、供试品溶液的制备
1.1色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长：210nm(0～10min，环氧泽泻烯)、235nm(10～30.4min，泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ)、210nm(30.4～55min，泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B)；柱温：35℃；流速：0.2mL/min；进样量：2μL。
表1流动相梯度洗脱程序表
1.2对照品溶液的制备
1.2.1混合对照品溶液的制备
分别取环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B对照品适量，精密称定，加70％甲醇水溶液制成质量浓度分别为21.3640μg/mL、23.3240μg/mL、16.3360μg/mL、19.9899μg/mL、22.9674μg/mL、27.0750μg/mL、34.4575μg/mL、42.6622μg/mL、12.8668μg/mL的混合对照品溶液。
1.2.2白术内酯Ⅲ对照品溶液的制备
取白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成质量浓度为8.1680的白术内酯Ⅲ对照品溶液。
1.3供试品溶液的制备
取泽泻汤颗粒适量，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入体积浓度为70％甲醇水溶液50mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2色谱条件的确定
2.1梯度洗脱程序的选择
通过多种梯度洗脱条件对比试验，对洗脱梯度进行优化，具体的梯度洗脱条件见表2～4，测试色谱图如图1-3。由结果可知，采用梯度洗脱程序1时，各色谱峰分离度较差；采用梯度洗脱程序2时，色谱峰响应较低，分布不均匀。而采用梯度洗脱程序3时，色谱峰分离度良好，且响应度较高。最后确定以条件3为最优的梯度洗脱程序。
表2梯度洗脱程序1
表3梯度洗脱程序2
表4梯度洗脱程序3
2.1柱温、流速的选择
本发明选择柱温32℃、35℃、38℃、40℃进行考察，发现随着温度的升高，色谱峰分离度逐渐变差，在柱温达到40℃时，泽泻醇C和白术内酯Ⅲ分离度较差，故柱温可选择32～38℃；选择流速0.18mL/min、0.20mL/min、0.22mL/min、0.25mL/min、0.30mL/min进行考察，发现流速在0.18～0.22mL/min时，各色谱峰分离度均较好，在流速达到0.25mL/min时，分离度较差，故流速可选择0.18～0.22mL/min。
2.2检测波长的选择
通过全波长扫描可得，环氧泽泻烯、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的最大吸收波长在200nm左右，而泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C的最大吸收波长在245nm左右，白术内酯Ⅲ、Ⅱ的最大吸收波长在220nm左右，各成分的最大吸收波长均有差异。综合图谱整体基线的平稳考虑，决定采用切换波长的方式，洗脱时间在0～10min，波长设置为210nm，检测环氧泽泻烯；洗脱时间在10～30.4min，波长设置为235nm，检测泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ；洗脱时间在30.4～47min，波长设置为210nm，检测泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B，在相应的波长下，基线平稳，各成分分离效果较好。
2.3供试品制备
通过考察提取条件来确定供试品的制备，在不同提取方法、不同溶剂浓度甲醇提取得到的溶液直接过微孔滤膜，过滤后直接进样，实验发现采用50％甲醇提取，计算得泽泻汤各成分含量略低，采用70％甲醇和100％甲醇提取，计算得泽泻汤颗粒各成分含量无明显差异；结合色谱图信息，100％甲醇提取的样品色谱图含有较多杂峰，70％甲醇提取的样品色谱图中分离度和峰形均较好，故选择70％甲醇作为提取溶剂。在考察回流法和超声法时发现，两者提取的含量区别不大，故选择较为便捷的超声提取法。
表5不同供试品制备方法含量结果对比(％，n＝3)
3内标组分的选择
泽泻汤颗粒由泽泻、白术两味药组成，通过查阅文献可得，泽泻有效成分主要为泽泻醇类，如泽泻醇A、B、C，23-乙酰泽泻醇A、B、C等；白术主要有效成分为白术内酯类。在本发明限定的色谱条件下，分别吸取“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，分别置10mL量瓶中，加70％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，记录各成分的峰面积，分别以环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B作为内标物，计算其他8种成分的相对校正因子(fs/k)，fs/k＝fs/fk＝(As×Ck)/(Ak×Cs)，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度，结果见表6～14。结果表明，分别以9个成分为内标物，计算各待测组分相对校正因子的RSD均小于3％，结合图谱整体情况，白术内酯Ⅲ峰型良好，保留时间适中，因此以白术内酯Ⅲ为内标组分。
表6各成分相对校正因子1(n＝6)
表7各成分相对校正因子2(n＝6)
表8各成分相对校正因子4(n＝6)
表9各成分相对校正因子4(n＝6)
表10各成分相对校正因子5(n＝6)
表11各成分相对校正因子6(n＝6)
表12各成分相对校正因子7(n＝6)
表13各成分相对校正因子8(n＝6)
表14各成分相对校正因子9(n＝6)
4待测成分色谱峰的定位
在QAMS的应用中，目前常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差法、时间校正法、对照提取物法等。保留时间差法计算公式：Δti/s＝ti-ts。相对保留值法计算公式：ti/s＝ti/ts。本实验采用相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，以白术内酯Ⅲ为内标物，考察其它8种成分在Waters H-class型、Agilent1290型2种高效液相色谱系统，以及Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)、Waters CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm，1.6μm)3种色谱柱下的相对保留时间，结果见表15。采用相对保留值法各成分的RSD均小于3％，表明采用相对保留值法对待测成分的定位是可行的。
表15各成分相对保留时间
实施例2方法学考察
1专属性考察
分别取缺泽泻阴性样品、缺白术阴性样品，按照实施例1中“供试品溶液的制备”的方法分别制备缺泽泻阴性样品溶液、缺白术阴性样品溶液。
精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺泽泻阴性样品溶液、缺白术阴性样品溶液、空白试剂，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见图4～5。结果表明，各成分色谱峰均具有良好的分离度，理论塔板数均不低于5000，与对照品色谱峰保留时间一致，并且未在相应阴性样品中检测出，表明该方法专属性良好。
2线性关系考察
分别吸取实施例1中“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、5.0mL，分别置10mL量瓶中，加70％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果见表16，可知各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
表16线性关系考察结果(n＝6)
3精密度考察
精密吸取实施例1中“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液适量，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，连续进样6针，记录峰面积，结果见表17。计算环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
表17精密度考察结果
4重复性考察
取同一批泽泻汤颗粒适量，按实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下方法平行制备6份供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见表18。计算环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B含量的RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。
表18重复性考察结果(％)
5稳定性考察
精密吸取实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24h时按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见表19。计算环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B峰面积的RSD均小于3％，表明样品在24小时内稳定。
表19稳定性考察结果
6加样回收率试验
取同一批已知含量的泽泻汤颗粒9份，每份约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分为3组，分别按高、中、低浓度精密加入混合对照品溶液适量，按实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表20。计算环氧泽泻烯、泽泻醇C、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的加样回收率在85％～105％以内，均符合药典规定的回收率限度，RSD均小于3％，表明该方法准确度较好。
表20加样回收率试验结果(n＝9)
7系统耐用性考察
7.1不同仪器、色谱柱考察
以白术内酯Ⅲ为内标物，考察其它8种成分在Waters H-class型、Agilent 1290型2种高效液相色谱系统，以及Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)、Waters CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm，1.6μm)3种色谱柱下的相对校正因子，结果见表21，各成分的RSD均小于3％，表明仪器和色谱柱的更换对各成分相对校正因子无显著影响。
表21不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响
7.2不同柱温考察
采用Waters H-class型高效液相色谱仪、Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，考察柱温32、35、38℃对各成分相对校正因子的影响，结果见表22，各成分的RSD均小于3％，表明柱温的波动对各成分相对校正因子无显著影响。
表22不同柱温对相对校正因子的影响
7.3不同流速考察
采用Waters H-class型高效液相色谱仪、Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，考察流速0.18、0.20、0.22mL·min-1对各成分相对校正因子的影响，结果见表23，各成分的RSD均小于3％，表明不同流速对各成分相对校正因子无显著影响。
表23不同流速对相对校正因子的影响
8QAMS法与外标法(ESM)测定结果对比
取9批泽泻汤颗粒样品适量，按实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，分别采用外标法和一测多评法测定各成分含量，利用SPSS 20.0软件对这两组检测结果进行Pearson相关系数(r)分析，结果见表24、25，两种方法之间的相关系数r均为1.000，两种方法计算的含量结果基本一致。环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对标准偏差分别为1.01％～2.22％、0.34％～1.02％、0.00％～1.18％、0.00％～1.45％、0.00％～0.86％、0.69％～1.00％、0.65％～1.35％、0.00％～0.53％，均小于3％，表明两种方法计算结果无显著性差异。
表24外标法与一测多评测定结果比较1(％，n＝3)
表25外标法与一测多评测定结果比较2(％，n＝3)
综上所述，本发明所建立的泽泻汤的检测方法，具有简单、准确，操作方便的优点，能在对照品短缺的情况下用于含量测定，同时可减少溶剂消耗和分析时间，更有利于环境保护。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种泽泻汤的检测方法，其特征在于，包括：
以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
采用液相色谱仪测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
按照各相对校正因子计算得到泽泻汤中环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的含量。
2.如权利要求1所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子的步骤包括：
(1)取环氧泽泻烯对照品、泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅲ对照品、23-乙酰泽泻醇C对照品、白术内酯Ⅱ对照品、泽泻醇A对照品、泽泻醇B对照品、23-乙酰泽泻醇B对照品、11-去氧泽泻醇B对照品，加60～80vol％的甲醇水溶液溶解，得到第一混合对照品溶液；
(2)将所述第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
(3)采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并以白术内酯Ⅲ为内标物，建立环氧泽泻烯、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的相对校正因子；
其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15vol％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱曲线为：
0～5min，流动相A为30％，流动相B为70％；
5～10min，流动相A从30％→35％，流动相B从70％→65％；
10～25min，流动相A从35％→45％，流动相B从65％→55％；
25～30min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；
30～33min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；
33～38min，流动相A从62％→75％，流动相B从38％→25％；
38～45min，流动相A从75％→90％，流动相B从25％→10％；
45～46min，流动相A为90％，流动相B为10％；
46～50min，流动相A从90％→30％，流动相B从10％→70％；
50～55min，流动相A为30％，流动相B为70％。
3.如权利要求2所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述固定相的粒径为1.6～1.8μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100～150mm，直径为2～4mm，柱温为32～38℃，流速为0.18～0.22mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长为210～235nm。
4.如权利要求2或3所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述固定相的粒径为1.7μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100mm，直径为2.1mm，柱温为35℃，流速为0.2mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长按下述程序设置：
0～10min，检测波长为210nm；
10～30.4min，检测波长为235nm；
30.4～55min，检测波长为210nm。
5.如权利要求2所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，采用70vol％的甲醇水溶液溶解对照品。
6.如权利要求1所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述采用液相色谱仪测定泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量的步骤包括：
(i)取白术内酯Ⅲ对照品，加甲醇水溶液溶解，得到白术内酯Ⅲ对照品溶液；
(ii)取泽泻汤，加浓度为70～100vol％的甲醇水溶液提取，得到供试品溶液；
(iii)吸取所述白术内酯Ⅲ对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到泽泻汤中白术内酯Ⅲ的含量；
其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15vol％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱曲线为：
0～5min，流动相A为30％，流动相B为70％；
5～10min，流动相A从30％→35％，流动相B从70％→65％；
10～25min，流动相A从35％→45％，流动相B从65％→55％；
25～30min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；
30～33min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；
33～38min，流动相A从62％→75％，流动相B从38％→25％；
38～45min，流动相A从75％→90％，流动相B从25％→10％；
45～46min，流动相A为90％，流动相B为10％；
46～50min，流动相A从90％→30％，流动相B从10％→70％；
50～55min，流动相A为30％，流动相B为70％。
7.如权利要求6所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述固定相的粒径为1.6～1.8μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100～150mm，直径为2～4mm，柱温为32～38℃，流速为0.18～0.22mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长为210～235nm。
8.如权利要求6或7所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述固定相的粒径为1.7μm；
所述液相色谱仪的色谱柱的柱长为100mm，直径为2.1mm，柱温为35℃，流速为0.2mL/min；
所述液相色谱仪的检测波长按下述程序设置：
0～10min，检测波长为210nm；
10～30.4min，检测波长为235nm；
30.4～55min，检测波长为210nm。
9.如权利要求6所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，步骤(ii)中，取泽泻汤，加入70vol％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
10.如权利要求1所述的泽泻汤的检测方法，其特征在于，所述泽泻汤主要包括以下组分：泽泻、白术、辅料；
所述泽泻汤被制备成汤剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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