CN116297987B - 一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法 - Google Patents

一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，主要包括以下步骤：供试品溶液的制备；混合对照品溶液的制备；高效液相色谱检测；含量测定；该方法可以同时测定没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚等8种成分的含量；该方法效率高、操作简单，准确可靠、稳定性高，对于心痛舒喷雾剂质量的控制与提升及临床的推广与应用具有重要价值。

Description

一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法
技术领域
本发明属于中药分析检测领域，具体涉及一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法。
背景技术
心痛舒喷雾剂是由牡丹皮、川芎及冰片三味中药制备而成，批准文号：国药准字Z20194075，在临床上被用于治疗痰浊瘀血痹阻心脉而致的冠心病心绞痛，其经舌下喷雾给药，被毛细血管吸收后直接进入体循环，起效快，在心血管病急救方面具有独特优势。牡丹皮具有活血化瘀的功效，现代药理研究表明，牡丹皮中丹皮酚等通过抑制血小板聚集、抗调理素以及稳定红细胞膜等抑制血栓的形成。川芎被广泛应用于治疗痰浊瘀血痹阻心脉而致的心脑血管病的中药复方中，王清任著《医林改错》一书中被后世总概为“五逐瘀汤”的5种方剂中，川芎均被使用，由此可见，川芎在活血化瘀理论中扮演着重要角色。冰片则对其他药物有促进吸收、影响分布、抑制代谢的作用, 有利于减少用药量, 延长药物作用时间,从而提高药物疗效。由此可见心痛舒喷雾剂虽然只有简单的三味中药，但却配伍精妙，各味中药相辅相成，共同发挥药效作用。
中药复方具有多成分、多靶点、综合作用的特点，药效物质成分复杂；且中药复方药效的发挥并不以单一或含量高的成分所决定，而是多成分协同作用的结果。因此为保障中药复方质量及临床药效的发挥，有必要对其进行多成分的含量测定。心痛舒喷雾剂现行的质量标准收载于国家药品标准新药转正标准第42册，仅对丹皮酚一个成分进行了含量测定，无法反映出整体的质量情况。查阅国内外文献和专利，也未发现关于心痛舒喷雾剂的多成分质量控制方法，因此亟待建立一种简单、快捷、准确的多成分含量测定的方法，以应用于心痛舒喷雾剂的质量控制及提升。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法。本发明采用HPLC法，可以同时对没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚等8种具有心血管保护作用的成分进行含量测定，并且检测时间短，准确性高，对于心痛舒喷雾剂质量的控制与提升及临床的推广与应用具有重要价值。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，包括如下步骤：
（a）供试品溶液的制备：精密吸取心痛舒喷雾剂药液至容量瓶中，加入甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得供试品溶液；
（b）对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚至容量瓶中，加甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得混合对照品溶液；
（c）色谱条件的确定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；体积流量为0.8 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL；梯度洗脱程序为：0～10min，10%～15%A；10～24min，15%～25%A；24～28min，25%～26%A；28～30min，26%～30%A；30～48min，30%～57%A；48～52min，57%～80%A；52～57min，80%～10%A；57～62min，10%A；检测波长为254nm和320nm；
（d）含量测定：分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，依上述色谱条件进行测定，建立各对照品的回归方程，按外标法计算即得。
优选地，步骤(a)中，所述甲醇的质量浓度为 70%～80%，释倍数为15～25倍。
优选地，步骤(b)中，所述甲醇的质量浓度为70%～80%。
优选地，步骤(c)中，色谱柱为East Laboratory Epic C18，规格为4.6 mm×250mm，5 μm。
优选地，步骤(d)中，
所述没食子酸的回归方程为Y=22955X-17352，相关系数R2为0.9999；
所述氧化芍药苷的回归方程为Y=18565X-10553，相关系数R2为0.9998；
所述绿原酸的回归方程为Y=32060X-60291，相关系数R2为0.9996；
所诉咖啡酸的回归方程为Y=61547X-9294.9，相关系数R2为1.0000；
所述芍药苷的回归方程为Y=1595.1X-3378，相关系数R2为0.9999；
所述阿魏酸的回归方程为Y=62521X-12764，相关系数R2为1.0000；
所述洋川芎内脂I的回归方程为Y=29271X+622.81，相关系数R2为1.0000；
所述丹皮酚的回归方程为Y=16507X+35425，相关系数R2为1.0000。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明采用HPLC法，首次建立了心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，该方法准确性高、方便快捷、易于操作，非常适用于该制剂的质量检测与控制。与现有技术相比，本发明能够同时对8种成分进行含量测定，解决了心痛舒喷雾剂质控成分单一的问题，能够高效、全面的反映制剂整体的质量情况。本发明分析时间短，在62 min之内即可完成8种成分的定量，对于具有复杂成分的中药复方制剂而言较为高效，节约了分析成本，减少了溶剂使用量，便于企业应用。
附图说明
图1是在254 nm检测波长下专属性试验的色谱图，其中：1-没食子酸；2-氧化芍药苷；5-芍药苷；7-洋川芎内酯I；8-丹皮酚；
图2是在320 nm检测波长下专属性试验的色谱图，其中：3-绿原酸；4-咖啡酸；6-阿魏酸；
图3是采用不同检测波长的供试品色谱图；
图4是在254 nm检测波长下，采用不同流动相的供试品色谱图；
图5是在320 nm检测波长下，采用不同流动相的供试品色谱图；
图6是在254 nm检测波长下，采用不同柱温的供试品色谱图；
图7是在320 nm检测波长下，采用不同柱温的供试品色谱图；
图8是在254 nm检测波长下，采用不同流速的供试品色谱图；
图9是在320 nm检测波长下，采用不同流速的供试品色谱图；
图10是在254 nm检测波长下，采用不同稀释溶剂的供试品色谱图；
图11是在254 nm检测波长下，采用不同梯度洗脱程序的供试品色谱图。
实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例
1仪器与试药
1.1仪器
Waters 2489型高效液相色谱仪(美国Waters公司); YL-060ST型超声波清洗器(深圳市语路清洗设备有限公司)；AB135-S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；
1.2试药
心痛舒喷雾剂供试品13批（批号分别为20221001、20221002、20221003、20221004、20221005、20221006、20221007、20221008、20221009、20221010，20220101、20220201、20220202，编号S1-S13，均由华佗国药股份有限公司提供）；牡丹皮、川芎、冰片药材，均由华佗国药股份有限公司提供；没食子酸（批号J05GB153704）、氧化芍药苷（批号N26GB169459）、绿原酸（批号A22GB158496）、阿魏酸（批号G13S11L124423）、洋川芎内酯I（批号PZ7A11F122339）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98.0%；咖啡酸（批号PS010522）、芍药苷（批号PS000825）、丹皮酚（批号PS000281）对照品均购于成都普思生物科技有限公司，纯度均≥98.0%；乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯）均购自上海安耐吉科技有限公司、甲酸（分析纯），水为哇哈哈纯净水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为East Laboratory Epic C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B);体积流量为0.8 mL/min;柱温为30℃;进样量为10 μL;梯度洗脱程序：0～10min,10%～15%A;10～24min,15%～25%A;24～28min,25%～26%A;28～30min,26%～30%A;30～48min,30%～57%A;48～52min,57%～80%A;52～57min,80%～10%A;57～62min,10%A；检测波长为254 nm、320 nm(选择254nm作为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯I、丹皮酚的检测波长，320nm作为绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的检测波长)。
2.2溶液的制备
2.2.1供试品溶液的制备
精密吸取心痛舒喷雾剂药液1mL，至20 mL容量瓶中，加入75%甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
2.2.2混合对照品溶液的制备
精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚对照品适量至容量瓶中，加入75%甲醇制备成浓度分别为0.0690、0.0728、0.0348、0.0110、0.3660、0.0242、0.0314、0.3790 mg/mL的混合对照品溶液。
2.2.3阴性样品溶液制备
按照处方中各药材比例与制备工艺，制得缺川芎、缺牡丹皮的阴性样品，按“2.2.1”项下方法制备，即得阴性样品溶液。
2.3专属性试验
取空白溶剂、混合对照品溶液、S1批次供试品溶液及阴性样品溶液按2.1色谱条件检测并记录色谱图。如图1、2所示，在254nm波长下的没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯I、丹皮酚及在320nm波长下的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等8个成分的色谱峰理论塔板数均大于5000，分离度均大于1.50。空白溶剂基线平整，除溶剂峰外无干扰峰，在各对照品成分的相应位置，供试品中均有色谱峰与之对应，阴性样品中也无色谱峰干扰，表明该方法的专属性较好，可以用于含量测定。
2.4 线性关系考察
精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液1、1.5、2、2.5、4、5 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液按2.1项下色谱条件进样分析，以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，获得各成分的回归方程和线性范围，同时测定检测限LOD（S/N=3）和定量限LOQ（S/N=10），结果见表1。
表 1线性关系考察
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验
取2.2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚的峰面积RSD分别为0.02%、0.09%、0.06%、0.05%、0.20%、0.10%、0.11%、0.14%，表明仪器精密度较好，结果见表2。
表 2精密度实验结果
2.5.2 稳定性试验
取S1号供试品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按2.1项下色谱条件进行检测，记录色谱图，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚的峰面积RSD分别为0.22%、0.33%、0.26%、0.17%、0.48%、0.20%、0.16%、0.10%，表明供试品在24小时之内稳定性较好，结果见表3。
表 3稳定性试验结果
2.5.3 重复性试验
取S1号供试品，按2.2.1项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进行检测，记录色谱图，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚的峰面积RSD分别为0.51%、0.14%、0.26%、0.17%、1.03%、0.20%、1.70%、0.44%，表明方法重复性较好，结果见表4。
表 4重复性试验结果
2.5.4加样回收试验
取各对照品适量，用75%甲醇配制成没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚质量浓度分别为0.704、0.874、0.351、0.106、2.900、0.197、0.309、3.780 mg/mL的混合对照品溶液，精密吸取混合对照品和已知浓度的S1批次供试品溶液各0.5 ml，置于20 ml容量瓶中，加75%乙醇稀释至刻度，平行制备6份。按2.1项下色谱条件进样分析，计算加样回收率，结果见表5。
表 5加样回收试验结果
2.6 样品含量测定
取S1-S13批次供试品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，记录各待测成分的峰面积，带入回归方程中计算含量，结果见表6。
表 6含量测定结果
3 色谱条件的优化
3.1 波长的优化
本发明考察了230 nm、240 nm、254 nm、260 nm、270 nm、280 nm、300 nm、320 nm等8种不同的检测波长。同时参考相关文献，没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚等8种成分的最大吸收波长分别为271 nm、258 nm、326 nm、323 nm、230 nm、323 nm、278 nm、274 nm。结合各成分最大吸收波长及实际测定结果，最终采用254和320 nm双波长法进行检测。选择254nm作为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯I、丹皮酚等5种成分的检测波长，320nm作为绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等3种成分的检测波长。各波长下供试品溶液色谱图见图3。
3.2流动相的优化
本发明考察了甲醇(A)-水(B)、甲醇(A)-0.1%甲酸(B)、乙腈(A)-水(B)、乙腈(A)-0.1%甲酸(B)四种不同的流动相体系，如图4、5所示，由于甲醇-水流动相体系比乙腈-水流动相体系洗脱能力弱，色谱峰较靠后，增加了分析时间，因此选择了洗脱能力较强的乙腈-水流动相体系；对比乙腈-水与乙腈-0.1%甲酸流动相体系又可发现，在水相中添加了0.1%的甲酸后，色谱峰的数目和响应均有所增加，因此最终选择乙腈(A)-0.1%甲酸(B)为流动相。
3.3 柱温的优化
本发明考察了25℃、30℃、35℃三种不同的柱温，如图6、7所示，柱温在30℃时，色谱图峰型均较为对称，分离度均好，故最终选择30℃作为本发明的色谱柱柱温。
3.4 流速的优化
本发明考察了0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min三种不同的流速，如图8、9所示，随着流速的提高，样品出峰时间也随之提前，峰面积随之降低，但流速为0.8 mL/min时，色谱峰的分离度最好，峰面积最大，也较节省溶剂，因此流速最终选择0.8 mL/min。
3.5 供试品稀释溶剂的优化
本发明考察了10%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇四种不同的供试品稀释溶剂，如图10所示，在254 nm检测波长时，当采用10%甲醇和50%甲醇做稀释溶剂时，色谱图峰面积降低，可能的原因是心痛舒喷雾剂中绝大多数成分为脂溶性成分，当稀释溶剂中水的含量升高时导致脂溶性成分不溶解，色谱峰面积降低；当采用甲醇作为样品稀释溶剂时，没食子酸色谱峰发生了前沿与分叉，推测产生了溶剂化效应。故最终选择75%甲醇作为稀释溶剂，色谱图峰型较为对称。
3.6 梯度洗脱程序的优化
本发明考察了7种不同的梯度洗脱程序，因在254 nm检测波长时色谱峰的信息较丰富，且待测的8种成分均有响应，故以254 nm检测波长时色谱图为例来阐述梯度洗脱程序的优化过程。
如图11所示，方法1和方法2色谱峰较少，很多化学成分没有响应，分离度较低；方法3基于方法2进行改进，可见色谱峰增加，但在保留时间28.5 min和30.5 min处出现变形峰；方法4较方法3进一步优化，但在保留时间26.5 min处分离度较差；方法5和方法6较方法4增加了有机相比例和洗脱时间，发现在牡丹皮峰之后还有上述方法下未洗脱出来的色谱峰；方法7较方法6进一步优化，洗脱时间增至62 min，最高有机相比例增至80%，各色谱峰分离度较好，出峰多，方法稳定，故最终选择方法7为本发明的梯度洗脱程序。
方法1：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～8min,10%～12%A; 8～20min,12%～25%A;20-40min,25%～45%A;40～45min,45%～70%A;45～50min,70%～10%A;50～55min,10%A。
方法2：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A;10～30min,15%～30%A;30-40min,30%～60%A;40～45min,60%～10%A;45～50min,10%A。
方法3：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A;10～30min,15%～25%A;30-40min,25%～60%A;40～45min,60%～10%A;45～50min,10%A。
方法4：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A;10～24min,15%～25%A;24-28min,25%～26%A;28～30min,26%～30%A;30～40min,30%～60%A，40～45min,60%～10%A;45～50min,10%A。
方法5：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A;10～24min,15%～25%A;24-28min,25%～25%A;28～30min,25%～30%A;30～45min,30%～75%A，45～50min,75%～10%A;50～55min,10%A。
方法6：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A;10～24min,15%～25%A;24-28min,25%～26%A;28～30min,26%～30%A;30～50min,30%～60%A，50～55min,60%～10%A;55～60min,10%A。
方法7：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，0～10min,10%～15%A; 10～24min,15%～25%A;24-28min,25%～26%A;28～30min,26%～30%A;30～48min,30%～57%A;48～52min,57%～80%A;52～57min,80%～10%A;57～62min,10%A。

Claims (5)

1.一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）供试品溶液的制备：精密吸取心痛舒喷雾剂药液至容量瓶中，加入甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得供试品溶液；
（b）对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚至容量瓶中，加甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得混合对照品溶液；
（c）色谱条件的确定：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈,流动相B为0 .1%甲酸；体积流量为0 .8 mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；梯度洗脱程序为：0～10min，10%～15%A；10～24min，15%～25%A；24～28min，25%～26%A；28～30min，26%～30%A；30～48min， 30%～57%A；48～52min，57%～80%A；52～57min，80%～10%A；57～62min，10%A； 选择254nm作为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、洋川芎内酯I、 丹皮酚的检测波长，320nm作为绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的检测波长；
（d）含量测定：分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，依上述色谱条件进行测定，建立各对照品的回归方程，按外标法计算供试品溶液中没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚的含量。
2.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述甲醇的质量浓度为 70%～80%，稀释倍数为15～25倍。
3.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述甲醇的质量浓度为70%～80%。
4.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，其特征在于，步骤(c)中，色谱柱为East Laboratory Epic C18，规格为4.6 mm×250 mm，5μm。
5.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂中多成分含量测定的方法，其特征在于，步骤（d）中，
没食子酸的回归方程为Y=22955X-17352，相关系数R2为0.9999；
氧化芍药苷的回归方程为Y=18565X-10553，相关系数R2为0.9998；
绿原酸的回归方程为Y=32060X-60291，相关系数R2为0.9996；
咖啡酸的回归方程为Y=61547X-9294 .9，相关系数R2为1.0000；
芍药苷的回归方程为Y=1595.1X-3378，相关系数R2为0.9999；
阿魏酸的回归方程为Y=62521X-12764，相关系数R2为1.0000；
洋川芎内酯I的回归方程为Y=29271X+622.81，相关系数R2为1.0000；
丹皮酚的回归方程为Y=16507X+35425，相关系数R2为1.0000。
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