CN104597157B

CN104597157B - 一种脂溶性铂配合物及其制剂有关物质的测定方法

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Publication number: CN104597157B
Application number: CN201510022751.8A
Authority: CN
Inventors: 郭勇; 南艳平; 郝福; 邵玉平; 李志刚
Original assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2015-01-17
Filing date: 2015-01-17
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2035-01-17
Also published as: CN104597157A

Abstract

本发明涉及一种脂溶性铂配合物及其制剂有关物质的测定方法，检测方法为高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)色谱柱；A相为甲醇-乙醇混合溶剂，B相为水与甲醇或乙醇的混合溶剂，进行梯度洗脱；柱温为38℃～42℃；检测波长为208～215nm；流速为0.5～2.0ml/min。采用本发明的高效液相色谱分析方法，可以准确测定样品中杂质A的含量及其他未知杂质的含量，分析过程中各杂质分离度较好，分析结果重现性好，为米铂及其制剂质量控制分析提供了简单可靠的方法。

Description

一种脂溶性铂配合物及其制剂有关物质的测定方法

技术领域

本发明涉及一种米铂原料药及其制剂的有关物质检测方法，更具体的说是通过高效液相色谱法检测米铂原料及冻干粉针中有关物质的方法。

背景技术

在药物分析中所称的“有关物质(relatedsubstances)”是指特定药物中不是主要组成物，但与成份相关的物质。由于一种药品从合成原料药到制备有关的制剂，再经贮藏、运输、使用，要经历一段较为复杂和漫长的过程，在此期间，每一过程都有可能产生有关的物质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中，可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。为保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，因此，国内外对药物的研究，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，能危害人体健康的、无效的或能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。因此有关物质检测是控制药品质量的重要指标。

米铂(Miripla)是日本住友公司开发的一种新型脂溶性铂类抗肿瘤药物，其化学名称为顺式-[双十四烷酸-(1R，2R)-1，2-环己二胺合铂(Ⅱ)]单水合物，结构式为：

米铂原料及其制剂的有关物质检测难度在于合成过程中产生的多种工艺杂质，通过纯化后与主成分难于分离。经研究发现米铂原料及其制剂中主要含有四种已知杂质，分别为：

(1)杂质A：十四酸

(2)杂质B：双水[(1R,2R)-1,2-环己二胺-N,N’]合铂二硝酸盐

(3)杂质C：(SP-4-2)-[(1S,2S)-1,2环己二氨-N,N’]二(十四酸-O)合铂一水合物

(4)杂质D：(SP-4-2)-[(1S,2R)-1,2环己二氨-N,N’]二(十四酸-O)合铂一水合物

其中，杂质A为脂溶性成分，杂质B为水溶性成分，杂质C和D为手性杂质应首选手性色谱柱进行测定。

中国专利申请201410151902.5提供了一种米铂杂质的检测方法，对于手性杂质的检测该专利提供了一种使用SUMICHIRALOA-2500(4.6mm×250mm5μm)色谱柱，以正己烷-甲醇-乙醇(97:3:0.5)为流动相的检测方法；对于其他杂质的检测该申请提供一种以甲醇：乙醇(80:20)为流动相的等度检测方法。申请人对中国专利申请201410151902.5提供的有关物质检测方法进行了重复，发现采用该色谱条件检测，杂质A的色谱峰与溶剂峰重叠，杂质A不能有效检出，因此采用等度洗脱条件实现杂质A峰和溶剂峰分离比较困难。本发明采用普通的C18色谱柱，通过调整流动相并采用梯度洗脱法实现了溶剂峰、杂质A及其他多个未知杂质有效分离，分离度达1.5以上，为米铂原料药及制剂的质量控制提供了一种可靠的方法。

发明内容

为了克服现有技术存在的技术缺陷，实现用高效液相色谱法一次进样可以检测米铂及其制剂多种有关物质的技术方案，本发明提供了一种用高效液相色谱法一次进样检测米铂及其制剂中米铂含量及若干有关物质的技术方案，本发明采用梯度洗脱条件实现溶剂峰和杂质A及其他未知杂质的有效分离，各吸收峰的分离度大于1.5。

本发明采用如下技术方案实现本发明目的：

一种用高效液相色谱检测米铂原料及制剂中有关物质的方法，采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；检测波长208～215nm；柱温为38～42℃；流速为0.5～2.0ml/min；流动相A是甲醇和乙醇的混合溶剂，体积比为70:30～95:5；流动相B是水和流动相A的混合溶剂，体积比为70:30～95:5；进行梯度洗脱，梯度条件为：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0～15	80～90	20～10

15～20	85～100	15～0
			20～40	100	0
40～55	85～100	15～0
			55～65	80～90	20～10

其中，梯度条件优选：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0～15	85	15
15～20	85～100	15～0
			20～40	100	0
40～55	85～100	15～0
			55～65	85	15

梯度条件更优选：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0	85	15
15	85	15
			17	100	0
47	100	0
			50	85	15
65	85	15

本发明提供的上述米铂及其制剂有关物质的检测方法，其中，流动相A，甲醇和乙醇的混合体积比优选75:25～90:10，更优选80:20；流动相B，水和流动相A的混合体积比为75:25～90:10，更优选80:20。

本发明提到的柱温是根据方法耐用性实验确定的，即本方法在柱温在38～42℃范围内调整，测试结果没有显著影响，本发明柱温优选40℃；

本发明提到的检测方法，其流动相流速设定为一般技术人员公知的常识，常见的范围一般为0.5ml/min至2ml/min，本发明优选0.9～1.1ml/min，更优选1.0ml/min。

本发明设定的检测波长通过以下方法确定：

取杂质A(十四酸)对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加无水乙醇适量，超声使其溶解，并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，以无水乙醇为空白溶剂，使用紫外分光光度计测定杂质A的最大吸收波长，结果见表1和图1。

表1杂质A的紫外吸收

序号	波长	吸收
			1	208.00	0.200
2	210.00	0.203
			3	212.00	0.220
4	215.00	0.206
			5	230.00	0.080

取米铂样品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加无水乙醇适量，超声使其溶解，并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，以无水乙醇为空白溶剂，使用紫外分光光度计测定米铂的最大吸收波长，结果见表2和图2。

表2米铂的紫外吸收

序号	波长	吸收
			1	200.00	0.542
2	205.00	0.789
			3	208.00	0.810
4	210.00	0.809
			5	212.00	0.789
6	215.00	0.757

综合杂质A与米铂的最大吸收波长均在210nm左右，因此最终选定波长为208～215nm为本发明的检测波长，优选波长为210nm。

另外，申请人对本发明中国专利申请201410151902.5提供的有关物质检测方法和本发明方法做了对比研究，结果如下：

1.中国专利申请201410151902.5米铂有关物质检测方法

按中国专利申请201410151902.5米铂有关物质检测方法，检测空白溶液和米铂样品，分别获得的色谱图图3及图4。从图中可以看出采用该法(等度)，保留时间在3.3左右较大的杂质的峰与溶剂峰无法有效分离，经对照试验分析该峰为A杂质。

2.本发明米铂杂质A及其他未知杂质检测方法

1)仪器信息

HPLC：二元高压高效液相色谱仪，配紫外检测器(安捷伦1260)；四元低压高效液相色谱仪，配DAD检测器(安捷伦1200)；分析天平：MS-105DU(瑞士梅特勒-托利多)；恒温水浴锅：DZKW-4型(北京中兴伟业仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB(昆山市超声仪器有限公司)；光照试验箱：SHH-200GD-I(重庆永生实验仪器厂)。

2)试剂、对照品、材料

甲醇：色谱纯(Fisher，批号122706)；乙醇：色谱纯(Fisher，批号138083)；水：超纯水；色谱柱：安捷伦SBC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；米铂原料药：批号20130712-MB(干燥失重为2.66％)；杂质A对照品：自制，批号20130311。

3)分析方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相：甲醇：乙醇(4:1)，B相：甲醇：乙醇：水(4:1:20)；流速1.0mL/min；进样量20μL；柱温40℃；检测波长为210nm。理论塔板数按杂质A计不低于2000。梯度时间如下：

测定法取米铂原料药约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加适量色谱乙醇超声使溶解，并用乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过作为供试品溶液。另取杂质A对照品适量，精密称定，用乙醇配制成含杂质A对照品为5.0μg/mL的溶液，作为对照品溶液。取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质A，其他杂质用峰面积归一化法计算。其中，空白溶液为图5、对照品溶液为图6，其中保留时间6.637峰即为杂质A，供试品溶液色谱图为图7(全图)、图8(局部图)；本方法对米铂原料中的已知杂质A及其他未知杂质的分离情况见表3。

表3本发明方法对米铂杂质的分离情况

由上述色谱图及表1可知，本发明方法可以实现杂质A与溶剂峰的有效分离；实现米铂、杂质A及其他8个未知杂质的有效分离，分离度基本在1.5以上，符合相关要求。

4)方法验证

A.系统适用性实验：

取杂质A对照品，照上述色谱条件，连续进针5针，对照品溶液中杂质A峰面积的RSD为2.71％，理论塔板数为6039，系统适用性试验符合要求。

B.专属性实验

考察米铂的降解研究，强制降解条件包括酸、碱、氧化、高温和光照，具体降解试验如下：

酸破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入0.1mol/L盐酸溶液10μL，室温放置30min，用0.1mol/L氢氧化钠溶液10μL中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏供试品溶液，按照米铂杂质A及其他未知杂质测定方法进样检测，记录色谱图。在本条件下降解生成未知单杂1和杂质A，未知单杂1为4.27％；杂质A为6.32％，主峰降解13.61％，说明米铂在酸中不稳定，降解峰分离度符合规定。

碱破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液30μL，室温放置60min，用0.1mol/L盐酸溶液30μL中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏供试品溶液，按照米铂杂质A及其他未知杂质测定方法进样检测，记录色谱图。在本条件下降解生成未知单杂1为4.65％，主峰降解9.07％，说明米铂在碱中不稳定，降解峰分离度符合规定。

氧化破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入3％的过氧化氢溶液20μL，室温放置30min，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏供试品溶液，按照制剂有关物质测定方法进样检测，记录色谱图。在本条件下降解生成多个未知杂质，主峰降解19.78％，说明米铂在氧化条件下不稳定，降解峰分离度符合规定。

高温破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，密封。40℃水浴放置1h，放冷至室温，作为高温破坏供试品溶液，按照米铂杂质A及其他未知杂质测定方法进行检测，记录色谱图。在本条件下降解生成未知单杂1和杂质A，单杂1为0.45％,杂质A为5.51％，主峰降解11.32％，说明米铂在高温中不稳定，降解峰分离度符合规定。

光照破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，密封。平行两份，一份用锡箔纸包裹，作为光照破坏的随行对照品溶液。将两份样品溶液于温度20℃下放置，以4500±500Lux的强光照射24h，作为光照破坏供试品溶液，按照米铂杂质A及其他未知杂质测定方法进行检测，记录色谱图。在光照破坏条件下降解生成未知单杂1和杂质A，未知单杂1为0.40％，杂质A含量为10.34％，主峰降解18.03％，光照参比在遮光的条件下也降解生成未知单杂1和杂质A，未知单杂1为0.50％，杂质A含量为7.78％，主峰降解16.77％。

表4杂质A及其他未知杂质测定方法-专属性实验结果

由上可知，米铂在酸、高温、光照条件下有降解杂质生成，米铂在各条件下生成的降解产物分离度良好，表明本方法专属性良好。

C.定量限、检测限

对照品溶液的配制：取杂质A对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，照对照品溶液的制备方法，配制成每1mL约含杂质A2μg/mL的溶液，进样分析，结果以信噪比为10:1计，杂质A的定量限为2.048μg/mL，取定量限溶液，进样10μL，结果以信噪比3:1计，杂质A的检测限为1.024μg/mL。

D.线性

取米铂样品，配制成0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL的溶液，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝6,114,328x+2,120,501；相关系数R²＝1.000，结果表明米铂在0.5～1.2mg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

取杂质A，配制成2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL的溶液，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝1265.1x+91.8；相关系数R²＝0.999，结果表明杂质A在2～10μg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

E.回收率

回收率研究需要单独制备低(40％)、中(100％)、高(200％)3个水平的加样溶液，称取杂质A对照品配制成浓度为100μg/mL的储备溶液，量取储备溶液用乙醇分别稀释成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的乙醇溶液。取10份米铂原料样品每份约10mg，精密称定，其中一份用乙醇溶解制备成未加标的样品溶液，其余9份分别用3份2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的杂质A的乙醇溶液溶解并稀释至刻度，按照供试品溶液制备方法，进样检测，记录色谱图。以外标法计算测得量，进而计算回收率。结果表明，低、中、高水平的回收率RSD值在5.0％以内，平均回收率在90.0％～110.0％范围内，表明本方法的准确度良好。

F.重复性

取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，按照供试品溶液的制备方法，平行配制6份样品溶液。按外标法测定每份样品杂质A的含量，用面积归一化法计算其他未知杂质的含量，加上杂质A的含量是总杂的含量，计算含量RSD。结果表明6份供试品的杂质A含量的RSD值为7.07％，总杂含量的RSD为2.17％，表明本方法的重复性良好。

G.耐用性

耐用性研究是通过对色谱条件作较小的改动，以确定这些改动是否会对图谱有较大的影响。按照下表进行耐用性研究，在所改变的条件下，分别进行系统适用性考察，其中标准条件用的是重复性试验的实验结果，结果见下表。

表5杂质A及其他未知杂质测定方法-耐用性研究结果

考察微小柱温和流速对米铂杂质A及总杂含量的影响。结果显示，较小改变柱温、流速，杂质A含量、其他未知杂质的含量和相对于标准条件无明显的变化，其RSD值均小于10％，表明该方法在上述条件内做微小调整，对测试结果没有显著影响。

考察在进样0～15分钟内、55～65分钟内变动A相与B相比例对米铂杂质A及总杂含量的影响。结果显示，较小变动A相与B相比例对杂质A含量、其他未知杂质的含量和相对于标准条件无明显的变化，其RSD值均小于10％。

综上，方法验证结果显示，本方法重复性好、准确度高、具有较好的耐用性，满足米铂原料药杂质A及其他未知杂质含量测定的需要。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下分离米铂及其制剂的有关物质，其中包括已知杂质A和其他8个未知杂质，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率，适合工业大生产的要求。

(2)本发明的方法既可有效检出各已知有关物质，又能根据其响应因子准确检测上述已知有关物质的含量，杂质A与溶剂峰、杂质A与米铂及其未知杂质之间均有较好分离，为控制米铂原料药及其制剂的质量提供一个有效准确的检测方法。

(3)本发明的方法耐用性好，容易实现，所用仪器设备及试剂均是常规用品，试验参数也是常规参数，无苛刻条件，成本低，大多数实验室的条件均能满足。

附图

附图1：杂质A紫外扫描图；

附图2：米铂紫外扫描图；

附图3：专利201410151902.5米铂有关物质检测方法的空白溶剂色谱图；

附图4：专利201410151902.5米铂有关物质检测方法的米铂样品色谱图；

附图5：本发明方法米铂杂质A及其他未知杂质检测方法的空白溶剂色谱图；

附图6：本发明方法米铂杂质A及其他未知杂质检测方法的杂质A色谱图；

附图7：本发明方法米铂杂质A及其他未知杂质检测方法的米铂样品色谱图(全图)；

附图8：本发明方法米铂杂质A及其他未知杂质检测方法的米铂样品色谱图(局部图)。

具体实施方案

下面通过实施例来进一步解释和说明本发明。本发明的实施例仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法的基础上对本发明的简单改进或替换均属本发明要求保护的范围。

以下实施例中检测用米铂原料由实验室自己合成，冻干粉针为原研制剂。

实施例1

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相：甲醇：乙醇(7:3)，B相：甲醇：乙醇：水(7:3:40)；流速1.0mL/min；进样量20μL；柱温40℃；检测波长为210nm。理论塔板数按杂质A计不低于2000。梯度时间如下：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0	85	15

15	85	15
			20	100	0
50	100	0
			55	85	15
65	85	15

测定法取米铂原料药约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加适量色谱乙醇超声使溶解，并用乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过作为供试品溶液。取供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质A，其他杂质用峰面积归一化法计算。本方法对米铂原料中的已知杂质A及其他未知杂质的分离均大于1.5，符合要求。

方法验证

A.系统适用性实验：

取杂质A对照品，照上述色谱条件，连续进针5针，对照品溶液中杂质A峰面积的RSD为6.24％，理论塔板数为4724，系统适用性试验符合要求。

B.专属性实验

酸破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入0.1mol/L盐酸溶液10μL，室温放置30min，用0.1mol/L氢氧化钠溶液10μL中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏供试品溶液，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂酸降解峰分离度符合规定。

碱破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液30μL，室温放置60min，用0.1mol/L盐酸溶液30μL中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏供试品溶液，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂碱降解峰分离度符合规定。

氧化破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，加入3％的过氧化氢溶液20μL，室温放置30min，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏供试品溶液，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂在氧化条件下降解峰分离度符合规定。

高温破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，密封。40℃水浴放置1h，放冷至室温，作为高温破坏供试品溶液，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂在高温中降解峰分离度符合规定。

光照破坏：取米铂样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量乙醇强力振摇后超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，密封。平行两份，一份用锡箔纸包裹，作为光照破坏的随行对照品溶液。将两份样品溶液于温度20℃下放置，以4500±500Lux的强光照射24h，作为光照破坏供试品溶液，按照上述方法检测，记录色谱图。降解峰分离度符合规定。

C.定量限、检测限

对照品溶液的配制：取杂质A对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，照对照品溶液的制备方法，配制成每1mL约含杂质A2μg/mL的溶液，进样分析，结果以信噪比为10:1计，杂质A的定量限为2.613μg/mL，取定量限溶液，进样10μL，结果以信噪比3:1计，杂质A的检测限为1.327μg/mL。

D.线性

取米铂样品，配制成0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL的溶液，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝5,712,468x+3,157,344；相关系数R²＝0.998，结果表明米铂在0.5～1.2mg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

取杂质A，配制成2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL的溶液，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝2767,3x+121.4；相关系数R²＝0.999，结果表明杂质A在2～10μg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

E.回收率

F.重复性

取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，按照供试品溶液的制备方法，平行配制6份样品溶液。按外标法测定每份样品杂质A的含量，用面积归一化法计算其他未知杂质的含量，加上杂质A的含量是总杂的含量，计算含量RSD。结果表明6份供试品的杂质A含量的RSD值为8.37％，总杂含量的RSD为3.29％，表明本方法的重复性良好。

实施例2

流动相：A相：甲醇：乙醇(95:5)，B相：甲醇：乙醇：水(95:5:400)；。

梯度时间如下：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0	85	15
15	85	15
			20	100	0
50	100	0
			55	85	15
65	85	15

其他色谱条件同实施例1。

测定法同实施1。

本方法对米铂原料中的已知杂质A及其他未知杂质的分离均大于1.5，符合要求。

方法验证

A.系统适用性实验：

取杂质A对照品，照上述色谱条件，连续进针5针，对照品溶液中杂质A峰面积的RSD为5.87％，理论塔板数为3491，系统适用性试验符合要求。

B.专属性实验

酸破坏：酸破坏方法同实施例1，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂酸降解峰分离度符合规定。

碱破坏：碱破坏方法同实施例1，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂碱降解峰分离度符合规定。

氧化破坏：氧化破坏方法同实施例1，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂在氧化条件下降解峰分离度符合规定。

高温破坏：高温破坏方法如实施例1，按照上述方法检测，记录色谱图。米铂在高温中降解峰分离度符合规定。

光照破坏：光照破坏方法如实施例1，按照上述方法检测，记录色谱图。降解峰分离度符合规定。

C.定量限、检测限

对照品溶液的配制方法同实施例1，进样分析，结果以信噪比为10:1计，杂质A的定量限为2.465μg/mL，取定量限溶液，进样10μL，结果以信噪比3:1计，杂质A的检测限为1.278μg/mL。

D.线性

取米铂样品配制方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝912,416x+279,457；相关系数R²＝0.999，结果表明米铂在0.5～1.2mg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

取杂质A方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝526713x+894.1；相关系数R²＝0.999，结果表明杂质A在2～10μg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

E.回收率

溶液配制方法如实施例1，按照供试品溶液制备方法，进样检测，记录色谱图。以外标法计算测得量，进而计算回收率。结果表明，低、中、高水平的回收率RSD值在5.0％以内，平均回收率在90.0％～110.0％范围内，表明本方法的准确度良好。

F.重复性

溶液配制方法如实施例1，按外标法测定每份样品杂质A的含量，用面积归一化法计算其他未知杂质的含量，加上杂质A的含量是总杂的含量，计算含量RSD。结果表明6份供试品的杂质A含量的RSD值为6.52％，总杂含量的RSD为4.71％，表明本方法的重复性良好。

实施例3

流动相：A相：甲醇：乙醇(75:25)，B相：甲醇：乙醇：水(75:25:400)；。

梯度时间如下：

时间(min)	A(v％)	B(v％)
			0	90	10
15	90	10
			20	100	0
50	100	0
			55	90	10
65	90	10

其他色谱条件同实施例1。

测定法同实施1，所不同的是检测样品为米铂冻干粉针。

本方法对米铂冻干粉针中的已知杂质A及其他未知杂质的分离均大于1.5，符合要求。

方法验证

A.系统适用性实验：

取杂质A对照品，照上述色谱条件，连续进针5针，对照品溶液中杂质A峰面积的RSD为6.26％，理论塔板数为5731，系统适用性试验符合要求。

B.专属性实验

C.定量限、检测限

对照品溶液的配制方法同实施例1，进样分析，结果以信噪比为10:1计，杂质A的定量限为2.151μg/mL，取定量限溶液，进样10μL，结果以信噪比3:1计，杂质A的检测限为1.192μg/mL。

D.线性

取米铂样品配制方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝2,742,352x+543,219；相关系数R²＝0.999，结果表明米铂在0.5～1.2mg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

取杂质A方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝612799x+12741.1；相关系数R²＝0.999，结果表明杂质A在2～10μg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

E.回收率

F.重复性

溶液配制方法如实施例1，按外标法测定每份样品杂质A的含量，用面积归一化法计算其他未知杂质的含量，加上杂质A的含量是总杂的含量，计算含量RSD。结果表明6份供试品的杂质A含量的RSD值为5.07％，总杂含量的RSD为3.46％，表明本方法的重复性良好。

实施例4

流动相：A相：甲醇：乙醇(90:10)，B相：甲醇：乙醇：水(90:10:400)；。

梯度时间如下：

其他色谱条件同实施例1。

测定法同实施1，所不同的是检测样品为米铂冻干粉针。

方法验证

A.系统适用性实验：

取杂质A对照品，照上述色谱条件，连续进针5针，对照品溶液中杂质A峰面积的RSD为5.83％，理论塔板数为6031，系统适用性试验符合要求。

B.专属性实验

C.定量限、检测限

对照品溶液的配制方法同实施例1，进样分析，结果以信噪比为10:1计，杂质A的定量限为2.124μg/mL，取定量限溶液，进样10μL，结果以信噪比3:1计，杂质A的检测限为1.158μg/mL。

D.线性

取米铂样品配制方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝2,124,172x+67,113；相关系数R²＝0.998，结果表明米铂在0.5～1.2mg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

取杂质A方法同实施例1，进行线性实验；该方法的线性回归方程为y＝946217x+8675.2；相关系数R²＝0.999，结果表明杂质A在2～10μg/mL的范围内峰面积与浓度线性关系良好。

E.回收率

F.重复性

溶液配制方法如实施例1，按外标法测定每份样品杂质A的含量，用面积归一化法计算其他未知杂质的含量，加上杂质A的含量是总杂的含量，计算含量RSD。结果表明6份供试品的杂质A含量的RSD值为4.67％，总杂含量的RSD为2.69％，表明本方法的重复性良好。

Claims

1.一种用高效液相色谱检测米铂原料及制剂中有关物质的方法，其特征在于采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；检测波长208～215nm；柱温为38～42℃；流速为0.5～2.0ml/min；流动相A是甲醇和乙醇的混合溶剂，体积比为70:30～95:5；流动相B是水和流动相A的混合溶剂，体积比为70:30～95:5；进行梯度洗脱，梯度条件为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相A之甲醇和乙醇混合体积比为75:25～90:10。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的流动相A之甲醇和乙醇混合体积比为80:20。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述流动相B之水和A相混合体积比为75:25～90:10。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的流动相B之水和A相混合体积比为80:20。

6.根据权利要求1、2、3或5任意一项所述的方法，其特征在于所述柱温为40℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述柱温为40℃。

8.根据权利要求1、2、3、5或7任意一项所述的方法，所述的流速为0.9～1.1ml/min。

9.根据权利要求4所述的方法，所述的流速为0.9～1.1ml/min。

10.根据权利要求6所述的方法，所述的流速为0.9～1.1ml/min。

11.根据权利要求1、2、3、5或7任意一项所述的方法，所述的流速为1.0ml/min。

12.根据权利要求4所述的方法，所述的流速为1.0ml/min。

13.根据权利要求6所述的方法，所述的流速为1.0ml/min。

14.根据权利要求8所述的方法，所述的流速为1.0ml/min。