CN101587102A

CN101587102A - 一种药品、保健食品和食品中pde5型抑制剂的高效液相色谱检测方法

Info

Publication number: CN101587102A
Application number: CNA2009100408556A
Authority: CN
Inventors: 罗卓雅; 雷毅; 杨德忠; 李延志
Original assignee: GUANGDONG INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Current assignee: GUANGDONG INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2029-07-06
Also published as: CN101587102B

Abstract

本发明公开了一种药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱检测方法，采用二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，流动相为磷酸三乙胺溶液－甲醇－乙腈体系，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为20～50℃，样品预处理为采用乙腈或甲醇超声提取样品，选择在波长范围为200～400nm内进行样品分析。本发明预处理方法简单、准确度高、专属性好、分析周期短、检测浓度范围宽，一次分析可以检测十一种PDE₅型抑制剂，适合中成药、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的定性和定量分析，可大大提高检验效率，节约检验费用，满足日常监督检验的需要。

Description

一种药品、保健食品和食品中PDE5型抑制剂的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱检测方法，尤其涉及一种药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱检测方法。

背景技术

补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中非法添加化学成分的行为日益猖獗，且针对标准的高科技造假行为越来越多，严重威胁人民群众的身体健康。查阅大量文献发现，非法添加的壮阳类化学成分主要以PDE₅型抑制剂(磷酸二酯酶5型抑制剂，phosphodiesterase type-5inhibitor)为主。美国食品药品管理局(FDA)先后批准了西地那非、伐地那非和他达拉非三种PDE₅型抑制剂，成为补肾壮阳类样品中添加最早和最频繁的化学成分。PDE₅型抑制剂属于处方药，服用时有严格的适应症、禁忌症和一定的副作用，某些病人不能服用，患者在不知情的情况下摄入容易引起严重的药物不良反应，甚至导致死亡。近年来，还发现了添加大量上述三种PDE₅型抑制剂的未知衍生物，这些化学成分均未经过严格的安全性实验，存在着严重隐患。

查处补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中非法添加PDE₅型抑制剂的行为是一项长期的任务，涉及范围广，需要进行大量的检验工作。中药本身成分复杂，各成分之间干扰严重，检验标准还很不完善。单味的中药成分已很复杂，复方中成药、保健食品和食品的化学成分更为复杂多样，加上生产工艺的影响，使得添加化学成分的检测方法要求更具专属性。现有技术中，补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中的PDE₅型抑制剂的检测主要采用液质谱联用法，但该仪器价格过于昂贵，维护成本较高，对仪器操作人员的要求也较高，只能在少数检测条件较好的实验室中使用，缺少一种简单、准确、能同时测定多个化学成分高效液相色谱方法。随着国内仪器配置水平的不断提高，价格适中、准确率较高的高效液相色谱方法日益受到重视，该方法适合在普通检测机构使用。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中十一种PDE₅型抑制剂的高效液相色谱检测方法。

本发明的一种药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱检测方法，采用二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为20～50℃，样品预处理为采用乙腈或甲醇超声提取样品，选择在波长范围为200～400nm内进行样品分析。

所述磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中各组分的体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为80～0∶10～50，10～50。优选的，采用梯度洗脱，流动相A各组分体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为60∶20∶20，流动相B各组分体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为8∶46∶46。下面的流动相均用体积比表示。

其中，磷酸三乙胺溶液的浓度优选为0.01～0.1mol/L，pH值为2.0～4.0。

更优的，所述磷酸三乙胺溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为2.8。

优选的，在波长为230nm时检测。

优选的，所述流速为1ml/min，所述柱温为35℃。

优选的，所述样品预处理采用乙腈超声溶解提取。

样品分析是根据保留时间和紫外光谱图进行定性分析，将供试品的紫外吸收光谱图与对照品的紫外吸收光谱图进行比较，或者将供试品的紫外吸收光谱图与各PDE₅型抑制剂的紫外吸收光谱特征进行比较。

供试品中PDE₅型抑制剂按照外标法根据峰面积进行定量分析，外标法计算含量时一般采用相应的对照品，在相应的对照品难以获得的情况下，也可以用容易获得的结构类似物作为参考对照品测定相对含量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的高效液相色谱检测方法利用高效液相色谱仪可以对补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中的PDE₅型抑制剂进行准确的定性分析和定量分析。本发明预处理方法简单、准确度高、专属性好、分析周期短、检测浓度范围宽，一次分析可以检测十一种PDE₅型抑制剂，适合中成药、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的定性和定量分析，适用于胶囊剂、片剂、丸剂、合剂等各种剂型的中成药、保健食品和食品。本发明的方法可作为确证方法，大大提高检验效率，节约检验费用，满足日常监督检验的需要。本发明方法采用的设备为国内普通实验室常规配置的高效液相色谱仪，适合在国内普通检测机构使用，有利于监督检验工作的开展和实施。

附图说明

图1是本发明中西地那非和他达拉非对照品的一个优选实施例的液相色谱图谱；

图2是本发明中西地那非和他达拉非对照品的一个优选实施例的紫外吸收光谱图；

图3是本发明中供试品1^#的一个优选实施例的色谱图；

图4是本发明中供试品2^#的一个优选实施例的色谱图；

图5是本发明中供试品1^#和2^#的一个优选实施例的主峰紫外吸收光谱图；

图6是本发明中十一种PDE₅型抑制剂的液相色谱图；

图7-图17分别是本发明中那红地那非、红地那非、伐地那非、伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、那莫西地那、氨基他达那非、他达那非和硫代艾地那非的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法。通常按照常规实验方法进行。

本发明的高效液相色谱仪主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱、多元泵、二极管阵列检测器等。

本发明的主要分析步骤如下：

1.色谱条件

(1)色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱。

(2)检测器：二极管阵列检测器，扫描波长范围为200～400nm。PDE₅型抑制剂都在230nm附近有强紫外吸收，设定检测波长为230nm。在此波长下，十一种PDE₅型抑制剂均具有较高的检测灵敏度。

(3)流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，三者体积比为80～0∶10～50，10～50。混合前，磷酸三乙胺的浓度为0.05mol/L，pH值为2.8。采用梯度洗脱，流动相A为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈，三者体积比为60∶20∶20，流动相B为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈，三者体积比为8∶46∶46。

(4)流速：1ml/min。

(5)柱温：35℃。

在另一个优选实施例中，流动相、流速、柱温分别如下：

流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，其中三者体积比为80～0∶10～50，10～50。磷酸三乙胺的浓度为0.01mol/L，pH值为2.0；混合前，流动相A磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中，三者体积比为80∶10∶10，流动相B磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中，三者体积比为0∶50∶50。

流速：1.5ml/min。

柱温：50℃。

在另一个优选实施例中，流动相、流速、柱温分别如下：

流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，三者体积比为60～0∶20～50，20～50。磷酸三乙胺的浓度为0.05mol/L，pH值为2.8；混合前，流动相A磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中，三者体积比为60∶20∶20；流动相B磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中，三者体积比为0∶50∶50。

流速：0.5ml/min。

柱温：20℃。

在另一个优选实施例中，流动相、流速、柱温分别如下：

流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，三者体积比为60～0∶20～50∶20～50。磷酸三乙胺的浓度为0.1mol/L，pH值为4.0；混合前，流动相A磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中三者体积比为60∶20∶20；流动相B磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中，三者体积比为0∶50∶50。

流速：1.5ml/min。

柱温：50℃。

2.对照品溶液的制备

精密称取那红地那非(Noracetildenafil，分子式C₂₄H₃₂N₆O₃)、红地那非(Acetildenafil，分子式C₂₅H₃₄N₆O₃)、伐地那非(Vardenafil，分子式C₂₃H₃₂N₆O₄S)、羟基豪莫西地那非(Hydroxyhomosildenafil，分子式C₂₃H₃₂N₆O₅S)、西地那非(Sildenafil，分子式C₂₂H₃₀N₆O₄S)、豪莫西地那非(Homosildenafil，分子式C₂₃H₃₂N₆O₄S)、氨基他达拉非(Aminotadalafil，分子式C₂₁H₁₈N₄O₄)、他达拉非(Tadalafil，分子式C₂₂H₁₉N₃O₄)、硫代艾地那非(Thioaildenafil，分子式C₂₃H₃₂N₆O₃S₂)、伪伐地那非(Pseudovardenafil，分子式C₂₂H₂₉N₅O₄S)和那莫西地那非(Norneosildenafil，分子式C₂₂H₂₉N₅O₄S)对照品各10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，用流动相A溶液稀释制成每1ml含50μg的溶液，即得。流动相A溶液为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，三者体积比为60∶20∶20。

3.供试品溶液的制备

若样品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细，置50ml量瓶中，加乙腈40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；若样品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈约40ml，振摇3分钟，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液适量，根据样品中添加PDE₅抑制剂的量，用流动相A稀释至与对照品溶液浓度相当，摇匀，滤过，即得。

4.测定方法

(1)分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10μl适量注入液相色谱仪，记录色谱图及紫外光谱图。

(2)将供试品的色谱图和对照品的色谱图进行比较，保留时间与对照品保留时间相近(误差范围为±0.2分钟)的组分即初步认为是相应的PDE₅型抑制剂。

(3)由于中成药、保健食品和食品种类繁多、成分复杂，不能完全排除存在干扰成分与PDE₅型抑制剂在同一时间出峰的情况，采用二极管阵列检测器可获得PDE₅型抑制剂的紫外吸收光谱图，将供试品的紫外吸收光谱图与对照品的紫外吸收光谱图进行比较，对照品的紫外吸收光谱图见图7-17，图7-17分别是本发明中那红地那非、红地那非、伐地那非、伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、那莫西地那、氨基他达那非、他达那非和硫代艾地那非的紫外吸收光谱图。若两者的最大吸收波长、最小吸收波长等光谱特征一致，进一步确证供试品中含有PDE₅型抑制剂。如无法获得PDE₅型抑制剂的对照品，可参考表1相应化学成分的紫外吸收光谱特征进行比较。

表1

(4)根据供试品溶液的实际浓度，用流动相A稀释使其与对照品溶液的色谱峰面积相当，按外标法计算样品中添加化学成分的浓度，并按所附说明书计算出一次服用量所摄入的化学成分量。

外标法计算含量时一般采用相应的对照品计算含量。由于PDE₅型抑制剂存在很多西地那非、伐地那非和他达拉非的衍生物，获取这些衍生物的对照品十分困难，PDE₅型抑制剂的化学结构相似，在230nm的紫外响应值基本相当，在相应的对照品难以获得的情况下，也可以用容易获得的结构类似物(如西地那非)作为参考对照品测定相对含量。

(5)从上述十一种PDE₅型抑制剂中选择那红地那非、伐地那非、西地那非、他达拉非和硫代艾地那非作为代表性PDE₅型抑制剂进行方法学验证：3个浓度9份供试品溶液的平均回收率分别为99.1％、96.2％、105.0％、102.1％和103.0％；7次进样主成分峰面积的RSD分别为0.8％、0.8％、0.8％、0.6％和0.5％；检测限分别约为6ng、6ng、4ng、2ng和2ng，表明本发明的方法满足高效液相色谱含量测定的要求。

(6)合理设置中成药、保健食品和食品中非法添加化学成分的限量水平对于区分人为添加和评估非法添加的危险程度具有重要的意义。西地那非类的起效剂量为50～100mg，伐地那非类和他达拉非类的起效剂量为5～20mg。按最低起效剂量5mg计算，设定人为添加的限量值为最低有效剂量的1/10，即0.5mg/次服用量。在评估添加化学成分对人体健康的危害程度时，该限量值可作为参考。即便每次服用0.5mg上述化学成分，在临床上也不会产生显著效果，从而使得非法添加用来牟取不法利益变得毫无意义。

用本发明的方法检测供试品的具体操作如下：

1.仪器、试剂和样品

Waters 2695高效液相色谱仪，2996 PDA检测器，四元高压梯度泵，Empower色谱工作站；色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈和甲醇为色谱纯；磷酸和三乙胺为分析纯；

枸橼酸西地那非对照品购于Canada Toronto公司，批号为Lot 4-MAK-10-1；他达拉非对照品购于Canada Toronto，批号为TRC-20030302。

供试品1^#标示为喜来劲中研通牌喜来庆胶囊，批号20070820，每次服用两粒；供试品2^#标示为男霸天胶囊，批号20080305，每次服用两粒。

2.色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；二极管阵列检测器，检测波长为230nm，扫描波长范围为200～400nm；柱温35℃；流速1.0ml/min；流动相A为磷酸三乙胺溶液(取三乙胺7ml用水稀释至1000ml，用磷酸调pH至2.8)-甲醇-乙腈(60∶20∶20)，流动相B为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈(8∶46∶46)，按表2进行梯度洗脱。

表2

3.对照品溶液的制备

精密称取西地那非和他达拉非对照品10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置20ml量瓶，用流动相A溶液稀释制成每1ml含50μg的溶液，摇匀，即得。

4.供试品溶液的制备

精密称取供试品1^#一次服用量0.27205g，研细，置50ml量瓶中，加乙腈40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液2ml，置20ml量瓶，用流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

精密称取供试品2^#一次服用量0.17910g，同法处理，即得。

5.测定法

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液适量注入液相色谱仪，记录色谱图及紫外光谱图。

6.结果分析

对照品的液相色谱图和主峰的紫外吸收光谱图分别见图1和图2，其中，在图1中，保留时间17.056分钟的色谱峰为西地那非，保留时间22.868分钟的色谱法为他达拉非。供试品1^#和2^#的液相色谱图和主峰的紫外吸收光谱图分别见图3、图4和图5。图6是十一种PDE₅型抑制剂的液相色谱图，出峰顺序：1-那红地那非；2-红地那非；3-伐地那非；4-羟基豪莫西地那非；5-西地那非；6-豪莫西地那非；7-氨基他达拉非；8-他达拉非；9-硫代艾地那非；10-伪伐地那非；11-那莫西地那非。

将供试品1^#与对照品色谱图进行比较，在西地那非保留时间附近出现色谱峰，初步认为添加了西地那非。采用二极管阵列检测器获得上述色谱峰的紫外吸收光谱图，将供试品的色谱图与对照品紫外吸收光谱图或表2中西地那非的紫外吸收光谱特征进行比较，两者的最大吸收波长、最小吸收波长等光谱特征一致，进一步确证供试品1^#中含有西地那非。表2为十一种PDE₅型抑制剂的紫外吸收光谱特征。按外标法计算，供试品1^#中西地那非浓度为3.9％，参考说明书一次服用一粒计算得每次摄入21.2mg，远大于每次服用0.5mg的限量值，判断为人为添加。

将供试品2^#与对照品色谱图进行比较，在他达拉非保留时间附近出现色谱峰，初步认为添加了他达拉非。采用二极管阵列检测器获得上述色谱峰的紫外吸收光谱图，将供试品的色谱图与对照品紫外吸收光谱图或表1他达拉非的紫外吸收光谱特征进行比较，两者的最大吸收波长、最小吸收波长等光谱特征一致，进一步确证供试品2^#中含有他达拉非。按外标法计算，供试品2^#中他达拉非浓度为5.4％，参考说明书一次服用一粒计算得每次摄入27.1mg，远大于每次服用0.5mg的限量值，判断为人为添加。

从市场收集194个各种补肾壮阳类样品，其中132个添加PDE₅型抑制剂，涉及8种PDE₅型抑制剂。采用高效液相色谱-质谱联用方法对上述高效液相色谱法的测定结果进行验证，准确率为100％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1、一种药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱检测方法，其特征在于，采用二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，流动相为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为20～50℃，样品预处理为采用乙腈或甲醇超声提取样品，在检测波长为200～400nm的范围内进行样品分析。

2、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈体系中各组分的体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为80～0∶10～50∶10～50。

3、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，采用梯度洗脱时，流动相A各组分及其体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为60∶20∶20，流动相B各组分及其体积比为磷酸三乙胺溶液∶甲醇∶乙腈为8∶46∶46。

4、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述磷酸三乙胺溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，pH值为2.0～4.0。

5、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述磷酸三乙胺溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为2.8。

6、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述检测波长为230nm。

7、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述流速为1ml/min，所述柱温为35℃。

8、根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述样品预处理采用乙腈超声溶解提取。