CN103926336B

CN103926336B - 一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法

Info

Publication number: CN103926336B
Application number: CN201310697720.3A
Authority: CN
Inventors: 秦剑; 陈晓虎; 邹江; 苏晶; 王白露; 任学毅
Original assignee: Chongqing Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Chongqing Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: CN103926336A

Abstract

本发明一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法，其中关键在于所述对照品为西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达拉非和氨基他达拉非的混合物；本发明所述非法添加的壮阳类化学成分的高效检测方法，与单一指标检测项目，检测限和专属性均无显著差异；且具有很高的检测效率。

Description

一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种保健食品和药品中非法添加成分的快速检测方法，更具体的说涉及一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法。

技术背景

液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)即液质联用技术。这种技术的分离系统是液相色谱，而检测系统则为质谱，即利用色谱的分离技术，将混合样品分离成单一的物质，按顺序进入质谱后，这些物质被质谱的质量分析器打成碎片，由质谱检测器来分析物质的结构，利用判断键的断裂方式，通过质核比照相应的对照图库，判断离子碎片的结构，从而对未知样品进行定性定量。这种液质联用技术体现出了色谱与质谱的优势互补，把色谱和质谱的优点结合起来，让人们在分析中能够利用它们的高分离力、高灵敏度和高选择性等特点，再加上系统能够提供对照谱图，使得分析试验能够越来越简便圆。液质联用为比较成熟的技术，在当今许多领域如农药残留分析、食品分析、环境分析与药物分析等方面得到了广泛的应用。目前分析上常用的液质联用系统基本从质谱方向分为质量分析器分类及离子源分类两大类。质量分析器分类包括四级杆、飞行时间(TOF)、傅立叶变换质谱：离子源分类包括大气压化学电离源(APCI)、大气压光电离源(APPI)、电喷雾离子源(ESI)、基质辅助激光解吸电离源(MALDI)。

与传统液相色谱的检测器，如UV或者PAD比较，质谱具有灵敏度高和鉴定功能强等特点，加上液相色谱的分析范围较广，近年来液质联用技术已经成为大型比赛中药物分析方面最强有力的工具之一。尤其是近几年对于各种药物尤其是违禁药物及其代谢产物的研究，国内外都有大量的文献报道。

发明内容

但是由于针对某一种药品或保健品可添加的同类化学成分非常多，如针对每一种成分逐一进行检测，不仅检测成本巨大，同时需要大量的检测时间，不利于提高工作效率；所以本发明提供了一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法。具体的操作步骤为：

1)取相当于一次口服剂量的中成药或保健食品(固体制剂需研细，液体制剂直接取样)，加甲醇25ml，超声处理10分钟，用微孔滤膜(﹤0.22μm)滤过，滤液用甲醇适当稀释，作

为供试品溶液。

2)取西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达拉非、氨基他达拉非对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

3)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法对样品进行筛查和鉴定。

高效液相色谱仪：waters AQUITY UPLC仪

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱为WATERS BEH C18，100mm×2.1mm，1.7μm)

以甲醇-乙腈(4:3)为流动相A,以含0.1％甲酸的10mmol/L的甲酸铵溶液为流动相B，按表1所述的流动相比例进行梯度洗脱；

表1 流动相比例

检测波长为230nm；

流速：0.3ml/min；

柱温：40℃；

样品温度：15℃；

进样量：1ul；

飞行时间质谱仪：waters Q-TOF仪；

电喷雾电离子源(ESI)；

质谱检测参数：ESI⁺扫描；

干燥气温度：350℃；

锥孔电压：35v；

扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，扫描范围：100～1000m/z。

4)鉴定：

供试品色谱中，出现与混合对照品中各对照品色谱保留时间相同的色谱峰，并且供试品该色谱峰液质联用的一级质谱及二级质谱均与对照品一致，即判断此供试品为阳性。

供试品色谱中，未出现与混合对照品中各对照品色谱保留时间相同的色谱峰，即判断此供试品为阴性。

本发明的有益技术效果是：本发明建立了一种非法添加的壮阳类化学成分，的高效检测方法，与单一指标检测项目，检测限和专属性均无显著差异；且具有很高的检测效率。

附图说明

图1对照品提取离子流色谱图；

图2阴性样品及混合对照品总离子流图；

图3对照品一级质谱图；

图4对照品二级质谱图；

图5阳性样品总离子流图；

图6阳性样品提取离子流图(475.213,0.05Da)；

图7阳性样品一级质谱图；

图8阳性样品二级质谱图；

其中，图1、3、4所述的序号对应的标号分别是：1-那红地那非，2-红地那非，3-豪莫西地那非，4-羟基豪莫西地那非，5-氨基他达拉非，6-西地那非，7-伐地那非，8-他达拉非，9-硫代艾地那非，10-那莫西地那非，11-伪伐地那非。

具体实施方式

实施例1色谱条件的考察

1)供试品提取条件的选择

分别考察了甲醇和乙腈两种溶剂提取部分非法添加的阳性样品，结果表明，甲醇和乙腈均能提取出目标成分，但由于甲醇便宜且污染较小，故采用甲醇超声提取的方法。分别考察了Strata-X、Strata-X-W、HLB和PCX四种固相萃取小柱对甲醇提取样品的纯化效果，结果均对目标成分有较强的吸附效果，导致回收率低，故未采用固相萃取的步骤。

2)流动相的选择

水相分别考察了甲酸，甲酸-三乙胺，甲酸-甲酸铵，甲酸甲酸铵-三乙胺系统，结果仅采用甲酸离子化效率较低，加入三乙胺的系统峰型较好，但离子抑制效应明显，加入甲酸铵后离子化效率明显增强，且峰型较好。故采用甲酸-甲酸铵系统。有机相分别比较了甲醇、乙腈、不同比例甲醇-乙腈混合溶液，结果采用甲醇-乙腈混合溶液峰型对称、尖锐。多次对梯度进行调整，最终得到较好的分离效果；具体如图1所示。

3)不同色谱柱色谱分离情况的考察

同时考察了三根不同品牌的色谱柱对待测成分的分离情况(1)Agilent ZORBAX RRHDEclipse Plus C₁₈柱(100mm×3.0mm，1.8μm)、(2)Kromasil C₁₈(100mm×2.1mm，1.8μm)、(3)Waters ACQUITY HSS T3C₁₈柱(100mm×2.1mm，1.8μm)、(4)Waters ACQUITY BEHC₁₈柱(100mm×2.1mm，1.7μm)试验表明目标成分色谱峰峰形较好。

4)专属性考察

对部分阳性样品中所含成分进行了专属性考察，用不含添加物的相应剂型和品种做为阴性对照，结果表明，阳性样品可检出保留时间相同的色谱峰，阴性样品均无相应的色谱峰；如图2所示。

5)检测限试验

取上述11中对照品适量，加甲醇配制成不同浓度的对照品溶液注入液相色谱仪，依法测定，按3倍信噪比计算检测限，11种对照品的最低检测限均低于0.01μg·mL^-1。

6)质谱特征确定

对照品及其部分非法添加样品的一级质谱分子离子峰以及二级质谱主要碎片离子见下表2所示；具体如图3、4所示。

表2 对照品中非法添加的分子峰和二级碎片

实施例2样品的检测

取相当于一次口服剂量的市售某保健食品，研细，液体制剂直接取样，加甲醇超声提取后，置10℃以下温度放置过夜，待澄清后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，适当稀释，作为供试品溶液。

采用实施例中所述的液质联用优选，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法对样品进行筛查和鉴定。查出该样品含有非法添加西地那非。具体如图5、6、7、8所示。

Claims

1.一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法，包括以下步骤：

1）制备样品；

2）通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法对样品进行筛查和鉴定；

3）将样品的高效液相色谱图以及一二级质谱图与对照品的高效液相色谱图以及一二级质谱图进行比对，鉴定出非法添加壮阳类化学成分；

其特征在于：所述对照品为西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达拉非和氨基他达拉非的混合物；

步骤2）所述的色谱条件为：

高效液相色谱仪：waters AQUITY UPLC仪；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其色谱柱具体为：WATERS BEH C₁₈，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；

以甲醇-乙腈体积比4:3为流动相A,以含0.1%甲酸的10mmol/L的甲酸铵溶液为流动相B，按下述以进行梯度洗脱：

0-8min时，流动相A的体积百分比为42%，流动相B的体积百分比为58%；

8-10min时，流动相A的体积百分比的变化为42%→49%，流动相B的体积百分比的变化为58%→51%；

10-10.5min时，流动相A的体积百分比的变化为49%→77%，流动相B的体积百分比的变化为51%→23%；

10.5-14min时，流动相A的体积百分比为77%，流动相B的体积百分比为23%；

14-14.5min时，流动相A的体积百分比的变化为77%→95%，流动相B的体积百分比的变化为23%→5%；

14.5-16.5min时，流动相A的体积百分比为95%，流动相B的体积百分比为5%；

16.5-17min时，流动相A的体积百分比为95%→42%，流动相B的体积百分比为5%→58%；

17-20min时，流动相A的体积百分比为42%，流动相B的体积百分比为58%；

检测波长为230nm；

流速：0.3ml/min；

柱温：40℃；

样品温度：15℃；

进样量：1μl；

飞行时间质谱仪：waters Q-TOF仪；

电喷雾电离子源-ESI；

质谱检测参数：ESI⁺扫描；

干燥气温度：350 ℃；

锥孔电压：35v；

扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，扫描范围：100～1000 m/z。

2.根据权利要求1所述的非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法，其特征在于：

步骤1）所述的样品制备方式为：取相当于一次口服剂量的中成药或保健食品，加甲醇25ml，超声处理10分钟，用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液用甲醇适当稀释，作为供试品溶液。