CN102253130A - 测定复合维生素中维生素a、维生素d和维生素e的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)标准品溶液的制备；(3)取待测样品溶液，步骤(2)制备的溶液用Waters反相C₁₈色谱柱进行分离，二极管阵列检测器检测，得到相应色谱图，通过标准品溶液中各维生素的保留时间定性判定待测样品溶液中的各维生素；(4)通过色谱图中各维生素峰面积的比例关系，并根据各维生素标准品溶液的浓度分别获得待测样品溶液中所含各维生素的质量浓度；(5)根据浓度，通过公式计算待测样品溶液中维生素的含量：本方法测定简便、快速、准确，在对保健食品原料实施控制的同时缩短分析时间，降低有机试剂消耗。

Description

测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法

技术领域

本发明涉及一种测定保健食品复合维生素中维生素A、D、E的方法。

背景技术

维生素是维持人和动物正常生理所必须的营养物质，人和动物对维生素的需求虽然不大，但作用却非常重要。由于人不能合成维生素，必须依赖食物来提供足够的维生素，随着社会的发展，市场上出现了越来越多的含维生素的产品，并且越来越多的保健品中标明富含各种维生素，但是，某种含维生素的产品中究竟含有多少维生素，测定食品中维生素的方法显得很重要。

近年来，随着社会的发展，含有复合维生素的产品越来越多，剂型有片剂或冲剂等，大多数食品中的维生素是以复合维生素的形式加入的，而复合维生素中维生素多以维生素微胶囊或微粒形式存在。维生素A、维生素D和维生素E是脂溶性维生素，它们较易在体内蓄积，当食用过量会导致中毒，因而需要对含有维生素的产品进行监测，这就需要一种对脂溶性维生素进行快速测定的方法，高效液相色谱法为维生素的测定提供了一种快速可靠的方法。但目前食品国家标准方法仅限于GB 5413.9-2010食品安全国家标准  婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定；GB/T 5009.82-2003食品中维生素A和维生素E的测定；GB 14755-1993食品添加剂维生素D₂的测定。而对于保健食品生产过程中最主要的原料复合维生素中维生素A、D、E测定的方法并没有明确的规定，通过实验发现，采用国标的方法检测复合维生素中的脂溶性维生素存在如下问题：

1.采用皂化提取法，全部实验过程费时，操作繁琐，整个实验过程试剂消耗量较大，检测周期较长，增加检测费用的同时也达不到快速检测的目的。

2.皂化法通常适用于维生素含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰，保健食品的生产过程中的最主要原料“复合维生素”中维生素A、D、E的含量很高，不宜用皂化法对复合维生素进行样品处理。采用皂化法对复合维生素样品进行处理，会导致复合维生素中的维生素A、D、E的严重损失，从而导致检测结果不能真实反映样品中维生素的含量，影响检测数据的准确性。

3.重现性差，准确率低；

4.试剂消耗量大。

由于维生素A、D、E的极性不同，采用现有技术无法同时检测出维生素A、D、E，通常先采用反相色谱法分离出维生素A、E，经紫外检测器检测，采用内标法定量测定维生素A和维生素E，对于维生素D则另外采用正相色谱系统分离后再用反相色谱系统检测。这种检测方法的不足在于：正相色谱柱寿命短、价格昂贵，且采用正相、反相两个色谱系统交替使用操作繁琐，同时加大了样品的损失量，降低了检测准确度。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种重现性好，准确率高，试剂消耗量小的测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品溶液的制备：称取质量为m克的待测复合维生素样品于100ml容量瓶中，加入氨水调节至pH值为7.8～8.5，加入300mg-500mg的胰蛋白酶，于65℃超声波水浴处理20-40min，静置冷却至室温，乙醇定容至刻度，摇匀过滤，滤除残渣，取V₁ml滤液于已装有50ml石油醚和5ml-10ml水的100ml的容量瓶中，振荡容量瓶使滤液分层，静置10min；取V₂ml石油醚提取液于40℃水浴中氮气吹干仪下氮吹浓缩后，用1ml甲醇溶解定容，得到待测样品溶液；

(2)标准品溶液的制备：

维生素D₂、维生素D₃混合标准品溶液的制备：

①取维生素D₂、维生素D₃对照品各10mg，分别用甲醇溶解并定容至100ml棕色容量瓶中；②取步骤①获得的维生素D₂溶液V微升、维生素D₃溶液V微升，分别用无水乙醇稀释至10.00mL，得到维生素D₂的标准储备液和D₃的标准储备液，分别用表1所述的条件用紫外分光光度计测定维生素D₂储备液和维生素D₃储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(1)计算出维生素D₂标准储备液和维生素D₃标准储备液的浓度；所述的维生素D₂、维生素D₃标准储备液的测定条件如表1所示：

表1

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-9}}$ ……………………公式(1)

式中：C-维生素D₂或维生素D₃标准储备液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

A-维生素D₂或维生素D₃的紫外吸光值；

V-加入标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素D₂或维生素D₃溶液1％的比吸光系数；

为维生素D₂或维生素D₃标准储备液稀释倍数；

③取步骤②维生素D2、维生素D3的标准储备液各0.1mL，分别用甲醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度分别为C1μg/ml的维生素D2和C2μg/ml的维生素D3的标准品溶液，合并二标准品溶液，得到维生素D2、维生素D3混合标准品溶液；

维生素A标准品溶液的制备：

①取维生素A，对照品10mg用脱醛乙醇溶解并定容至10ml棕色容量瓶中；

②取步骤①维生素A溶液V微升，用乙醇稀释至10.00毫升，得到维生素A的标准储备液，用紫外分光光度计按照325nm测定维生素A标准储备液中的维生素A吸光值，并用维生素A的比吸光系数按照公式(2)计算出该维生素A标准储备液的浓度；

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(2)

C-维生素A标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-维生素A的紫外吸光值；

V-加入维生素A标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素A溶液1％比吸光系数；

为维生素A标准标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中维生素A标准储备液0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度为C3μg/ml的维生素A标准品溶液；

α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E混合标准品溶液的制备：

①取α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E对照品各10mg，分别用脱醛乙醇溶解并定容至10ml容量瓶中；

②分别取步骤①中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E溶液V微升，分别用乙醇稀释至10.00毫升，分别得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的标准储备液，分别用表2所述的条件用紫外分光光度计测定各标准储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(3)分别计算出各标准储备液的浓度；

表2：

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(3)

C-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的平均紫外吸光值；

V-加入α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液1％的比吸光数；

为标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准储备液各0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，即得到浓度分别为C4μg/ml、C5μg/ml、C6μg/ml的α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准品溶液，合并上述三个标准品溶液，得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的混合标准品溶液；

(3)取步骤(1)的待测样品溶液V₃μl、步骤(2)制备的已知浓度的溶液各V₄μl，分别注入高效液相色谱仪中，用Waters反相C₁₈色谱柱进行色谱分离，二极管阵列检测器检测，得到上述标准品溶液和待测样品溶液的高效液相色谱图，通过上述标准品溶液中各维生素的保留时间定性判定待测样品溶液中的各维生素；所述的高效液相色谱仪的流动相为乙腈-甲醇-水体系或甲醇-水体系；

(4)通过维生素A、D、E混合标准品溶液与待测样品溶液中维生素A、D、E色谱图中各维生素峰面积的比例关系，并根据各维生素标准品溶液的浓度C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆分别获得待测样品溶液中所含维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度；

(5)根据步骤(4)中得到的维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度，分别通过下述公式计算待测样品溶液中维生素A、维生素D₂、维生素D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的含量：

a、复合维生素待测品中维生素A含量的计算公式为：

$X_1=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₁为复合维生素待测样品中维生素A的含量，μg/g；

C为维生素A待测样品溶液的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的质量，单位为g

b、复合维生素待测品中维生素D₂或D₃的计算公式为：

$X_2=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)\×40\×1.07}{m}$

式中：X₂为复合维生素待测样品中维生素D₂或D₃含量，I.U/g；

C为待测样品溶液中维生素D₂或D₃的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g

40为1μg维生素D₂或D₃的国际单位数

1.07为维生素D₂或D₃的换算系数

c、复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E含量的计算公式为：

$X_3=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₃为复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的含量，单位为μg/g；

C为维生素E待测样品溶液α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g。

所述高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为体积比为25∶75∶4的乙腈-甲醇-水，流速为1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

所述的高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为甲醇-水体系，所述的流动相为体积比为96∶4的甲醇-水，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

本方法的方法，对复合维生素中维生素A、D、E分离良好，峰面积对浓度呈良好的线性关系，可以准确同时测定复合维生素中维生素A、D、E的含量，并具有测定简便、快速、准确的特点。在对保健食品原料品质实施更加有效控制的同时缩短分析时间，降低有机试剂消耗。

附图说明

图1-1、1-2为实施例2的色谱图。

图2-1、2-2为实施例3的色谱图。

图3-1、3-2、3-3为实施例4的色谱图。

图4-1、4-2为实施例5的色谱图。

图5-1、5-2为实施例6的色谱图。

所有色谱图中，峰1为维生素D2；峰2为维生素D3；峰3为维生素A；峰4为α-维生素E；峰5为γ-维生素E；峰6为δ-维生素E。

具体实施方式

实施例1

一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品溶液的制备：称取质量为m克的待测复合维生素样品于100ml容量瓶中，加入氨水调节至pH值为8.0(也可以控制在7.8或8.5)，加入400mg(也可以是300mg或500mg)的胰蛋白酶，于65℃超声波水浴处理30min(也可以是20min或40min)，静置冷却至室温，乙醇定容至刻度，摇匀过滤，滤除残渣，取V₁ml滤液于已装有50ml石油醚和5ml(也可以是10ml)水的100ml的容量瓶中，振荡容量瓶使滤液分层，静置10min；取V₂ml石油醚提取液于40℃水浴中氮气吹干仪下氮吹浓缩后，用1ml甲醇溶解定容，得到待测样品溶液；

(2)标准品溶液的制备：

维生素D₂、维生素D₃混合标准品溶液的制备：

①取维生素D₂、维生素D₃对照品各10mg，分别用甲醇溶解并定容至100ml棕色容量瓶中；②取步骤①获得的维生素D₂溶液V微升、维生素D₃溶液V微升，分别用无水乙醇稀释至10.00mL，得到维生素D₂的标准储备液和D₃的标准储备液，分别用表1所述的条件用紫外分光光度计测定维生素D₂储备液和维生素D₃储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(1)计算出维生素D₂标准储备液和维生素D₃标准储备液的浓度；所述的维生素D₂、维生素D₃标准储备液的测定条件如下所示：

表1

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-9}}$ ……………………公式(1)

式中：C-维生素D₂或维生素D₃标准储备液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

A-维生素D₂或维生素D₃的紫外吸光值；

V-加入标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素D₂或维生素D₃溶液1％的比吸光系数；

为维生素D₂或维生素D₃标准储备液稀释倍数；

③取步骤②维生素D2、维生素D3的标准储备液各0.1mL，分别用甲醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度分别为C1μg/ml的维生素D2和C2μg/ml的维生素D3的标准品溶液，合并二标准品溶液，得到维生素D2、维生素D3混合标准品溶液；

维生素A标准品溶液的制备：

①取维生素A，对照品10mg用脱醛乙醇溶解并定容至10ml棕色容量瓶中；

②取步骤①维生素A溶液V微升，用乙醇稀释至10.00毫升，得到维生素A的标准储备液，用紫外分光光度计按照325nm测定维生素A标准储备液中的维生素A吸光值，并用维生素A的比吸光系数按照公式(2)计算出该维生素A标准储备液的浓度；

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(2)

C-维生素A标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-维生素A的紫外吸光值；

V-加入维生素A标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素A溶液1％比吸光系数；

为维生素A标准标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中维生素A标准储备液0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度为C3μg/ml的维生素A标准品溶液；

α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E混合标准品溶液的制备：

①取α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E对照品各10mg，分别用脱醛乙醇溶解并定容至10ml容量瓶中；

②分别取步骤①中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E溶液V微升，分别用乙醇稀释至10.00毫升，分别得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的标准储备液，分别用表2所述的条件用紫外分光光度计测定各标准储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(3)分别计算出各标准储备液的浓度；

表2：

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(3)

C-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的平均紫外吸光值；

V-加入α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液1％的比吸光数；

为标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准储备液各0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，即得到浓度分别为C4μg/ml、C5μg/ml、C6μg/ml的α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准品溶液，合并上述三个标准品溶液，得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的混合标准品溶液；

(3)取步骤(1)的待测样品溶液V₃μl、步骤(2)制备的已知浓度的溶液各V₄μl，分别注入高效液相色谱仪中，用Waters反相C₁₈色谱柱进行色谱分离，二极管阵列检测器检测，得到上述标准品溶液和待测样品溶液的高效液相色谱图，通过上述标准品溶液中各维生素的保留时间定性判定待测样品溶液中的各维生素；所述的高效液相色谱仪的流动相为乙腈-甲醇-水体系或甲醇-水体系；

(4)、通过维生素A、D、E混合标准品溶液与待测样品溶液中维生素A、D、E色谱图中各维生素峰面积的比例关系，并根据各维生素标准品溶液的浓度C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆分别获得待测样品溶液中所含维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度；

(5)、根据步骤(4)中得到的维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度，分别通过下述公式计算待测样品溶液中维生素A、维生素D₂、维生素D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的含量：

a、复合维生素待测品中维生素A含量的计算公式为：

$X_1=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₁为复合维生素待测样品中维生素A的含量，μg/g；

C为维生素A待测样品溶液的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的质量，单位为g

b、复合维生素待测品中维生素D₂或D₃的计算公式为：

$X_2=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)\×40\×1.07}{m}$

式中：X₂为复合维生素待测样品中维生素D₂或D₃含量，I.U/g；

C为待测样品溶液中维生素D₂或D₃的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g

40为1μg维生素D₂或D₃的国际单位数

1.07为维生素D₂或D₃的换算系数

c、复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E含量的计算公式为：

$X_3=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₃为复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的含量，单位为μg/g；

C为维生素E待测样品溶液α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g。

所述高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为体积比为25∶75∶4的乙腈-甲醇-水，流速为1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

所述的高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为甲醇-水体系，所述的流动相为体积比为96∶4的甲醇-水，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。

这些描述并不是对本发明内容进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所做的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例2

用实施例1的方法采用下述条件对某公司的同时含有维生素A、维生素D₂、维生素D₃的产品样品进行检测，发现其含量合格。

色谱条件  色谱柱Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-甲醇-水体系，比例为25∶75∶4，流速1.0ml/min，柱温：30℃，进样量50μl，维生素D的检测波长265nm。维生素A检测波长300nm。在此色谱条件下，维生素D₂、维生素D₃的保留时间分别为22.917min、22.605min(图1-1)；维生素A的保留时间为9.130min(图1-2)；各物质分离良好，以各物质的峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，相关系数r均＞0.999，说明峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表3、维生素D₂、维生素D₃峰图信息

表4、维生素A的峰图信息

实施例3

用实施例1的方法采用下述条件对某公司同时含有维生素D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的产品样品进行检测，测得其含量合格。

色谱条件  色谱柱Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-甲醇-水体系，比例为25∶75∶4，流速1.0ml/min，柱温：30℃，进样量50μl，维生素D的检测波长265nm。维生素E的检测波长300nm。在此色谱条件下，维生素D3的保留时间为23.759min(图2-1)；α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的保留时间分别为30.700min、26.022min、21.364min(图2-2)。各物质分离良好，以各物质的峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，相关系数r均＞0.999，说明峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表5、维生素D3峰图信息

表6、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E峰图信息

实施例4

用实施例1的方法采用下述条件对某公司同时含有维生素D₃、维生素A、α-维生素E的产品样品进行检测，测得其含量合格。

色谱条件色谱柱Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-甲醇-水体系，比例为25∶75∶4，流速1.0ml/min，柱温：30℃，进样量50μl，维生素A、E的检测波长300nm，维生素D的检测波长265nm。在此色谱条件下，维生素D3的保留时间为24.675min(图3-3)；维生素A的保留时间为6.498min(图3-2)；α-维生素E的保留时间为30.774min(图3-1)。各物质分离良好，以各物质的峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，相关系数r均＞0.999，说明峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表7、α-维生素E峰图信息

表8、维生素A的峰图信息

表9、维生素D3图信息

实施例5

用实施例1的方法采用下述条件对某公司同时含有维生素A、维生素D₂、D₃的产品样品进行检测，测得其含量合格。

色谱条件色谱柱Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)；流动相甲醇-水体系比例为96∶4，流速1.0ml/min，进样量50μl，柱温：30℃，维生素A、E的检测波长300nm，维生素D的检测波长265nm。在此色谱条件下，维生素D2、维生素D3的保留时间分别为20.073min、21.584min(图4-1)；维生素A的保留时间为6.647min(图4-2)；各物质分离良好，以各物质的峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，相关系数r均＞0.999，说明峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表10、图4-1峰图信息

表11、图4-2峰图信息

实施例6

用实施例1的方法采用下述条件对某公司同时含有维生素D₃、维生素A、α-维生素E的产品样品进行检测，测得其含量合格。

色谱条件色谱柱Waters Symmetry C₁₈(250×4.6mm，5μm)；流动相甲醇-水体系比例为96∶4，流速1.0ml/min，进样量50μl，柱温：进样量50μl，维生素A、E的检测波长300nm，维生素D的检测波长265nm。在此色谱条件下，维生素D3的保留时间为22.814min(图5-1)；维生素A的保留时间为6.647min(图5-2)；α-维生素E的保留时间为28.774min(图5-2)。各物质分离良好，以各物质的峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，相关系数r均＞0.999，说明峰面积对浓度呈良好的线性关系。

表12、图5-1峰图信息

表13、图5-2峰图信息

试验结果表明，本发明对保健食品复合维生素以及单一维生素A、D、E中维生素A、D、E分离良好。可以准确测定保健食品复合维生素以及单一维生素A、D、E中维生素A、D、E的含量。

Claims (3)

1.一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)待测样品溶液的制备：称取质量为m克的待测复合维生素样品于100ml容量瓶中，加入氨水调节至pH值为7.8～8.5，加入300mg-500mg的胰蛋白酶，于65℃超声波水浴处理20-40min，静置冷却至室温，乙醇定容至刻度，摇匀过滤，滤除残渣，取V₁ml滤液于已装有50ml石油醚和5ml-10ml水的100ml的容量瓶中，振荡容量瓶使滤液分层，静置10min；取V₂ml石油醚提取液于40℃水浴中氮气吹干仪下氮吹浓缩后，用1ml甲醇溶解定容，得到待测样品溶液；

(2)标准品溶液的制备：

维生素D₂、维生素D₃混合标准品溶液的制备：

①取维生素D₂、维生素D₃对照品各10mg，分别用甲醇溶解并定容至100ml棕色容量瓶中；②取步骤①获得的维生素D₂溶液V微升、维生素D₃溶液V微升，分别用无水乙醇稀释至10.00mL，得到维生素D₂的标准储备液和D₃的标准储备液，分别用表1所述的条件用紫外分光光度计测定维生素D₂储备液和维生素D₃储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(1)计算出维生素D₂标准储备液和维生素D₃标准储备液的浓度；所述的维生素D₂、维生素D₃标准储备液的测定条件如表1所示：

表1

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-9}}$ ……………………公式(1)

式中：C-维生素D₂或维生素D₃标准储备液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

A-维生素D₂或维生素D₃的紫外吸光值；

V-加入标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素D₂或维生素D₃溶液1％的比吸光系数；

为维生素D₂或维生素D₃标准储备液稀释倍数；

③取步骤②维生素D2、维生素D3的标准储备液各0.1mL，分别用甲醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度分别为C1μg/ml的维生素D2和C2μg/ml的维生素D3的标准品溶液，合并二标准品溶液，得到维生素D2、维生素D3混合标准品溶液；

维生素A标准品溶液的制备：

①取维生素A，对照品10mg用脱醛乙醇溶解并定容至10ml棕色容量瓶中；

②取步骤①维生素A溶液V微升，用乙醇稀释至10.00毫升，得到维生素A的标准储备液，用紫外分光光度计按照325nm测定维生素A标准储备液中的维生素A吸光值，并用维生素A的比吸光系数按照公式(2)计算出该维生素A标准储备液的浓度；

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(2)

C-维生素A标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-维生素A的紫外吸光值；

V-加入维生素A标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-维生素A溶液1％比吸光系数；

为维生素A标准标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中维生素A标准储备液0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，得到浓度为C3μg/ml的维生素A标准品溶液；

α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E混合标准品溶液的制备：

①取α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E对照品各10mg，分别用脱醛乙醇溶解并定容至10ml容量瓶中；

②分别取步骤①中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E溶液V微升，分别用乙醇稀释至10.00毫升，分别得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的标准储备液，分别用表2所述的条件用紫外分光光度计测定各标准储备液的的吸光值，用各自的比吸光系数E按照公式(3)分别计算出各标准储备液的浓度；

表2：

$C=\frac{A\×1\×10.00}{E\×100\×V\×{10}^{-6}}$ …………………………公式(3)

C-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的平均紫外吸光值；

V-加入α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液的量，单位为微升(μL)；

E-α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E标准储备液1％的比吸光数；

为标准储备液稀释倍数；

③取步骤②中α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准储备液各0.1mL，用脱醛乙醇稀释并定容至10ml容量瓶中，即得到浓度分别为C4μg/ml、C5μg/ml、C6μg/ml的α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E标准品溶液，合并上述三个标准品溶液，得到α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的混合标准品溶液；

(3)取步骤(1)的待测样品溶液V₃μl、步骤(2)制备的已知浓度的溶液各V₄μl，分别注入高效液相色谱仪中，用Waters反相C₁₈色谱柱进行色谱分离，二极管阵列检测器检测，得到上述标准品溶液和待测样品溶液的高效液相色谱图，通过上述标准品溶液中各维生素的保留时间定性判定待测样品溶液中的各维生素；所述的高效液相色谱仪的流动相为乙腈-甲醇-水体系或甲醇-水体系；

(4)通过维生素A、D、E混合标准品溶液与待测样品溶液中维生素A、D、E色谱图中各维生素峰面积的比例关系，并根据各维生素标准品溶液的浓度C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆分别获得待测样品溶液中所含维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度；

(5)根据步骤(4)中得到的维生素A、D₂、D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的质量浓度，分别通过下述公式计算待测样品溶液中维生素A、维生素D₂、维生素D₃、α-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E的含量：

a、复合维生素待测品中维生素A含量的计算公式为：

$X_1=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₁为复合维生素待测样品中维生素A的含量，μg/g；

C为维生素A待测样品溶液的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的质量，单位为g

b、复合维生素待测品中维生素D₂或D₃的计算公式为：

$X_2=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)\×40\×1.07}{m}$

式中：X₂为复合维生素待测样品中维生素D₂或D₃含量，I.U/g；

C为待测样品溶液中维生素D₂或D₃的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g

40为1μg维生素D₂或D₃的国际单位数

1.07为维生素D₂或D₃的换算系数

c、复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E含量的计算公式为：

$X_3=\frac{C\×(100/V_1)\×(100/V_2)\×(V_3/V_4)}{m}$

式中：X₃为复合维生素待测样品中α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的含量，单位为μg/g；

C为维生素E待测样品溶液α-维生素E、γ-维生素E或δ-维生素E的质量浓度，单位为μg/ml；

m为复合维生素待测样品的称取量，单位为g。

2.根据权利要求1所述的一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，其特征是，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为体积比为25∶75∶4的乙腈-甲醇-水，流速为1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

3.根据权利要求1所述的一种测定复合维生素中维生素A、维生素D和维生素E的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱仪的色谱条件为：流动相为甲醇-水体系，所述的流动相为体积比为96∶4的甲醇-水，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，维生素D检测波长：265nm，维生素A、维生素E检测波长300nm，所述的色谱柱为Waters反相C₁₈硅胶色谱柱。

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