CN104502501A - 一种快速测定维生素d3含量的色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定维生素D3含量的色谱方法，运用高效液相色谱法(HPLC) 测定维生素D3含量的方法，通过对色谱条件的巧妙优化，最终达到快速而准确地对复杂组分样品中维生素D3含量的测定。该色谱方法包括以下步骤: （1）对照品溶液的制备；（2）样品处理；（3）液相色谱条件：色谱柱：硅胶柱，50×4.6mm，2.7μm；流速：2ml/min；流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5的体积比混合均匀；检测波长：264nm；进样量：75μl。该色谱方法能够简便、快速、准确的测定维生素D3含量，缩短分析时间，减少溶剂使用量，降低分析成本。

Description

一种快速测定维生素D3含量的色谱方法

技术领域

本发明涉及一种运用高效液相色谱法(HPLC) 测定维生素D3含量的方法，通过对色谱条件的巧妙优化，最终达到快速而准确地对复杂组分样品中维生素D3含量的测定。

背景技术

维生素D3是维生素D类，是类固醇衍生物，目前认为它也是一种类固醇激素。主要帮助钙、磷的吸收，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度；促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全；维持血液中柠檬酸盐的正常水平；防止氨基酸通过肾脏损失。体内的胆固醇可变为7-脱氢胆固醇，储存在皮下，在阳光及紫外线照射下可转变成维生素D3，但是住在寒冷地带、皮肤颜色较深或长期处于室内的人群都可能得不到充足的阳光照射，而无法满足维生素D3吸收的要求。所以人体需要补充维生素D3。但据研究人员估计，长期每天摄入0.025克维生素D对人体有害。可能造成的后果是：恶心、头痛、肾结石、肌肉萎缩、关节炎、关节异常钙化、动脉硬化、高血压、高血钙、食欲不振、轻微中毒、腹泻、口渴，体重减轻，多尿及夜尿等症状。严重中毒时则会损伤肾脏，使软组织（如心、血管、支气管、胃、肾小管等）钙化。所以任何补充剂中的维生素D3含量测定就显得尤为重要。

在已知的维生素D3含量的测定方法中，主要是HPLC法，但是存在提取次数多，损失量大，分析时间长等缺陷。随着科技的不断发展，速度和成本控制已是企业生存的关键。为了提高检测速度，很多企业选择超高效液相色谱仪（UHPLC），但是成本却非常高。为了解决这一难题，本发明通过对色谱条件的优化，运用普通高效液相色谱仪就能快速而准确的分析维生素D3的含量。本发明不仅缩短了分析时间，同时也减少了溶剂用量降低了分析成本。

发明内容

本发明的目的在于对常用色谱条件进行优化，提供了一种简便、快速、准确的测定维生素D3含量的方法，缩短分析时间，减少溶剂使用量，最终达到降低分析成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速测定维生素D3含量的色谱方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

采用USP 标准品作为维生素D3对照品，精密称定一定量的维生素D3 对照品，用正己烷溶解，配制成浓度为45-55mg/mL 的标准储备液，每次试验前用正己烷稀释储备液，配制成浓度为0.45-0.55μg/mL的标准工作溶液；

（2）样品处理：

取若干样品磨成细粉，精密称取一定量细粉于一棕色容量瓶中，加二甲亚砜，塞紧瓶塞；上述溶液于超声水浴机中60℃下强烈超声约45分钟，取出冷却至室温；再加入正己烷，强烈振摇，再加18%NaCl溶液，充分振摇5分钟，待静置分层后，轻轻吸取上层液体于50mL离心管中，高速离心15分钟；取正己烷层上清液注入液相色谱仪；

（3）液相色谱条件：

色谱柱：硅胶柱，50×4.6mm，2.7μm；

流速： 2ml/min；

流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5 的体积比混合均匀；

检测波长：264nm；                    

进样量：75μl。

更进一步地，通过样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系计算样品中维生素D3的含量，该计算公式为：

式中    A样：为样品溶液中维生素D3峰面积；

C标：为标准工作溶液的浓度，μg/mL；

A标：为标准工作溶液中维生素D3峰面积；

W样：为样品称重，g。

更进一步地，所述的标准贮备溶液的配制为：精密称取一定量的维生素D3对照品于一棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度。

更进一步地，所述的标准工作溶液的配制为：精密吸取一定量标准贮备溶液于一棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度。

更进一步地，所述的步骤二中的样品为固体样品则需先用研钵及研杵研磨成细粉后使用，若样品为液体样品则直接取用，若样品为胶囊样品则取若干胶囊的内容物，研磨混合均匀后使用。

更进一步地，所述的方法适用于含维生素D3的片剂、硬胶囊、粉剂、软胶囊、滴剂、丸剂、软糖及饮料，产品可以是保健食品、药品、普通食品或预混料。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

本发明以二甲基亚砜溶剂溶解样品，能使样品中VD3彻底溶解出来，再用正己烷把VD3完全提取出来，同时加18%NaCl溶液可以使二甲亚砜层与正己烷层分层更清晰明显，有利于下一步的实验；最主要的是本发明采用5cm 硅胶柱代替传统的25cm硅胶柱，检测速度提高了5倍，同时溶剂用量也减少了，分析成本明显降低。而且此方法做了方法学验证，结果如下：线性方程为y=104.06x-0.3836，R为0.9997，重复性RSD为0.49%；方法检出限为0.0089625mcg；加标回收率为99.9%；证明该方法的线性、重现性、分离度、回收率良好。本发明提供了一种简便、快捷、准确且低成本测定维生素D3含量的液相方法，检测产品可以是保健食品、药品、普通食品或预混料，适用范围广，实用性强。

附图说明

图1（a）为现有HPLC方法对实施例1中标准品测定的结果；

图1（b）为现有HPLC方法对实施例1中样品测定的结果；

图2（a）为应用本发明方法对实施例1中的标准品测定的结果；

图2（b）为应用本发明方法对实施例1中的样品测定的结果；

图3（a）为现有HPLC方法对实施例2中标准品测定的结果；

图3（b）为现有HPLC方法对实施例2中样品测定的结果；

图4（a）为应用本发明方法对实施例2中的标准品测定的结果；

图4（b）为应用本发明方法对实施例2中的样品测定的结果；

图5（a）为现有HPLC方法对实施例3中标准品测定的结果；

图5（b）为现有HPLC方法对实施例3中样品测定的结果；

图6（a）为应用本发明方法对实施例3中的标准品测定的结果；

图6（b）为应用本发明方法对实施例3中的样品测定的结果。

具体实施方式

    下面通过实施例对发明作进一步详细的说明。

实施例1

Calcium Citrate 315mg+VitD3 250IU Tablet（江苏艾兰得营养品有限公司生产）样品中维生素D3含量的测定：

本发明所用试剂及配制：正己烷：色谱纯；异丙醇：色谱纯；氯化钠：分析纯。

（1）标准贮备溶液：精密称取12.5mg维生素D3对照品于一250ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为50μg/mL。

标准工作溶液：精密吸取1.0mL上述标准贮备溶液于一100mL棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为0.5μg/mL。

（2）样品处理：

精密称取2.0g细粉于一200mL棕色容量瓶中，加50mL二甲亚砜，塞紧塞子；上述溶液于超声水浴机中60℃下强烈超声约45分钟，取出冷却至室温；加入25.0mL正己烷，强烈振摇，再加18%NaCl溶液15ml,充分振摇5分钟，待静置分层后，轻轻吸取上层液体于一50mL离心管中，高速离心约15分钟；取正己烷层上清液注入液相色谱仪。

（3）色谱条件：

色谱柱：硅胶柱， 50×4.6mm，2.7μm

流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5 的体积比混合均匀

流速： 2ml/min

检测波长：264nm                       

进样量：75μl

（4）计算：

式中    A样：为样品溶液中维生素D3峰面积；

C标：P为标准工作溶液的浓度，μg/mL；

A标：为标准工作溶液中维生素D3峰面积；

W样：为样品称重，g。

（5）样品检测结果：

如图1（a）和（b）所示，其中图1（a）为标准品的测定结果，图1（b）为实际样品的测定结果。t=15.3min附近的峰为维生素D3测定峰，原有传统方法维生素D3保留时间一般为15min左右；而本发明的保留时间才为3min，如图2（a）和（b），其中图2（a）为标准品的测定结果，图2（b）为实际样品的测定结果。t=3.0 min附近的峰为维生素D3测定峰，其速度提高了整整5倍，同时流动相用少了，成本也降低了很多。

实施例2

Calcium 600mg&VitD3 500IU Softgel（江苏艾兰得营养品有限公司生产）软胶囊中维生素D3含量的测定：

本发明所用试剂及配制：正己烷：色谱纯；异丙醇：色谱纯；氯化钠：分析纯。

（1）标准贮备溶液：精密称取11.25mg维生素D3对照品于一250ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为45μg/mL。

标准工作溶液：精密吸取1.0mL上述标准贮备溶液于一100mL棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为0.45μg/mL。

（2）样品处理：

精密称取2.0g内容物于一200mL棕色容量瓶中，加50mL二甲亚砜，塞紧塞子；上述溶液于超声水浴机中60℃下强烈超声约45分钟，取出冷却至室温；加入25.0mL正己烷，强烈振摇，再加18%NaCl溶液15ml,充分振摇5分钟，待静置分层后，轻轻吸取上层液体于一50mL离心管中，高速离心约15分钟；取正己烷层上清液注入液相色谱仪。

（3）色谱条件：

色谱柱：硅胶柱， 50×4.6mm，2.7μm

流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5 的体积比混合均匀

流速： 2ml/min

检测波长：264nm                       

进样量：75μl

（4）计算：

式中    A样：为样品溶液中维生素D3峰面积；

C标：P为标准工作溶液的浓度，μg/mL；

A标：为标准工作溶液中维生素D3峰面积；

W样：为样品称重，g。

（6）样品检测结果：

如图3（a）和（b）所示，其中图3（a）为标准品的测定结果，图3（b）为实际样品的测定结果。t=15.0min附近的峰为维生素D3测定峰，原有传统方法维生素D3保留时间一般为15min左右；而本发明的保留时间才为2.9min，如图4（a）和（b），其中图4（a）为标准品的测定结果，图4（b）为实际样品的测定结果。t=2.9min附近的峰为维生素D3测定峰，其速度提高了整整5倍，同时流动相用少了，成本也降低了很多。

实施例3

钙条包粉剂（江苏艾兰得营养品有限公司生产）样品中维生素D3含量的测定：

本发明所用试剂及配制：正己烷：色谱纯；异丙醇：色谱纯；氯化钠：分析纯。

（1）标准贮备溶液：精密称取13.75mg维生素D3对照品于一250ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为55μg/mL。

标准工作溶液：精密吸取1.0mL上述标准贮备溶液于一100mL棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为0.55μg/mL。

（2）样品处理：

精密称取8.0g细粉于一200mL棕色容量瓶中，加50mL二甲亚砜，塞紧塞子；上述溶液于超声水浴机中60℃下强烈超声约45分钟，取出冷却至室温；加入25.0mL正己烷，强烈振摇，再加18%NaCl溶液15ml,充分振摇5分钟，待静置分层后，轻轻吸取上层液体于一50mL离心管中，高速离心约15分钟；取正己烷层上清液注入液相色谱仪。

（3）色谱条件：

色谱柱：硅胶柱， 50×4.6mm，2.7μm

流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5 的体积比混合均匀

流速： 2ml/min

检测波长：264nm                       

进样量：75μl

（4）计算：

式中    A样：为样品溶液中维生素D3峰面积；

C标：P为标准工作溶液的浓度，μg/mL；

A标：为标准工作溶液中维生素D3峰面积；

W样：为样品称重，g。

（7）样品检测结果：

如图5（a）和（b）所示，其中图5（a）为标准品的测定结果，图5（b）为实际样品的测定结果。t=16.5min附近的峰为维生素D3测定峰，原有传统方法维生素D3保留时间一般为15min左右；而本发明的保留时间才为3min，如图6（a）和（b），其中图6（a）为标准品的测定结果，图6（b）为实际样品的测定结果。t=3.0 min附近的峰为维生素D3测定峰，其速度提高了整整5倍以上，同时流动相用少了，成本也降低了很多。

Claims (6)

1.一种快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

采用USP 标准品作为维生素D3对照品，精密称定一定量的维生素D3 对照品，用正己烷溶解，配制成浓度为45-55mg/mL 的标准储备液，每次试验前用正己烷稀释储备液，配制成浓度为0.45-0.55μg/mL的标准工作溶液；

（2）样品处理：

精密称取一定量样品于一棕色容量瓶中，加二甲亚砜，塞紧瓶塞；将上述溶液于超声水浴机中60℃下强烈超声约45分钟，取出冷却至室温；再加入正己烷，强烈振摇，再加18%NaCl溶液，充分振摇5分钟，待静置分层后，轻轻吸取上层液体于50mL离心管中，高速离心15分钟；取正己烷层上清液注入液相色谱仪；

（3）液相色谱条件：

色谱柱：硅胶柱，50×4.6mm，2.7μm；

流速： 2ml/min；

流动相：将异丙醇与正己烷按照异丙醇：正己烷=0.5：99.5 的体积比混合均匀；

检测波长：264nm；

进样量：75μl。

2.如权利要求1所述的快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：

通过对照品的保留时间对样品进行定性，外标法计算样品中维生素D3的含量，该计算公式为：

式中    A样：为样品溶液中维生素D3峰面积；

C标：为标准工作溶液的浓度，μg/mL；

A标：为标准工作溶液中维生素D3峰面积；

W样：为样品称重，g。

3.如权利要求1所述的快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：所述的标准贮备溶液的配制为：精密称取一定量的维生素D3对照品于一棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度。

4.如权利要求1所述的快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：所述的标准工作溶液的配制为：精密吸取一定量标准贮备溶液于一棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度。

5.如权利要求1所述的快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：所述的步骤二中的样品为固体样品则需先用研钵及研杵研磨成细粉后使用，若样品为液体样品则直接取用，若样品为胶囊样品则取若干胶囊的内容物，研磨混合均匀后使用。

6.如权利要求1所述的快速测定维生素D3含量的色谱方法，其特征在于：所述的方法适用于含维生素D3的片剂、硬胶囊、粉剂、软胶囊、滴剂、丸剂、软糖及饮料，产品可以是保健食品、药品、普通食品或预混料。