CN107543886A - 一种八味龙钻颗粒中三种活性成分含量同时测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPLC法同时测定八味龙钻颗粒中橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素三种活性成分含量的方法，该方法采用的色谱条件如下：色谱柱Phenomenex Gemini C18 (250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈：0.1%磷酸水（梯度洗脱）；流速为1ml.min^‑1；检测波长为286nm和245nm（0~30min：286nm，30~40min：245nm）；柱温30℃。进样量：5μL。在此色谱条件下，色谱峰分离良好，橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素分别在84.68～508.1μg.ml^‑1、16.84～101.0μg.ml^‑1、5.504～33.02μg.ml^‑1浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系（r分别为0.99053、1.00000、0.99998）；平均加样回收率分别为98.1%、99.9%、100.1%，RSD分别为1.3%、2.7%、2.5%（n=6）。本方法简单、快速、准确、重现性好，可为全面评价和控制八味龙钻颗粒的质量提供理论依据。

Description

一种八味龙钻颗粒中三种活性成分含量同时测定的方法

技术领域

本发明涉及一种中药六类新药八味龙钻颗粒中活性成分的检测方法，具体的说是一种同时测定八味龙钻颗粒中三种活性成分的方法，属于医药技术领域。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见慢性病及疑难疾病，严重危害人类健康；类风湿性关节炎的治疗有多种，包括外科手术、理疗、替代疗法等方法，但以药物治疗为主，使用的药物包括免疫抑制剂、调节性抗类风湿药、非甾体类抗炎药、肾上腺皮质激素等；目前临床上使用的各种抗风湿药物仅能减轻症状，不能根本阻止疾病的发展，并伴随较强的毒副作用。因此，寻求研发高效低毒的抗RA 的新药物、新技术是极为重要而紧迫的任务，而祖国传统医药及少数民族医药，特别是广西壮医药在防治 RA面具有较大的潜力优势与鲜明特色。

壮药“八味龙钻颗粒”是广西中医药大学制药厂与广西中医药大学拟联合研发的国家六类新药，其处方为壮医药专家庞宇舟教授在挖掘总结壮医治疗活动期类风湿关节炎的传统药物的基础上，按照壮医理论配伍组方的经验方，临床治疗活动期RA效果显著。该产品处方由飞龙掌血、大钻、八角枫、两面针、青风藤、九龙藤、五指毛桃、鸡血藤等壮药材按壮医理论配伍而成。主药(君药)飞龙掌血性味辛、苦、温，活血散瘀、消肿止痛；大钻辛、温，擅于祛风活血。帮药八角枫为辛温、有毒之品，能疏风除湿、消肿镇痛；两面针辛、苦、温，行气止痛、活血化瘀、祛风通络；青风藤，九龙藤味苦，祛风散瘀、利湿止痛；五指毛桃根甘寒，为补气之品；鸡血藤苦甘温兼具养血之用，两者可兼顾补益气血，同时制约其它诸药发散太过之弊。

中成药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中成药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成份的含量测定方法将成为中成药未来质量控制方法的主流。现代研究表明，八味龙钻颗粒中飞龙掌血和两面针药材中均含有橙皮苷、氯化两面针碱等活性成分。其中橙皮苷具有抗炎、抗氧化等药理活性，氯化两面针碱对抗肿瘤、抗炎都有一定的作用。五指毛桃主要活性成分为补骨脂素，也可作为评价该制剂质量的重要依据。目前，国内已公开八味龙钻颗粒一种或两种活性成分含量测定的方法，这些方法检测指标少，有可能导致其它组分不稳定或缺乏，难以全面准确控制药品质量。因此必需建立一种快速、准确、全面分离、检测八味龙钻颗粒中多种活性成分的方法，以便更好地对该产品进行质量监控和用药安全。

本发明建立了同时测定八味龙钻颗粒制剂中飞龙掌血及两面针药材中的主要成分橙皮苷和氯化两面针碱及五指毛桃中的补骨脂素成分含量的检测方法，实验结果表明，本法建立的HPLC转换波长同时测定制剂中多个不同指标成分的含量测定方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时测定中药六类新药八味龙钻颗粒中三种活性成分橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素含量的方法，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。

本发明的目的是这样实现的：利用高效液相色谱及转换波长检测的方法，同时测定制剂中飞龙掌血及两面针药材中的主要成分橙皮苷和氯化两面针碱及五指毛桃中的补骨脂素成分含量，具体步骤如下：

(1)混合对照品溶液的制备精密称取橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为1.084mg.mL^-1、1.988mg.mL^-1及1.056mg.ml^-1的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素浓度分别为0.2117mg.ml^-1、0.0421mg.ml^-1、 0.01376mg.ml^-1的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

(2)供试品溶液制备取八味龙钻颗粒约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25ml盐酸-甲醇 (1:100)，称定重量，超声20min，放冷，再次称重，用盐酸-甲醇(1:100)补足减失的重量，摇匀，过滤，蒸干，再用50％甲醇溶解并定容到10ml容量瓶中，摇匀过滤，离心，取续滤液，即得。

(3)色谱条件及样品检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入安捷伦1260高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱[0～15min，25％A；15～20min，27％A；20～30min，30％A；30～40min，33％A]；检测波长:0～30min：286nm，30～40min：245nm；流速为1ml.min^-1；柱温30℃；进样量5μL，即可。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制八味龙钻颗粒质量提供理论基础和科学依据。

2、本发明方法采用高效液相色谱法及转换波长检测的方法，利用梯度洗脱方式，实现了同时测定八味龙钻颗粒中3种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定八味龙钻颗粒中有效成分橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分回收率均在95％以上。

3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为八味龙钻颗粒有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。

附图说明

图1是本发明橙皮苷、氯化两面针碱和补骨脂素混合对照品溶液(A)、样品溶液(B)、缺五指毛桃阴性对照(C)、缺飞龙掌血及两面针阴性对照(D)的HPLC图谱.

附图标记说明：1-橙皮苷峰 2-氯化两面针碱峰 3-补骨脂素峰

A-橙皮苷、氯化两面针碱和补骨脂素混合对照品溶液HPLC图

B-样品溶液HPLC图

C-缺五指毛桃阴性对照

D-缺飞龙掌血及两面针阴性对照

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

1材料与仪器

1.1材料 氯化两面针碱对照品(MUST-16030407，含量98.3％)购于中国科学院成都生物研究所、补骨脂素对照品(供含量测定用，110739-201617)和橙皮苷对照品(供含量测定用，110721-201617)均购于中国食品药品检定研究院；10批八味龙钻颗粒均由广西中医药大学制药厂提供；实验所有的原药材由广西中医药大学制药厂提供，经广西中医药大学药厂质量保证部鉴定；乙腈(色谱纯；Fisher公司)；盐酸、甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.2仪器 Agilent-1260高效液相色谱仪；Alltech1260-UV型紫外检测器；电子天平(SQP，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；超声清洗器(KQ5200，昆山市超声仪器有限公司)；离心机(L600台式低速离心机和TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)；超纯水由密思博超纯水机制备等。

2具体步骤如下：

2.1色谱条件 采用Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱[0～15min，25％A；15～20min，27％A；20～30min，30％A；30～40min，33％A]；检测波长:0～30min：286nm，30～40min：245nm；流速为1ml.min^-1；柱温30℃；进样量5μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为1.084mg.mL^-1、1.988mg.mL^-1及1.056mg.ml^-1的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素浓度分别为0.2117mg.ml^-1、0.0421mg.ml^-1、 0.01376mg.ml^-1的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.2.2供试品溶液制备 取八味龙钻颗粒约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25ml盐酸-甲醇 (1:100)，称定重量，超声20min，放冷，再次称重，用盐酸-甲醇(1:100)补足减失的重量，摇匀，过滤，蒸干，再用50％甲醇溶解并定容到10ml容量瓶中，摇匀过滤，离心，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照液制备 按药材处方比例称取缺飞龙掌血和两面针及缺五指毛桃的药材，分别按处方工艺提取，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3系统适用性试验 分别取对照品、样品及阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，实验结果显示：对照品色谱中与样品色谱在相同保留时间处都有色谱峰，而阴性対照液中无相应峰，说明样品中其他成分对橙皮苷、氯化两面针碱和补骨脂素这3个成分的测定无干扰，理论塔板数均大于5000，拖尾因子均在 0.95～1.05之间，结果见图1。

2.4线性范围考察 从“2.2.1”制备的混合对照品溶液逐级稀释，依次得到6份3个成分不同浓度的对照品溶液，按“2.1”色谱条件进行测定，分别测定峰面积，以各成分浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到回归方程，见表1。

表1回归方程及线性范围

2.5精密度试验 取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”色谱条件测定，连续进样6次，分别测定橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的峰面积，计算RSD值分别为0.23％、0.18％、0.51％，表明精密度良好。

2.6稳定性试验 取八味龙钻颗粒(批号20170501)，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备一份供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h，依次测定其峰面积，计算橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素峰面积RSD值分别为0.62％、2.1％、2.3％，表明样品溶液在24h内稳定。

2.7重复性试验 取八味龙钻颗粒(批号20170501)3.0g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液 6份，按“2.1”项下色谱条件测定，结果橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素平均含量分别：1.5008mg.g^-1、 0.2661mg.g^-1、0.0638mg.g^-1，RSD值分别为0.50％、2.4％、2.6％，结果表明该方法的重复性良好。

2.8加样回收试验 取八味龙钻颗粒(批号20170501)(橙皮苷、氯化两面针碱、补骨脂素平均含量分别为 1.5008、0.2661、0.0638mg.g^-1)1.5g，共6份，精密称定，分别精密加入橙皮苷，氯化两面针碱，补骨脂素对照品各2.2600mg、0.4000mg、0.0900mg。按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测定各峰面积，计算橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素各加样回收率分别为98.1％、 99.9％、100.1％，RSD值分别为1.3％、2.7％、2.5％，表明回收率良好，见表2。

表2加样回收率试验的结果(n＝6)

2.9样品测定 取10批八味龙钻颗粒(批号：20170501)各约3g，每批2份，共20份，精密称定，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，根据橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的峰面积，计算橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的平均含量，结果见表3。

表3样品含量测定结果(mg·g-1,n＝2)

综上，本发明所建立的HPLC法同时测定八味龙钻颗粒中橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素三种活性成分含量的方法，具有操作简便、精密度好、重复性高的特点，可全面、更有效地控制该药品的质量。

Claims (4)

1.一种八味龙钻颗粒中三种活性成分含量的测定方法，其特征在于：该方法利用高效液相色谱法(HPLC)在同一实验条件下同时分离并测定八味龙钻颗粒中橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的含量。

2.对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为1.084mg.mL^-1、1.988mg.mL^-1及1.056mg.ml^-1的对照品储备液，另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素浓度分别为0.2117mg.ml^-1、0.0421mg.ml^-1、0.01376mg.ml^-1的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

3.供试品溶液的制备：取八味龙钻颗粒约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25ml盐酸-甲醇（1:100），称定重量，超声20min，放冷，再次称重，用盐酸-甲醇（1:100）补足减失的重量，摇匀，过滤，蒸干，再用50%甲醇溶解并定容到10ml容量瓶中，摇匀过滤，离心，取续滤液，即得。

4.分离检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入安捷伦1260高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱Phenomenex Gemini C18 (250mm×4.6mm, 5μm)；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱［0~15min，25%A；15~20min，27%A；20~30min，30%A；30~40min，33%A］；检测波长: 0~30min：286nm，30~40min：245nm；流速为1ml.min^-1；柱温30℃；进样量5μL，即可。