CN104969067A - 维生素d的测定方法及测定用试剂盒 - Google Patents

维生素d的测定方法及测定用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种维生素D的测定方法。具体而言，本发明提供包含以下的维生素D的测定方法：1)用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品；及2)在被处理的样品中检测维生素D。本发明还提供一种包含以下的维生素D的测定用试剂盒：1)具有类固醇骨架的表面活性剂；以及2)具有维生素D亲和性的物质和/或维生素D标准品。作为具有类固醇骨架的表面活性剂，可列举例如胆汁酸或其衍生物或它们的盐。

Description

维生素D的测定方法及测定用试剂盒
技术领域
本发明涉及一种维生素D的测定方法等。
背景技术
已知维生素D类(以下，简称为维生素D)在血中与结合蛋白质(DBP：维生素D结合蛋白质。也称为Gc球蛋白)牢固地结合。因此，为了用抗原抗体法准确地测定维生素D，需要维生素D和DBP的解离操作(前处理)。作为这样的前处理，除改性剂(例如：酸、蛋白改性剂、表面活性剂、水解酶)，可使用有机溶剂(例如：乙醇、甲醇、DMSO)(专利文献1～7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第03/104820号
专利文献2:国际公开第07/039194号
专利文献3:国际公开第02/046746号
专利文献4:国际公开第04/063704号
专利文献5:国际公开第08/092917号
专利文献6:国际公开第02/057795号
专利文献7:国际公开第07/140962号
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供一种维生素D的测定方法等。
用于解决问题的技术方案
本发明人等进行了潜心研究的结果发现：通过用具有类固醇骨架的表面活性剂处理含维生素D的样品，可以准确地测定维生素D等，从而完成本发明。
即、本发明如下所述。
[1]一种维生素D的测定方法，该方法包括：
1)用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品；及
2)在经过处理的样品中检测维生素D。
[2]如[1]的方法，其中，所述表面活性剂为胆汁酸或其衍生物或它们的盐。
[3]如[1]或[2]的方法，其中，所述表面活性剂具有类固醇骨架，所述类固醇骨架在7位上不具有羟基。
[4]如[1]～[3]中任一项的方法，其中，所述表面活性剂为脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸或它们的盐。
[5]如[1]～[4]中任一项的方法，其还包括：用与所述表面活性剂不同的其它改性剂处理样品。
[6]如[5]的方法，其中，其它改性剂为含有疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂，所述疏水性部分由烃链构成。
[7]如[1]～[6]中任一项的方法，其中，样品的处理仅通过混合而进行。
[8]如[1]～[7]中任一项的方法，其为包括以下的方法：
1’)用含有具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质的反应液处理样品；以及，
2’)在经过处理的样品中检测维生素D。
[9]如[1]～[7]中任一项的方法，其包括以下步骤：
1”)用包含改性剂的前处理液处理样品；
2”)将所述1”)中被处理的样品用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液进行处理；以及，
3”)在所述2”)中被处理的样品中检测维生素D。
[10]如[1]～[9]中任一项的方法，其中，样品为来自人的样品。
[11]如[1]～[10]中任一项的方法，其中，样品为血液关联样品。
[12]一种维生素D的测定用试剂盒，其包含以下：
1)具有类固醇骨架的表面活性剂；以及
2)具有维生素D亲和性的物质和/或维生素D标准品。
发明的效果
本发明的方法能够用于维生素D的测定。根据本发明，可以迅速且简便地测定维生素D。
本发明的试剂盒例如能够用于简便地实施本发明的方法。
附图说明
图1表示通过利用脱氧胆酸钠进行的血清样品的处理而得到的测定值和利用Diasorin RIA法所得的测定值的高的相关性(R2＝0.8993)。
图2表示通过利用有机溶剂进行的血清样品的处理而得到的测定值和利用Diasorin RIA法所得的测定值的低的相关性(R2＝0.8327)。
图3表示通过利用含有脱氧胆酸钠、SDS及抗体的反应液进行的血清样品的处理而得到的测定值和利用Diasorin RIA法所得的测定值的高的相关性(R2＝0.9881)。
图4表示利用凝胶过滤色谱法对人血清样品在对照缓冲液(Tris-HCl)中进行洗脱时含25-OH维生素D的组分的图。DCNa：脱氧胆酸钠(以下同样)
图5表示利用蛋白质印迹得到的含有维生素D结合蛋白质的组分。
图6表示利用凝胶过滤色谱法进行的脱氧胆酸钠溶液中人血清维生素D及游离维生素D的洗脱组分。
图7表示从维生素D结合蛋白质及25-OH维生素D3的复合体释放25-OH维生素D3的程度。关于1～4的实验条件，参照表8。
具体实施方式
(A.维生素D的测定方法)
本发明提供一种样品中维生素D的测定方法。
本发明的方法包括以下：
1)用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品；以及，
2)在被处理的样品中检测维生素D。
(A-1.工序1)
首先，用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品。
本发明的方法中使用的样品含有或怀疑含有以下所示的维生素D或其代谢产物。作为维生素D的代谢产物，可列举例如在维生素D上加成有羟基的化合物、25-OH维生素D2、25-OH维生素D3、1,25-(OH)2维生素D2、1,25-(OH)2维生素D3。本说明书中进行使用的情况下，只要没有特别指定，术语“维生素D”包括性地含有维生素D2及维生素D3、及与维生素D2及维生素D3类似的药物、以及它们的代谢产物。
[化学式1]
样品的来源没有特别限定，可以为来自生物的生物学样品，或可以为环境样品等。作为生物学样品的来源生物，可列举例如：哺乳动物(例如：人、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、猪、马、山羊、绵羊)、鸟类(例如：鸡)等动物、昆虫、微生物、植物、菌类、鱼类，但优选为哺乳动物、菌类、鱼类，更优选为哺乳动物，进一步更优选为人。生物学样品还可以为血液自身或来自血液的样品即血液关联样品(例如全血、血清、血浆)、唾液、尿、乳汁、组织或细胞提取液、或者它们的混合物，但优选血液关联样品。作为环境样品，可列举来自土壤、海水、淡水的样品。
本发明的方法中使用的样品优选为含有维生素D及复合体的样品，所述复合体含有相对于维生素D具有结合能力的分子。本发明的方法具有以下优点：即使在样品中存在相对于维生素D具有强的结合能力的分子(例如蛋白质)时，也可以准确地测定维生素D。例如，已知维生素D与存在于人血清中的DBP牢固地结合，报道了其解离常数为Kd＝5×10-8(参照专利文献4)，根据本发明的方法，即使在具有这样的强结合能力的蛋白质存在于样品中时，也可以准确地测定样品中的维生素D。因此认为，即使DBP以外的相对于维生素D具有结合能力的分子(例如相对于维生素D潜在地具有结合能力的分子)存在于样品中时，也可以利用本发明的方法准确地测定维生素D。作为相对于维生素D具有结合能力的其它分子，可列举例如白蛋白、脂质。具体而言，作为含有维生素D及复合体的样品可列举例如血液关联样品(例如全血、血清、血浆)，所述复合体含有相对于维生素D具有结合能力的分子。
根据本发明的方法，关于相对于维生素D具有结合能力的分子，无论是否存在于样品中及其分子的种类、以及样品的种类，均可以测定样品中的维生素D。即，本发明的方法不会预先对这些事项的信息进行确认，或即使在相对于维生素D具有结合能力的未知分子存在于样品中时，也可以测定样品中的维生素D。因此，本发明的方法能够作为维生素D的测定中可通用的标准方法使用。
在本发明的方法中，可以利用具有类固醇骨架的表面活性剂对样品进行处理之前进行其它处理。作为这样的处理，可列举：离心分离、萃取、过滤、沉淀、加热、冻结、冷藏、搅拌。
应该利用具有类固醇骨架的表面活性剂进行处理的样品的容量，只要可以测定维生素D即可，没有特别限定，例如为0.1～1000μl，优选为0.5～100μl，更优选为1～50μl。
具有类固醇骨架的表面活性剂为以独立环状结构(即不与其它环缩合的类固醇骨架)的形式具有类固醇骨架的化合物或其盐。在具有类固醇骨架的表面活性剂中，其5位的立体结构可以为α，也可以为β。
具有类固醇骨架的表面活性剂可以为具有作为疏水性部分的类固醇骨架、及亲水性部分的化合物或其盐。作为亲水性部分，可列举例如阴离子性部分[例如磺酸酯(-SO3 -)、羧酸酯(-COO-)及磷酸酯(-POO2 -)]、阳离子性部分(例如可以用1～4个烃基进行了取代的季铵及季鎓)、非离子性亲水性部分(例如多个醚)及具有这些部分的基团(例如具有这种亲水性部分的烃基)。因此，具有类固醇骨架的表面活性剂根据亲水性部分的种类，可以为阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂。作为上述的烃基，可列举例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基(月桂基)、十四烷基(肉豆蔻基)、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、苯基及萘基。烃基优选碳原子数为1～10的烃基，更优选碳原子数为1～6的烷基。
类固醇骨架除亲水性部分之外，可以具有1～6个(优选1、2、3或4个)的取代基。作为这样的取代基，只要不会大幅损害类固醇骨架的性质(例如疏水性)即可，没有特别限定，可列举例如：碳原子数为1～10的烃基、羟基、用碳原子数为1～10的烃基进行了取代的羟基(例如烷氧基)、碳原子数为1～10的烃基-羰基-氧基(例如烷基-羰基-氧基)、羰基、甲酰基、碳原子数1～10的烃基-氧基-羰基(例如烷氧基-羰基)、卤原子(例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)及氰基。
本说明书中所使用的术语“盐”为任意盐，可列举例如无机盐、有机盐及分子内盐。作为无机盐，可列举例如：金属盐、卤化物盐、酸加成盐、及铵盐。作为金属盐，可列举例如碱金属(例如锂、钠、钠)的盐、碱土金属(例如镁、钙)的盐。作为卤化物盐中的卤，可列举例如氟、溴、氯及碘。作为无机盐的酸加成盐，可列举例如与盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的盐。作为有机盐，可列举例如与三甲基胺、三乙基胺、吡啶等形成的有机碱的盐、以及与草酸等形成的有机酸的盐。
优选具有类固醇骨架的表面活性剂为胆汁酸或其衍生物或它们的盐。作为胆汁酸，可列举例如：脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、猪胆酸、5α-鲤胆醇(5α-Cyprinol)、石胆酸、牛磺脱氧胆酸、及牛磺胆酸。作为胆汁酸的衍生物，可列举例如CHAPS、BIGCHAP及脱氧-BIGCHAP。
更优选具有类固醇骨架的表面活性剂可以具有7位上不具有羟基的类固醇骨架。作为具有7位上不具有羟基的类固醇骨架的表面活性剂，可列举例如具有7位上具有羟基以外的基团(例如除羟基的上述取代基)的类固醇骨架的表面活性剂、及具有7位上不具有取代基(即，7位的碳原子与氢原子键合)的类固醇骨架的表面活性剂。特别优选具有7位上不具有羟基的类固醇骨架的表面活性剂为具有7位上不具有取代基的类固醇骨架的表面活性剂。作为具有7位上不具有取代基的类固醇骨架的表面活性剂，可列举例如脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸及5α-鲤胆醇、以及它们的盐。
样品的处理可以使用1种或多种(例如2种或3种)的上述表面活性剂而进行。上述表面活性剂的浓度只要对维生素D测定是有效的浓度即可，就没有特别限定，可以适当调整，例如可以为0.001％(w/v)～10％(w/v)％(w/v)。
具体而言，就利用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时的所述表面活性剂的浓度而言，通过使用如后所述的反应液的方法处理样品时，只要是在反应液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.001％(w/v)～5％(w/v)。如上所述情况下，具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度优选为0.005％(w/v)以上，更优选为0.01％(w/v)以上，进一步更优选为0.02％(w/v)以上。具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度还可以优选为1％(w/v)以下，更优选为0.8％(w/v)以下，进一步更优选为0.6％(w/v)以下，特别优选为0.5％(w/v)以下。另外，使用多个表面活性剂时，各表面活性剂的浓度也如上所述。
另外，就利用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时的所述表面活性剂的浓度而言，在通过使用如后所述的前处理液的方法处理样品时，只要是在前处理液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.001％(w/v)～10％(w/v)。这如上所述的情况下，具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度可以优选为0.005％(w/v)以上，更优选为0.01％(w/v)以上，进一步更优选为0.02％(w/v)以上。具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度还可以优选为1％(w/v)以下，更优选为0.8％(w/v)以下，进一步更优选为0.6％(w/v)以下，特别优选为0.5％(w/v)以下。另外，在使用多个表面活性剂的情况下，各表面活性剂的浓度也如上所述。
并且，就利用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时的所述表面活性剂的浓度而言，在通过使用如后所述的前处理液及稀释液的方法处理样品时，只要是在前处理液、稀释液及样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.001％(w/v)～10％(w/v)。如上所述的情况下，具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度可以优选为0.005％(w/v)以上，更优选为0.01％(w/v)以上，进一步更优选为0.02％(w/v)以上。具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度还可以优选为1％(w/v)以下，更优选为0.8％(w/v)以下，进一步更优选为0.6％(w/v)以下，特别优选为0.5％(w/v)以下。另外，使用多个表面活性剂的情况下，各表面活性剂的浓度也如上所述。
在一个实施方式中，样品的处理除具有类固醇骨架的表面活性剂之外，可以组合使用与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂而进行。因此，本发明的方法可以进一步包含用其它改性剂处理样品。利用具有类固醇骨架的表面活性剂及其它改性剂进行的样品的处理可以同时进行或分开进行，优选同时进行。作为这样的改性剂，可列举例如：表面活性剂(例如：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂)、离液剂、还原剂。改性剂可以为1种，但也可以为多种(例如2种或3种)。这样的改性剂可以为了发挥改性作用而以有效的浓度使用，但可以期待改性作用以外的作用，并以发挥改性作用以外的作用的有效浓度来使用。例如，利用其它改性剂处理样品时其它改性剂的浓度可以与如上所述的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度相同。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的阴离子性表面活性剂，可列举例如：己基硫酸、辛基硫酸、癸基硫酸、十二烷基硫酸、十四烷基硫酸、十六烷基硫酸、十二烷基膦酸、十二烷基苯磺酸、正月桂酰基肌氨酸及正十二烷酰肌氨酸、以及它们的盐(例如钠盐等上述的盐)。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的阳离子性表面活性剂，可列举例如：季铵化合物及季鎓化合物(例如用1～4个如上所述的烃基取代的化合物)、以及它们的盐(例如卤化物)。作为阳离子性表面活性剂的具体例，可列举：鲸蜡基二甲基乙基铵、十六烷基三甲基铵、十六烷基三甲基铵及肉豆蔻基三甲基铵、以及它们的卤化物(例如溴化物)。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的两性表面活性剂，可列举例如：兼性离子、ASB-14、ASB-14-4、C7Bz0、EMPIGEN BB表面活性剂、3-N(N,N-二甲基辛基铵基)丙磺酸、3-正(N,N-二甲基辛基铵基)丙磺酸、3-(癸基二甲基铵基)丙磺酸、N-十二烷基N,N-二甲基-3铵基-1-丙磺酸、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸、3-(N,N-二甲基棕榈酰基铵基)丙磺酸、及3-(N,N-二甲基十八烷基铵基)丙磺酸、以及它们的盐(例如分子内盐等上述的盐)。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的非离子性表面活性剂，可列举例如：Brij35、Brij56、来自皂树属树皮的皂苷、TritonX-405、TritonX-N101、TritonX-100、TritonX-705-70、TritonX-305、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、MEGA-8、MEGA-10、NP40。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的离液剂，可列举例如：胍、尿素及硫代硫酸、以及它们的盐(例如盐酸盐等酸加成盐及钠盐等金属盐等上述盐)。
作为与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂的还原剂，可列举例如：二硫代苏糖醇(DTT)、二硫代赤藓醇(DTE)、2-巯基乙基胺(2MEA)、2-巯基乙醇(2ME)、三-2-羧基乙基膦盐酸盐(TCEP-HCl)、L-半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、抗坏血酸。
在优选的实施方式中，与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它改性剂为含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂(含有盐)。
在其它改性剂中，疏水性部分由烃链构成。烃链为直链或支链的烃基，烃链中的碳原子数通常为8～60个。含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂可以具有至少1个这样的烃链。烃链中的碳原子数优选为10个以上。另外，从合成或获得容易的观点出发，烃链中的碳原子数优选40个以下，更优选30个以下，进一步更优选20个以下。烃链中的碳原子数特别优选为10或11个。
作为直链的烃基，可列举作为直链饱和烃基的烷基、以及直链不饱和烃基(例如链烯基及炔基)。作为碳原子数8～60个烷基，可列举例如：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基。作为碳原子数8～60个直链的不饱和烃基，可列举例如在上述的烷基中含有1～4个(优选1个或2个)不饱和键(双键或三键)部分的烃基。
作为支链的烃基，可列举例如上述的直链的饱和或不饱和烃基上的氢原子用1～4个(优选1个或2个)碳原子数为1～10的烃基进行了取代而形成的烃基。作为碳原子数1～10的烃基，可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、苯基、萘基。
构成疏水性部分的烃链优选为直链的饱和烃基，更优选为具有10或11个碳原子数的直链饱和烃基。
在其它改性剂中，作为亲水性部分，可列举例如阴离子性亲水性部分及阳离子性亲水性部分。含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂可以具有1种或2种以上的亲水性部分，也可以具有阴离子性亲水性部分及阳离子性亲水性部分这两种。作为阴离子性亲水性部分，可列举例如：磺酸根(-SO3 -)、羧酸根(-COO-)及膦酸根(-POO2 -)。作为阳离子性亲水性部分，可列举例如铵根(N+)及鎓(phosphonium)根(P+)。亲水性部分优选为磺酸根(-SO3 -)、羧酸根(-COO-)、铵根(N+)、或鎓根(P+)，更优选为磺酸根(-SO3 -)、羧酸根(-COO-)或铵根(N+)，进一步更优选为磺酸根(-SO3 -)或羧酸根(-COO-)，特别优选为磺酸根(-SO3 -)。
含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂除由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分之外，可以含有其它部分(例如在疏水性部分和亲水性部分之间)。作为这种其它部分，可列举例如：环状基团(例如环烷基、芳基、杂环基)及非环状基团(例如氨基、羰基、羰基氨基)。
具体而言，作为含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂，可列举例如：己基硫酸、辛基硫酸、癸基硫酸、十二烷基硫酸、四十二烷基硫酸、十六烷基硫酸、十二烷基膦酸、十二烷基苯磺酸、N-月桂酰基肌氨酸及十二烷酰肌氨酸、以及它们的盐。
样品的处理可以使用1种或多种(例如2种或3种)的其它改性剂而进行。其它改性剂的浓度只要对维生素D的测定是有效的浓度即可，没有特别限定，可以适当进行调整。例如，将含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂用作其它改性剂时，这种表面活性剂的浓度例如可以为0.001％(w/v)～10％(w/v)％(w/v)。
具体而言，就利用含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂处理样品时的所述表面活性剂的浓度而言，通过使用如后所述的反应液的方法处理样品的情况下，只要是在反应液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.005％(w/v)～5％(w/v)。这样的情况下，含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂的浓度可以优选为0.01％(w/v)以上，更优选为0.02％(w/v)以上。含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂的浓度还可以优选为1％(w/v)以下，更优选为0.8％(w/v)以下，进一步更优选为0.6％(w/v)以下，特别优选为0.5％(w/v)以下。另外，使用多个表面活性剂的情况下，各表面活性剂的浓度也如上所述。
另外，就利用含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂处理样品时的所述表面活性剂的浓度而言，通过使用如后所述的前处理液的方法处理样品上，只要是在前处理液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.001％(w/v)～10％(w/v)。如上所述的情况下，含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂的浓度可以优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.02％(w/v)以上，进一步更优选为0.03％(w/v)以上。含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂的浓度还可以优选为1％(w/v)以下，更优选为0.8％(w/v)以下，进一步更优选为0.6％(w/v)以下，特别优选为0.5％(w/v)以下。另外，使用多个表面活性剂的情况下，各表面活性剂的浓度也如上所述。
样品的处理还可以在其它成分的存在下进行。作为这样的成分，可列举例如：具有维生素D亲和性的物质、白蛋白(例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白)、明胶及脱脂乳。
具有维生素D亲和性的物质是指具有与维生素D结合能力的物质，可列举例如维生素D的抗体、适体。抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体的任一种。抗体还可以为抗体的片段(例如Fab、F(ab’)2)、重组抗体(例如scFv)。抗体还可以为通过噬菌体展示等分子生物学的方法、和/或利用现有的蛋白质基序(motif)通过蛋白质工程的方法而制作的抗体分子(例如：亲合体(affibody)、模拟抗体(anticalin)、DARPins、单体(monobody))。
样品的处理例如包含：(a)将样品与含有如上所述成分的水溶液(例如缓冲液)进行混合而制备混合液；及(b)对混合液进行培养。
作为缓冲液，可列举例如：Tris缓冲液(例如：Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、Tris缓冲盐水)、磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)、碳酸盐缓冲液(例如碳酸-重碳酸钠缓冲液)、GOOD缓冲液(例如：MES、ADA、PIPES、ACES、盐酸胆胺、BES、TES、HEPES、乙酰胺基甘氨酸(Acetamidoglycine)、tricine、甘氨酰胺(Glycinamide)、Bicine)。样品的处理可以在中性条件下或酸性或碱性条件下进行，但优选在中性条件下进行。因此，在样品的处理中所采用的pH值例如为4.0～9.5，优选为5.0～9.0，优选为5.5～8.5，更优选为6.0～8.0。样品的处理中pH值的调整可以利用缓冲液、酸性物质及碱性物质进行。
样品的处理(例如上述(a)(b)的工序)的温度只要适于具有类固醇骨架的表面活性剂等成分发挥其作用即可，没有特别限定，例如为15～60℃，优选为20～50℃，更优选为20～45℃。(a)中混合液的制备所需要的时间通常为30秒以下，优选为20秒以下，更优选为15秒以下，进一步更优选为10秒以下。(b)中的培养时间例如为60分钟以下，优选为30分钟以下，更优选为10分钟以下。从缩短用于测定的处理时间的观点出发，培养时间进一步更优选为5分钟以下，特别优选为3分钟以下，可以为2分钟以下、1分钟以下、50秒以下、40秒以下、30秒以下、20秒以下、15秒以下、10秒以下或5秒以下。因此，从缩短用于测定的处理时间的观点出发，样品的处理时间(例如上述(a)(b)的总计时间)可以为3分钟以下、2分钟以下、1分钟以下、50秒以下、40秒以下、30秒以下或15秒以下。
另外，样品的处理可以仅通过混合而进行。样品的处理仅通过“混合”而进行是指：样品的处理通过上述(a)而进行，而不进行上述(b)(即不需要培养)。从迅速且简便的测定的观点出发，可以仅通过混合样品的处理而进行。
(A-1-1.反应液的使用)
在优选的实施方式中，上述工序1)可以利用下述反应液处理样品而进行：含有具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质。
反应液含有具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质。反应液还可以含有与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它表面活性剂(例如：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂)、离液剂及还原剂、以及含有由烃链构成的疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂等如上所述其它成分1种或多种(例如2种或3种以上)。
就反应液中具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度而言，只要在反应液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如为在反应液和样品的混合液中可以达到如上所述浓度(用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度)的浓度。因此，反应液中的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度可以基于样品及反应液的容量进行适当设定，使其达到如上所述的浓度。
反应液在水溶液(例如如上所述的缓冲液)中含有如上所述的物质。反应液可以为中性溶液或酸性溶液或碱性溶液，优选为中性溶液。因此，反应液的pH值例如为4.0～9.5，优选为5.0～9.0，优选为5.5～8.5，更优选为6.0～8.0。
反应液的容量可以根据样品的容量及种类、以及分析的目的(例如定性的或定量的测定)等而适当确定，相对于样品的容量，例如为0.1～100倍，优选为0.5～50倍，更优选为1～10倍。
利用反应液进行的样品的处理以适于发挥反应液中所含的具有类固醇骨架的表面活性剂等成分的作用的实施方式适当进行。例如，利用反应液进行的样品的处理可以与如上所述的样品的处理同样地进行，可以包含：(a1)对样品与反应液进行混合而制备混合液；及(b1)对混合液进行培养。(a1)及(b1)中的温度及时间的条件分别与上述(a)及(b)中的上述温度及时间同样。
(A-1-2.前处理液及稀释液的使用)
在其它的优选的实施方式中，上述工序1)可以如下进行：i)用含有改性剂的前处理液处理样品，以及ii)用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液对经过前处理液处理的样品进行处理。
(工序i)
前处理液包含改性剂。作为改性剂，可列举例如：具有类固醇骨架的表面活性剂、以及与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它表面活性剂(例如：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂)、离液剂及还原剂。前处理液中所含的改性剂可以为1种，也可以为多种(例如2种或3种以上)。前处理液作为改性剂，可以含有与稀释液中所含的表面活性剂同种的1个或2个以上(例如1～3个)表面活性剂(例如具有类固醇骨架的表面活性剂及其它表面活性剂)。前处理液还可以含有如上所述的其它成分。
就前处理液中的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度而言，只要是在前处理液和样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如在前处理液和样品的混合液中可以达到如上所述浓度(用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度)的浓度。因此，前处理液中具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度可以基于样品及前处理液的容量进行适当设定，使其达到如上所述的浓度。
前处理液在水溶液(例如如上所述的缓冲液)中含有如上所述的物质。前处理液可以为中性溶液或酸性溶液或碱性溶液，但优选为中性溶液。因此，前处理液的pH值例如为4.0～9.5，优选为5.0～9.0，优选为5.5～8.5，更优选为6.0～8.0。
前处理液的容量可以根据样品的容量及种类、以及分析的目的(例如：定性的或定量的测定)等而适当确定，相对于样品的容量，例如为0.5～100倍，优选为1～10倍、更优选为1～5倍。
利用前处理液进行的样品处理以适于发挥前处理液中所含的成分的作用的方式适当进行。例如，利用前处理液进行的样品处理可以与如上所述的样品处理同样地进行，可以包含：(a2-1)对样品与前处理液进行混合而制备第1混合液；及(b2-1)对第1混合液进行培养。(a2-1)及(b2-1)中的温度及时间的条件分别与上述(a)及(b)中的上述温度及时间相同。利用前处理液进行的样品处理还可以如上述那样仅通过混合而进行。
(工序ii)
稀释液含有具有类固醇骨架的表面活性剂。在本发明的方法中，通过使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液，可以使维生素D的检测灵敏度提高。稀释液还可以含有与具有类固醇骨架的表面活性剂不同的其它表面活性剂(例如：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂)、离液剂及还原剂等1种或多种(例如2种或3种以上)其它成分。稀释液还可以含有如上所述的其它成分(例如具有维生素D亲和性的物质、白蛋白)。
稀释液中的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度只要是在前处理液、稀释液及样品的混合液中发挥其作用的浓度即可，没有特别限定，例如在前处理液、稀释液及样品的混合液中可以达到如上所述浓度(用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品时的具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度)的浓度。因此，稀释液中具有类固醇骨架的表面活性剂的浓度可以基于样品、前处理液及稀释液的容量进行适当设定，使其达到如上所述的浓度。
稀释液在水溶液(例如如上所述的缓冲液)中含有如上所述的物质。稀释液可以为中性溶液或酸性溶液或碱性溶液，但优选为中性溶液。因此，稀释液的pH值例如为4.0～9.5，优选为5.0～9.0，优选为5.5～8.5，更优选为6.0～8.0。
稀释液的容量可以根据样品及前处理液的容量及种类、以及分析的目的(例如：定性的或定量的测定)等而适当确定，能够使用比样品及前处理液的总容量多的容量。具体而言，稀释液的容量相对于样品及前处理液的总容量例如为1～20倍，优选为1～10倍，更优选为1～5倍。
利用稀释液进行的样品处理以适于发挥稀释液中所含的具有类固醇骨架的表面活性剂的作用的实施方式适当进行。例如，利用稀释液进行的样品处理可以与利用前处理液进行的样品处理同样地进行，可以包含：(a2-2)对经过前处理液处理的样品与稀释液混合而制备第2混合液；及(b2-2)对第2混合液进行培养。(a2-2)及(b2-2)中温度及时间的条件分别与上述(a)及(b)中的上述温度及时间相同。
(A-2.工序2)
如上所述，在被处理的样品中，检测维生素D。定性或定量地进行维生素D的检测。本工序中，使用上述亲和性物质的情况下，可以包含将亲和性物质添加于经过处理的样品中。
维生素D的检测可以通过任意方法进行，例如，可以利用具有维生素D亲和性的物质而进行。维生素D的检测还可以利用免疫学的方法进行。作为这种免疫学的方法，可列举例如：酶免疫测定法(EIA)(例如：直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、夹心ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、磁性粒子法、免疫色谱法、发光免疫测定法、旋转免疫测定法、胶乳凝集法。作为能够检测维生素D的上述以外的方法，可列举例如LC-MS。
使用抗体作为具有维生素D亲和性的物质的情况下，可以进一步使用二抗。作为二抗，可以为维生素D的抗体(一抗)的一抗部分的抗体，也可以为维生素D及一抗的复合体的抗体。二抗等抗体可以与检测用物质连结。作为检测用物质，可列举例如：酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、亲和性物质(例如链霉亲合素、生物素)、荧光物质(例如荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明)、发光物质(例如萤光素、水母发光蛋白)、放射性物质(例如：3H、14C、32P、35S、125I)。二抗等抗体可以将抗体固定于支撑体上。作为支撑体，可列举例如：粒子(例如磁性粒子)、薄膜(例如硝基纤维素膜)、玻璃、塑料、金属、板(例如多孔板)、设备。抗体还可以以含浸于滤纸等介质的形态提供。
(B.维生素D的测定用试剂盒)
本发明还提供一种维生素D的测定用试剂盒。
本发明的试剂盒包含以下：
1)具有类固醇骨架的表面活性剂；以及
2)具有维生素D亲和性的物质和/或维生素D标准品。
具有维生素D亲和性的物质为一抗时，本发明的试剂盒可以进一步含有二抗。
在优选的实施方式中，本发明的试剂盒包含如下反应液：其含有具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质。
在其它的优选的实施方式中，本发明的试剂盒包含以下：
1)含有改性剂的前处理液；
2)含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液；以及
3)具有维生素D亲和性的物质和/或维生素D标准品。
本发明的试剂盒中所含的上述构成成分的详细(例如有效成分及浓度、优选的实例)在本发明的方法中如上所述。反应液以及前处理液及稀释液可以进一步含有本发明的方法中的上述成分和/或物质。维生素D标准品为含有指定浓度(单一或多个)的维生素D的水溶液或维生素D粉末，用作对照。
在本发明的试剂盒中，各构成成分可以分别以收容于不同的容器(例如管、皿)的形态提供。或者，本发明的试剂盒可以以设备的形态提供。具体而言，构成成分整体可以以收容于设备中的形态提供。或者，也可以构成成分的一部分以收容于设备中的形态提供，剩余的部分以没有收容于设备中的形态(例如收容于不同的容器的形态)提供。该情况下，没有收容于设备中的构成成分在进行目标物质的测定时，可以通过注入于设备中而被使用。作为设备的结构，可列举例如：1)具备用于对样品和具有类固醇骨架的表面活性剂进行混合而制备混合液的第1区域，以及使制备的混合液与具有维生素D亲和性的物质接触来用于检测维生素D的第2区域的设备；2)具备对样品、具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质进行混合来检测维生素D的区域的设备；以及3)具备可以混合样品和上述构成成分(例如反应液、以及前处理液及稀释液)的流路、及用于检测维生素D的区域的设备。
以下，记载本发明的实施例，但本发明并不受这些实施例限定。
实施例
在以下的实施例中，作为测定维生素D的免疫学的方法，使用识别25-OH维生素D2及25-OH维生素D3(以下，根据需要包括25-OH维生素D2及25-OH维生素D3而简称为25-OH维生素D)的一抗。因此，以下的实施例中所测定的值可以对应于25-OH维生素D2及25-OH维生素D3的总量。
[化学式2]
实施例1：经过表面活性剂处理的样品中的25-OH维生素D的测定
人血清组合使用含有表面活性剂的前处理液及含有表面活性剂或有机溶剂(乙醇)的稀释液并处理一段时间，接着，利用免疫学的方法测定人血清中的25-OH维生素D。
方法如下地进行。
1)在从同一人采取的同一血清(10μl)中加入4倍量(40μl)的各种前处理液[0.3％(w/v)SDS/0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)+0.1％(w/v)下述表面活性剂]，制备血清和前处理液的第1混合液(50μl)。第1混合液中的各成分的浓度如下所述：0.24％(w/v)SDS/0.1M Tris-HCl缓冲液+0.08％(w/v)下述表面活性剂。
2)将第1混合液在室温(25℃)下培养10分钟。
3)在进行了培养的第1混合液中加入3倍量(150μl)的各种稀释液[0.1％(w/v)BSA/0.1M Tris缓冲液(pH7.6)、0.1％(w/v)下述表面活性剂或10％(v/v)乙醇]，制备第1混合液和稀释液的第2混合液(200μl)。第2混合液中的下述表面活性剂的浓度为0.095％(w/v)。
4)将第2混合液和抗25-OH维生素D抗体结合磁性粒子液以等量进行混合。
5)将上述4)中得到的溶液在37℃下培养10分钟。
6)培养后，在磁性板上收集样品中的磁性粒子，将磁性粒子清洗3次。
7)向除去了清洗液的磁性粒子加入碱性磷酸酶标识抗体(25-OH维生素D及抗25-OH维生素D抗体的免疫复合体的抗体)溶液。
8)将上述7)中得到的溶液在37℃下培养10分钟。
9)培养后，在磁性板上收集溶液中的磁性粒子，将磁性粒子清洗3次。
10)在含有磁性粒子的溶液中加入显色底物(AMPPD)。
11)将上述10)中得到的溶液在37℃下培养5分钟。
12)用标记物读取仪(ARVO；PerkinElmer)对发光计数进行测定。
结果如下示于表1。需要说明的是，表1中，将经过不含有表面活性剂的前处理液及不含有表面活性剂的稀释液这两者处理的人血清的发光计数设为100(对照)，将在各种条件下所测定的发光计数用相对于对照的百分率表示。
[表1]
表1.对含有表面活性剂的前处理液以及含有表面活性剂的有机溶剂(乙醇)进行组合使用，经过一段时间的处理的人血清中250H维生素D的测定中的发光计数的比较
NP40:壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(nonyl phenoxypolyethoxylethanol)
吐温20:聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurate)
皂苷:来自属于皂树属(Quillaja)的植物的树皮的皂苷(SIGMA:S7900)
CHAPS:3-(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基-1-丙磺酸盐3-(3-cholamidepropyl)dimethylammonio-1-propanesulfonate
DC Na:脱氧胆酸钠
其结果，使用含有CHAPS或脱氧胆酸钠(DCNa)作为具有类固醇骨架的表面活性剂的前处理液所测定的信号强度(发光计数)确认到比使用不具有类固醇骨架的表面活性剂(前处理液)所测定的信号强度高的倾向(表1)。另外，使用含有CHAPS或脱氧胆酸钠(DCNa)作为具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液所测定的信号强度(发光计数)显著地高于使用不具有类固醇骨架的表面活性剂及有机溶剂(稀释液)所测定的信号强度(表1)。因此，表明了：在维生素D的测定中，通过使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的试剂，可以高灵敏度地检测目标物质，特别是通过使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液，可以高灵敏度地检测目标物质。
实施例2：组合使用含有离液剂的前处理液及含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液而处理一段时间的样品中25-OH维生素D的测定
组合使用含有离液剂的前处理液及含有表面活性剂或有机溶剂(乙醇)的稀释液对人血清处理一段时间，接着，利用免疫学的方法测定人血清中25-OH维生素D。
方法如下进行。
1)在向从同一人采集的同一血清(10μl)中加入4倍量(40μl)的各种前处理液[7.5M盐酸胍/PB(磷酸盐缓冲液)(pH7.6)、0.1％(w/v)下述表面活性剂]，制备血清和前处理液的第1混合液(50μl)。第1混合液中的各成分的浓度如下所述：6M盐酸胍；0.08％(w/v)下述表面活性剂。
2)对第1混合液在室温(25℃)下培养10分钟。
3)在进行了培养的第1混合液中加入3倍量(150μl)的各种稀释液[0.1％(w/v)BSA/0.1M Tris缓冲液(pH7.6)、0.1％(w/v)下述表面活性剂或10％(v/v)乙醇]，制备第1混合液和稀释液的第2混合液(200μl)。第2混合液中的下述表面活性剂的浓度为0.095％(w/v)。
4)以后的操作通过与实施例1的4)～12)相同的方法来进行。
结果，如下述表2所示。需要说明的是，表2中，将经过含有离液剂(盐酸胍)且不含有表面活性剂的前处理液及不含有表面活性剂的稀释液这两者处理的人血清的发光计数设为100(对照)，将在各种条件下所测定的发光计数用相对于对照的百分率表示。
[表2]
表2.经过组合使用含有离液剂的前处理液及含有表面活性剂或有机溶剂(乙醇)的稀释液处理一段时间的血清中25-OH维生素D的测定中发光计数的比较
略语与表1相同
如表2所示，即使在使用了含有离液剂的前处理液的情况下，使用含有脱氧胆酸钠的稀释液所测定的信号强度(发光计数)也比使用含有有机溶剂或其它表面活性剂(吐温20)的稀释液所测定的信号强度高。因此，确认到：本发明的方法可以高灵敏度地检测目标物质而不特别受到前处理液种类的限制。
实施例3：通过组合使用前处理液及稀释液的本发明的方法进行的目标物质的测定值和通过现有方法进行的测定值的相关系数的比较
为了验证通过本发明的方法进行的目标物质的测定精度，将通过组合使用前处理液及稀释液的本发明的方法进行的目标物质的测定值和通过利用不同方法论的现有方法而得到的测定值的相关系数进行了比较。
3-1)通过本发明的方法进行的测定
方法如下进行。需要说明的是，使用人血清14个样品、木炭(チャコール)处理血清强化样品1样品共计15样品作为测定样品。
1)在血清(10μl)中加入4倍量(40μl)的各种前处理液[7.5M盐酸胍及4mMDTT/0.1M Tris缓冲液(pH7.6)+0.1％(w/v)脱氧胆酸钠、或5％(v/v)乙醇及5％(v/v)DMSO]，制备第1混合液。
2)在室温(25℃)下培养第1混合液10分钟。
3)在经过培养的第1混合液中加入3倍量(150μl)的稀释液[0.1％(w/v)BSA/0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.6)+0.1％(w/v)脱氧胆酸钠或5％(v/v)乙醇及0.5％(v/v)DMSO]，制备第1混合液和稀释液的第2混合液。
4)以后的操作通过与实施例1的4)～12)相同的方法来进行。
3-2)通过现有方法的测定
作为利用不同方法论的现有方法，如后所述，采用了使用有放射性物质的DiaSorin-RIA。DiaSorin-RIA使用市售的试剂盒(25-羟基维生素D 125I RIAKIT，DiaSorin制造)而进行。
具体而言，DiaSorin-RIA如以下I)及II)进行。需要说明的是，与上述3-1)相同，使用人血清14个样品、木炭处理血清强化样品1个样品共计15样品作为测定样品。
I)前处理操作
a)准备玻璃试管。
b)向每个试管中各分注乙腈500μl。
c)在各试管中加入校准物(calibrator)、对照或样品(血清等)各50μl。
d)将样品溶液搅拌10秒。
e)将样品溶液在室温下以1200×g离心分离10分钟。
f)将上清液用作样品。
II)测定操作
a)对上述样品25μl、125I 25-OH维生素D50μl及抗25-OH维生素D抗体液1ml进行混合。
a)在室温下培养混合液90分钟。
b)在经过培养的混合液中加入来自驴的抗山羊抗体500μl。
c)在室温下培养得到的溶液25分钟。
d)在经过培养的溶液中加入NSB/添加缓冲液500μl。
e)将得到的溶液在室温下以1800×g离心进行分离20分钟。
f)从经过离心分离的溶液中完全地除去上清液。
g)使用γ闪烁计数器进行测定。
3-3)结果
通过使用含有脱氧胆酸钠的稀释液的本发明的方法得到的测定值与利用Diasorin RIA法所得到的测定值的相关性高(图1、R2＝0.8993)。另一方面，使用含有乙醇及DMSO的稀释液得到的测定值与利用Diasorin RIA法所得到的测定值的相关性低(图1、R2＝0.8327)。因此，认为本发明的方法能够用于对维生素D的测定。
实施例4：利用表面活性剂进行处理的时间的研究
对25-OH维生素D的高灵敏度测定中所必需的、利用表面活性剂进行处理的时间进行了研究。
方法如下进行。
1)向从同一人采集的同一血清10μl中加入前处理液[在Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中加入1％(w/v)脱氧胆酸钠]40μl，通过搅拌进行混合，制备血清和前处理液的第1混合液(50μl)。第1混合液中的各成分的浓度如下所述：0.8％(w/v)脱氧胆酸钠。通过搅拌进行混合所需要的时间约为3秒。
2)在室温(25℃)下培养第1混合液(10分钟、5分钟或1分钟)。另外，将仅通过搅拌混合而制备的第1混合液不进行培养，供于以下的操作(培养时间：0分钟)。
3)向由上述2)得到的溶液中加入稀释液[在PBS(pH7.6)加入0.1％(w/v)脱氧胆酸钠及0.1％(w/v)BSA]150μl，制备第1混合液和稀释液的第2混合液(200μl)。第2混合液中的脱氧胆酸钠的浓度为0.28％(w/v)。
4)以后的操作通过与实施例1的4)～12)相同的方法来进行。
结果如下述表3所示。需要说明的是，表3中，利用含有0.14％(w/v)脱氧胆酸钠的前处理液，将培养时间为10分钟的条件下所测定的发光计数设为100(对照)，将在培养时间为0分钟、1分钟及5分钟的条件下所测定的发光计数用相对于对照的比例表示。
[表3]
表3.表面活性剂存在下的培养时间和相对发光计数的关系
其结果，即使仅混合(培养时间：0分钟)，也可得到与培养了10分钟的情况大致相同程度的相对发光计数。该情况显示：仅通过混合血清和前处理液，25-OH维生素D从血清中的DBP解离，不需要上述工序1)的培养操作。因此显示：通过本发明的方法，可以缩短目标物质的测定所需要的时间。
参考例1：使用有现有产品的前处理所需要的时间
在现有产品中，根据其使用说明书，血清样品的前处理中所必需的时间如下所述。作为现存产品，使用DiaSorin-RIA(DiaSorin株式会社制造)、DiaSorin-Liaison(DiaSorin株式会社制造)。
[表4]
表4.现有产品的前处理中需要的时间
DiaSorin-RIA DiaSorin-Liaison
处理时间(分钟) 约10 约10
DiaSorin-RIA：试剂盒实验计划附件
DiaSorin-Liaison：510(K)NumberK071480
实施例5：使用了具有类固醇骨架的表面活性剂及阴离子性、阳离子性或两性表面活性剂的维生素D的测定
用含有具有类固醇骨架的表面活性剂(脱氧胆酸钠)及维生素D的抗体的反应液对血清进行处理，接着，利用免疫学的方法测定血清中25-OH维生素D。另外，研究了组合使用具有类固醇骨架的表面活性剂及其它表面活性剂的效果。
具体而言，方法如下所述。
1)向100ng/ml强化马血清3.75μl中加入反应液[Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、0.03％(w/v)或0.1％(w/v)下述的表面活性剂、0.04％(w/v)脱氧胆酸钠、0.04％(w/v)BSA、抗25-OH维生素D抗体结合粒子液]146.25μl，制备血清和反应液的混合液(150μl)。混合液中各成分的浓度如下所述：约0.03％(w/v)或约0.1％(w/v)下述的表面活性剂；约0.04％(w/v)脱氧胆酸钠；约0.04％(w/v)BSA。
2)在37℃下培养混合液10分钟。
3)培养后，在磁性板上收集样品中的磁性粒子，清洗磁性粒子3次。
4)向除去了清洗液的磁性粒子添加MES缓冲液中悬浮了碱性磷酸酶标识抗体(25-OH维生素D-抗25-OH维生素D抗体免疫复合体的抗体)。
5)在37℃下培养上述4)中得到的溶液10分钟。
6)培养后，在磁性板上收集样品中的磁性粒子，清洗磁性粒子3次。
7)在除去了清洗液的磁性粒子中加入了发光底物(AMPPD)液。
8)在37℃下培养含有磁性粒子及发光底物的溶液5分钟。
9)使用标记物读取仪(ARVO；PerkinElmer)对发光计数进行测定。
结果如表5所示。需要说明的是，表5中，将在不加入上述的表面活性剂[0.03％(w/v)或0.1％(w/v)]的条件下所测定的血清的发光计数设为100(对照)，将在加入具有类固醇骨架的表面活性剂的条件下所测定的血清的发光计数用相对于对照的比例表示。
[表5]
表5：相对于维生素D的测定，利用具有胆固醇骨架的表面活性剂进行的样品处理的效果
反应液除0.04％(w/v)脱氧胆酸钠(具有类固醇骨架的表面活性剂)之外，包含0.03％(w/v)或0.1％(w/v)以下的表面活性剂：(a)脱氧胆酸钠；(b)胆酸钠；(c)SDS；(d)N-月桂酰基肌氨酸；(e)正十二烷酰基肌氨酸；(f)鲸蜡基二甲基乙基溴化铵；(g)CHAPS；或(h)兼性离子(zwittergent)
其结果，阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂及两性表面活性剂在与具有类固醇骨架的表面活性剂(脱氧胆酸钠)的组合中均可确认到使发光计数提高的倾向。另外，作为阴离子性表面活性剂的脱氧胆酸钠、SDS、正月桂酰基肌氨酸及十二烷酰肌氨酸、以及作为阳离子性表面活性剂的鲸蜡基二甲基乙基铵溴化物使发光计数提高。特别是显示出脱氧胆酸钠的发光计数显著得到提高。
另外，在经过含有具有类固醇骨架的表面活性剂(脱氧胆酸钠)及维生素D抗体这两者的反应液处理的样品中，维生素D的测定取得了成功(参照上述工序1)。该情况显示：尽管具有类固醇骨架的表面活性剂可以使维生素D从血清中所含的维生素D结合性蛋白质中解离，但是，不能阻碍由抗体进行的维生素D的检测。因此显示：根据本发明能够使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂及针对维生素D的抗体这两者的反应液简便地测定维生素D，而不是利用具有类固醇骨架的表面活性剂及针对维生素D的抗体分别处理样品这样的繁杂的方法。
实施例6：利用在类固醇骨架的7位上具有及不具有羟基的表面活性剂处理样品对维生素D测定的影响的研究
在实施例5中，确认到：脱氧胆酸钠与胆酸钠及CHAPS相比，信号强度显著地提高(表5)。在此，脱氧胆酸钠为在类固醇骨架的7位上不具有羟基的表面活性剂，另一方面，胆酸钠及CHAPS为在类固醇骨架的7位上具有羟基的表面活性剂。由此，认为类固醇骨架的7位有无羟基的对信号强度不会产生影响。因此，对利用类固醇骨架的7位上具有及不具有羟基的表面活性剂处理样品对维生素D测定的影响进行了研究。
具体而言，方法如下所述。
1)在100ng/ml强化马血清3.75μl中加入反应液[Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、0％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)或0.4％(w/v)的具有类固醇骨架的下述表面活性剂、0.04％(w/v)BSA、抗25-OH维生素D抗体结合粒子液]146.25μl，制备血清和反应液的混合液(150μl)。混合液中的各成分的浓度如下所述：0％(w/v)、约0.1％(w/v)、约0.2％(w/v)或约0.4％(w/v)的具有类固醇骨架的下述的表面活性剂；约0.04％(w/v)BSA。作为在类固醇骨架的7位上不具有羟基的表面活性剂，使用了脱氧胆酸钠及牛磺脱氧胆酸钠。另一方面，作为在类固醇骨架的7位上具有羟基的表面活性剂，使用了牛磺胆酸钠、胆酸钠、CHAPS。
2)以后的工序通过与实施例5的工序2)～9)相同的方法来进行。
结果如以下的表6所示。需要说明的是，表6中，将在不加入上述的表面活性剂[0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)]的条件下所测定的血清的发光计数设为100(对照)，将在加入类固醇骨架的7位上具有或不具有羟基的表面活性剂的条件下所测定的血清的发光计数用相对于对照的比例表示。
[表6]
表6.相对于维生素D的测定，胆固醇骨架的有无产生的影响
其结果，经过在类固醇骨架的7位上不具有羟基的脱氧胆酸钠及牛磺脱氧胆酸钠处理的样品所测定的信号强度与经过在类固醇骨架的7位上具有羟基的胆酸钠、牛磺胆酸钠进行了处理的样品所测定的信号强度相比，显著地得到了提高。因此，本实施例及实施例1显示：具有类固醇骨架的表面活性剂对维生素D的测定是有效的，在类固醇骨架的7位上不具有羟基的表面活性剂对维生素D的测定特别有用。
实施例7：使用了含有具有类固醇骨架的表面活性剂、SDS及抗体的反应液的维生素D的测定
相对于维生素D的测定，使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂及SDS的反应液测定了人血清样品中的25-OH维生素D。
具体而言，方法如下所述。
1)在不同来源的人血清(#1～16)或木炭处理人血清(对照)3.75μl中加入反应液[Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、0.14％(w/v)脱氧胆酸钠、0.015％(w/v)SDS、0.04％(w/v)BSA及抗25-OH维生素D抗体结合粒子液]146.25μl，制备了血清和反应液的混合液。
2)以后的工序通过与实施例5的工序2)～9)相同的方法来进行。另外，将得到的测定值与利用DiaSorin-RIA法得到的测定值进行比较。DiaSorin-RIA法通过实施例3-2)中记载的方法来进行。
结果如表7及图3所示。需要说明的是，表7中，将木炭处理人血清的发光计数设为100(对照)，将所测定的血清的发光计数用相对于对照的比例表示。
[表7]
表7.使用了具有胆固醇骨架的表面活性剂以及SDS的维生素D测定的发光计数值
其结果，通过使用含有具有类固醇骨架的表面活性剂、SDS及抗体的反应液的本发明的方法而得到的测定值与利用Diasorin RIA法得到的测定值的相关性高(图3、R2＝0.9881)。因此，认为本发明能够用于维生素D的测定。
实施例8：通过经过具有类固醇骨架的表面活性剂处理而对从维生素D结合蛋白质及人血清中放出的25-OH维生素D进行的测定
8-1)利用具有类固醇骨架的表面活性剂处理组分
对如下组分(对照组分)进行利用抗25-OH维生素D抗体进行的测定：用对照缓冲液(Tris-HCl)进行了处理的人血清利用凝胶过滤色谱法洗脱而得到。另外，用脱氧胆酸钠处理对照组分，利用抗25-OH维生素D抗体进行测定。
具体而言，方法如下所述。
1)在人血清(50μl)中加入4倍量(200μl)的0.1MTris-HCl缓冲液(pH7.8)，制备了混合液。需要说明的是，混合液通过仅搅拌进行的混合(约3秒)来制备(即无培养)。
2)通过使用凝胶过滤色谱法(GE Healthcare：AKTAexplorer)及凝胶过滤色谱法柱(superdex20010/30)、利用0.1MTris-HCl洗脱混合液(0.25-1柱容量)，得到分子量依赖性的组分。
3)以等量对上述2)中得到的组分和含有0.4％(w/v)脱氧胆酸钠盐的抗25-OH维生素D抗体结合磁性粒子液进行混合(脱氧胆酸钠存在下的条件)。另一方面，关于不存在脱氧胆酸钠的条件，与不含有0.4％(w/v)脱氧胆酸钠盐的抗25-OH维生素D抗体结合磁性粒子液等量混合。
4)以后的操作通过与实施例1的5)～12)相同的方法来进行。
其结果，没有经过脱氧胆酸盐处理的情况下，没有检测出显著的发光计数，不能测定25-OH维生素D(图4)。另一方面，用脱氧胆酸盐进行处理并测定25-OH维生素D的情况下，在组分#15-#17中检测出强的发光计数。
8-2)利用蛋白质印迹的对照组分中的维生素D结合蛋白质的检测
对维生素D的检测组分是否与维生素D结合蛋白质的检测组分一致进行了研究。
具体而言，方法如下所述。
1)加入其1/3倍量(10μl)的NuPAGELSD样品缓冲液(invitrogen)、最终浓度为1mM的DTT至对照组分(上述8-1中得到的组分、30μl)中，制备混合液。
2)将混合液利用100℃的超纯水煮沸5分钟。
3)将得到的溶液应用于4-10％丙烯酰胺凝胶。
4)施加200V的电压25分钟，实施SDS-PAGE。
5)利用iBlot(invitrogen)将得到的凝胶向PVDF膜进行转印。
6)将转印膜放入5％脱脂乳溶液中，在室温下振荡1小时。
7)将溶液变换为PBSt，振荡转印膜5分钟，进行清洗。
8)进一步重复上述清洗操作两次。其后，将溶液变换为5％脱脂乳溶液。
9)加入5％脱脂乳溶液，使作为一抗的抗人维生素D结合蛋白质抗体(Abcam)为1μg/ml，使转印膜在4℃下振荡一夜。
10)将溶液变换为PBSt，振荡转印膜5分钟，进行清洗。
11)进一步重复上述清洗操作两次。其后，将溶液变换为5％脱脂乳溶液。
12)加入5％脱脂乳溶液，使作为二抗的抗小鼠Ig抗体-HRP稀释1000倍，在室温下振荡1小时。
13)将溶液变换为PBSt，振荡5分钟，进行清洗。
14)进一步重复上述清洗操作两次。其后，将PBSt变换为超纯水。
15)用超纯水冲洗转印膜1次。
16)将溶液变换为发光底物(ECLselect；GE Healthcare)。
17)用LAS3000MINWIN(FUJIFILM)实施转印膜的拍摄。
其结果，检测出维生素D结合蛋白质的组分#15-17与在实施例8-1中检测出25-OH维生素D的组分一致(图5)。因此，暗示了：用0.1MTris-HCl进行处理及洗脱的情况下，25-OH维生素D在与维生素D结合蛋白质结合的状态下被回收。
8-3)利用具有类固醇骨架的表面活性剂进行的来自维生素D结合蛋白质的维生素D的解离
对通过用脱氧胆酸盐进行处理，人血清中的25-OH维生素D是否游离进行了研究。
具体而言，方法如下所述。
1)在人血清或添加了1％BSA-PBS溶液(50μl)的143ng/ml25-OH维生素D中加入4倍量(200μl)的0.4％(w/v)脱氧胆酸盐溶液，制备混合液。需要说明的是，混合液通过仅搅拌进行的混合(约3秒)来制备(即无培养)。
2)通过使用凝胶过滤色谱法(GE Healthcare：AKTAexplorer)及凝胶过滤色谱法柱(superdex20010/30)，利用0.4％脱氧胆酸盐溶液进行洗脱，得到分子量依赖性组分。接着，回收柱容量的0.25～1。
3)以等量对经过上述处理的样品和不含有脱氧胆酸盐的抗25-OH维生素D抗体结合磁性粒子液进行混合。
4)以后的操作通过与实施例1的5)～12)相同的方法来进行。
其结果，与检测出实施例8-1)的维生素D结合蛋白的组分#15-17相比，从分子量小的组分#22-28中检测出了25-OH维生素D(图6)。由于在用脱氧胆酸盐洗脱时检测出25-OH维生素D的组分#22-28与洗脱出游离的25-OH维生素D的组分#22-28相同(图6)，因此暗示：通过利用脱氧胆酸盐的处理，人血清中的25-OH维生素D游离。
8-4)通过利用具有类固醇骨架的表面活性剂进行的处理，25-OH维生素D从维生素D结合蛋白质及血清的释放
对通过利用具有类固醇骨架的表面活性剂的处理，是否从维生素D结合蛋白质及25-OH维生素D3的复合体释放25-OH维生素D进行了研究。
具体而言，方法如下所述。
1)如表8所示，制备样品。具体而言，在精制维生素D结合蛋白质(Abcam)1.64mg/ml(+或-)17.2μl中加入25-OH维生素D3(Trontochemicalreagent)1mg/ml(+或-)2.82μl而制备样品，接着，将得到的样品培养10分钟。
2)在上述样品3.75μl中加入表8所示的溶液(pH7.6Tris-HCl缓冲液、0.138％(w/v)脱氧胆酸钠盐+0.038％BSA+抗25-OH维生素D抗体结合粒子液)146.25μl，制备混合液。
3)以后的操作通过与实施例1的5)～12)相同的方法来进行。
[表8]
表8.试验条件的详细
其结果，使用市售的精制维生素D结合蛋白质及25-OH维生素D3形成维生素D结合蛋白质及25-OH维生素D3复合体的情况下，不能检测25-OH维生素D3(参照图7及表8的编号2)。另一方面，用脱氧胆酸盐进行了处理的情况下，可以测定25-OH维生素D3(参照图7及表8的编号3)。该情况下的测定计数为编号1的测定计数的88％(图7及表8)。
由以上证实：通过利用具有类固醇骨架的表面活性剂的处理，从维生素D结合蛋白质及25-OH维生素D的复合体中释放25-OH维生素D；及可以高灵敏度地测定所放出的25-OH维生素D。
工业实用性
本发明的方法及试剂盒能够用于维生素D的测定。

Claims (12)

1.一种维生素D的测定方法，该方法包括：
1)用具有类固醇骨架的表面活性剂处理样品；及
2)在经过处理的样品中检测维生素D。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述表面活性剂为胆汁酸或其衍生物或它们的盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述表面活性剂具有类固醇骨架，所述类固醇骨架在7位上不具有羟基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂为脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸或它们的盐。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其还包括：用与所述表面活性剂不同的其它改性剂处理样品。
6.如权利要求5所述的方法，其中，其它改性剂为含有疏水性部分及亲水性部分的表面活性剂，所述疏水性部分由烃链构成。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，样品的处理仅通过混合而进行。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其包括以下步骤：
1’)用含有具有类固醇骨架的表面活性剂及具有维生素D亲和性的物质的反应液处理样品；以及，
2’)在经过处理的样品中检测维生素D。
9.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其包括以下步骤：
1”)用包含改性剂的前处理液处理样品；
2”)用含有具有类固醇骨架的表面活性剂的稀释液对经过所述1”)处理的样品进行处理；以及
3”)在经过所述2”)处理的样品中检测维生素D。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中样品为来自人的样品。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，样品为血液相关样品。
12.如维生素D的测定用试剂盒，其包括：
1)具有类固醇骨架的表面活性剂；以及，
2)具有维生素D亲和性的物质和/或维生素D标准品。
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