CN110494753B - 用于分析物测定的通用预处理试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从样品释放分析物的体外方法，其包括使所述样品与(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂接触。本发明进一步涉及用于从样品释放分析物的释放剂，其包含前述化合物。此外，本发明涉及与本发明的方法和释放剂相关的用途、试剂盒、方法和设备。

Description

用于分析物测定的通用预处理试剂
本发明涉及用于从样品释放分析物的体外方法，其包括使所述样品与(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂接触。本发明进一步涉及用于从样品释放分析物的释放剂，其包含前述化合物。此外，本发明涉及与本发明的方法和释放剂相关的用途、试剂盒、方法和设备。
体外诊断(IVD)方法通常需要在进行实际分析之前进行样品制备步骤。样品制备可意味着几种功能，如从样品基质的分析物释放，在分析物被捕获在红细胞内(例如免疫抑制药物)的情况下的溶血，以及低丰度分析物的可能分析物富集。样品制备步骤的另一种重要功能是除去样品基质以避免干扰；尤其是血液和血液来源的样品由蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)和其他生物分子的高度浓缩且复杂的混合物组成，其可以导致下游分析中的问题，例如，色谱柱的阻塞或堵塞，降低它们的寿命(Furey等人 (2013) Talanta 115:104)，来自低丰度分析物的MS信号的“淹没”或抑制等。
质谱(MS)，尤其是液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)，已成为体外诊断中分析物定量的选择方法。特别是在测定具有相似结构的代谢物的小分子的情况下，MS的特异性和准确性对于生成可靠结果已变得至关重要。此类小分子的实例是维生素如25-羟基-维生素D3，类固醇如睾酮和免疫抑制药物如环孢菌素A和依维莫司。从血清或血浆样品测定25-羟基-维生素D3和睾酮。在免疫抑制药物的情况下，推荐的基质是全血，因为这些分析物与红细胞高度结合(Al-Jenoobi, FI (2016), Austin Chromatography 3:1039; Sallustio, BC(2010), Bioanalysis 2:1141)，因此需要在其定量之前的溶血步骤。对于25-羟基-维生素D3、睾酮、环孢菌素A和依维莫司，还已知这些分析物与样品中的基质蛋白结合并需要在定量前从基质蛋白释放：例如，在血液中的环孢菌素A中("Personalized Immunosuppressionin transplantation: role of biomarker monitoring and therapeutic drugmonitoring", Oellerich & DasGupta (2016):Elsevier, Amsterdam)，50-70%与红细胞结合，以及在血浆中发现的环孢菌素A中，98%与脂蛋白结合，而仅2%被发现在血浆中是游离的。类似地，在血液中的依维莫司中(Oellerich & DasGupta, loc. cit.)，近似75%与红细胞结合，且在血浆中发现的依维莫司中，75%与血浆蛋白结合，而25%被发现在血浆中是游离的。25-羟基-维生素D3和睾酮实际上分别排他地与维生素D结合蛋白和性激素结合球蛋白结合(Package inserts for Elecsys Assay Vitamin D total (2014-11, V 5.0);Rommerts FFG (2004): "Testosterone: an overview of biosynthesis, transport,metabolism and non-genomic actions"; In: Nieschlag, E, Behre, HM (编):Testosterone action, deficiency, substitution, 第3版. Cambridge, CambridgeUniversity Press, 1–38.)。
样品制备步骤，包括样品预处理试剂，是LC-MS/MS分析和其他IVD定量方法/测定中方法开发的第一个且最关键的部分，因为其直接影响分析方法的准确性(10)。来自现有技术的最普遍的预处理方法是用有机溶剂(如甲醇或乙腈)、有时也用硫酸盐如ZnSO4作为沉淀、诱导从样品基质释放分析物、同时通过沉淀除去基质组分的辅助添加剂处理样品(血清、血浆或全血)(Sallustio, BC, loc. cit.; Gomes 等人 (2013), Bioanalysis 5:3063; Package inserts for Elecsys Assays: Cyclosporine (2013-06, V 1.0),everolimus (2015-11, V 1.0), sirolimus (2015-12, V 1.0), tacrolimus (2014-11,V 3.0), and their ISD pretreatment reagent (2014-10, V 3.0); Sadjadi S(2013), Chromatography Today, November/December:20)。然而，这些方法需要除去沉淀物，且因此与一些下游应用(例如，用于LC-MS/MS的珠粒富集)不相容；此外，有机溶剂可以抑制通过珠粒捕获分析物。因此，珠粒富集LC-MS/MS方法通常需要基于水的溶液用于预分析。用于在珠粒富集工作流程中的样品制备的预处理试剂理想地作为稳定和即用的溶液提供。这些溶液可以放置在仪器的板上长时间段，其提供不需要用户交互的工作流程。然而，当涉及化学不稳定的试剂时，使用作为冻干物的试剂是必要的，其通过需要手动处理步骤用于重构而妨碍工作流程，因为手动处理步骤生成额外成本，并且还提供误差的来源。此外，重构的试剂通常显示短保质期并且必须由新鲜制备的溶液代替。
一些预处理方法使用皂化用于从基质释放分析物(Package inserts forElecsys Assay Vitamin D total (2014-11, V 5.0); Gomes等人, loc. cit.)，并且由将样品与氢氧化钾或氢氧化钠溶液混合组成。该预处理方法经常意味着添加还原试剂如二硫苏糖醇(DTT)，用于打开待解折叠的基质蛋白中的二硫键。此处的一个优点在于基质蛋白的变性发生而不形成任何沉淀物。然而，由于还原剂在碱性溶液中通常不是化学稳定的，所以必须提供两种分开的组分，例如，DTT和NaOH。结果是在分析仪上需要更多空间，并且需要2-移液-步骤预处理。
其他测定使用预处理试剂，其通过添加过量的结构相似的化合物来触发待测定的分析物的竞争性置换。例如，Elecsys睾酮测试在免疫试剂中含有2-溴雌二醇，以便从其结合蛋白释放睾酮(Package inserts for Elecsys Assay Testosterone (2014-12, V8.0)。然而，该方法可通过占据捕获珠粒中的位置来损害珠粒富集工作流程，因此减少或限制它们捕获分析物本身的能力，可能导致分析物损失。竞争性化合物也可能由于相似的结构而在LC-MS/MS中引起干扰，因此使共洗脱和离子抑制非常可能。
而且，蛋白水解样品处理可用于除去样品基质和分析物释放(US 7964363 B2; US8221986 B2)。然而，蛋白水解试剂从基质蛋白产生多种肽片段，其可通过占据宝贵的珠粒位置而阻碍珠粒-富集工作流程。因此，通过珠粒的分析物捕获以完整的方式是不可能的，导致分析物和灵敏度损失。此外，蛋白水解预处理方法通常需要用不同试剂的多于一个移液步骤，其导致分析仪上更复杂和耗时的工作流程。
离液试剂在文献中也称为用于蛋白变性和细胞溶解的试剂(Peterson PA(1971), J Biol Chem 246, 7748; Marston FAO (1990), Methods Enzymol, 182:264)，并且在测定中作为释放试剂应用(17)。然而，典型的制剂使用高剂量的试剂，用6-8 M浓度的尿素或盐酸胍，其经常引起LC-MS/MS测量中的干扰(Samskog J (2003), JChromatography A, 998:83; Antignac JP (2005, Anal Chim Acta, 529:129; Chiu ML(2010), JALA 15:233; Proc 等人 (2010), J Proteome Res 9: 5422)。
因此，本领域需要用于从样品释放分析物的改进的装置和方法，特别是提供良好的提取效率并且不干扰下游应用、诸如珠粒富集的预处理试剂。该问题通过本文公开的装置和方法解决。
因此，本发明涉及用于从样品释放分析物的体外方法，其包括使所述样品与(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂接触。
如以下中所用，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以是指其中除了这些术语引入的特征之外在该上下文中描述的实体中没有另外特征存在的情况，而且也可以是指其中存在一个或多个另外特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”既可以是指其中除了B之外在A中没有另外要素存在的情况(即其中A单独且仅由B组成的情况)，而且也可以是指其中除了B之外在实体A中存在一种或多种另外要素诸如要素C、要素C和D或甚至另外要素的情况。
此外，如以下中所用，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“具体地”、“更具体地”、“特别地”、“更特别地”或类似术语与任选的特征结合使用，而不限制另外的可能性。因此，这些术语引入的特征是任选的特征，并且不意图以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到，可以通过使用替代特征来执行本发明。类似地，通过“在本发明的一个实施方案中”或类似表述引入的特征意图是任选的特征，关于本发明的另外的实施方案没有任何限制，关于本发明的范围没有任何限制，并且关于将以这样的方式引入的特征与本发明的其他任选或非任选特征组合的可能性没有任何限制。此外，如果没有另外说明，术语“约”涉及具有相关领域中普遍接受的技术精度的指示值，优选地涉及指示值±20%，更优选地±10%，最优选地±5%。
本发明的方法是体外方法。因此，在一个实施方案中，不对人体进行所述方法。此外，在一个实施方案中，本发明的方法不是提供主体的健康状态的诊断的诊断方法；然而，在一个实施方案中，设想本发明的方法提供了医师可发现有助于建立诊断或在决定主体的进一步治疗中可以考虑的信息。此外，所述方法可以包括除了上面明确提及的步骤之外的步骤。例如，另外的步骤可以涉及：例如提供样品，例如，来自主体的样品，在一个实施方案中如下文所述获得；使所述样品与一种或多种如下文所述的另外的化合物接触；和/或在使样品与所述化合物接触后除去不溶性化合物。而且，所述方法的步骤中的一个或多个可以通过自动化设备进行。
如本文所用的术语“样品”是指包含或怀疑包含至少一种分析物的样品。在一个实施方案中，所述样品是生物样品，在一个实施方案中是体液的样品，分离细胞的样品，来自组织或器官的样品或从外体表面或内体表面获得的洗涤/冲洗液的样品。样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括刮擦物、拭子和活检样品。可以通过使用刷子、(棉花)拭子、刮刀、漂洗/洗涤液、穿孔活检设备、用针穿刺腔或外科仪器来获得样品。组织或器官样品可以从任何组织或器官通过例如活检或其他外科手术获得。在一个实施方案中，所述样品是液体样品，在一个进一步实施方案中是体液的样品，例如，在一个实施方案中是血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液和可从乳腺获得的液体，例如乳。在一个进一步实施方案中，所述样品是血液、血浆或血清样品。血液样品可以通过采血、例如通过刺穿动脉和/或静脉血管来获得。血浆和血清样品可以根据众所周知的方法从血液样品获得。在一个实施方案中，所述样品是EDTA血浆样品，在一个进一步实施方案中，所述样品是EDTA血液样品。在一个实施方案中，所述样品包含或怀疑包含至少一种如本文别处指定的分析物。如本文所用，术语“样品”涉及在其与如本文所指定的化合物接触之前的样品。在接触期间，使用术语“释放混合物”，只要存在样品和前述化合物的成分，而在接触之后，即在除去样品和/或前述化合物的成分中的至少一种之后，使用术语“提取物”。在一个实施方案中，所述样品是为了体外评估的目的从个体获得的生物样品。在一个进一步实施方案中，将液体样品在滤纸或膜上干燥。在一个实施方案中，本文使用的样品是指从个体获得的样品的等分试样。
如本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”是本领域技术人员理解的。在一个实施方案中，该术语涉及使本发明的样品与至少所示化合物物理接触，且由此使样品和化合物相互作用。使样品与许多化合物(例如，离液剂、有机溶剂、去污剂和至少一种提供碳酸氢根离子的试剂)接触，可以通过连续添加单一化合物，通过连续添加包含所述化合物中的两种或更多种的试剂，例如，通过添加一种包含离液剂和至少一种提供碳酸氢根离子的试剂的试剂、随后添加包含有机溶剂和去污剂的第二试剂，或者通过使样品与包含所有前述化合物的释放剂、在一个实施方案中与本发明的释放剂接触来实现。在任何前述情况下，使所述样品同时与前述化合物中的所有四种接触，即，使所述样品与所有前述化合物相互作用，使样品接触至少如本文别处所指定的时间范围。在不同时添加所有化合物的情况下，则当添加最后一种化合物时开始指示的孵育时间。
如本文所用，术语“分析物”涉及存在于主体的样品中、在一个实施方案中存在于体液中的化合物。在一个实施方案中，所述分析物是小分子，即，在一个实施方案中，所述分析物不是生物大分子。在一个进一步实施方案中，所述分析物是有机分子，在一个实施方案中是包含至少两个连续碳原子的分子。在一个实施方案中，所述分析物是主体的代谢的分子。在一个进一步实施方案中，所述分析物是施用于所述主体的化合物，例如，在医疗治疗(包括预防性治疗)中。此外，在一个实施方案中，所述分析物是低分子量化合物，在一个实施方案中具有小于5000 Da、在一个实施方案中小于2000 Da的分子量。在一个进一步实施方案中，所述分析物选自类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素。
在一个实施方案中，释放的至少一种分析物是类固醇激素。技术人员已知术语“类固醇激素”涉及具有包含类固醇环系统的结构且在主体中具有激素功能的化合物。在一个实施方案中，所述类固醇激素是皮质类固醇或性类固醇，在一个实施方案中是性类固醇。在一个实施方案中，所述分析物是雄激素、雌激素和孕激素中的至少一种，在一个进一步实施方案中是睾酮、二氢睾酮和雄烯二酮中的至少一种，在一个进一步实施方案中是睾酮。
在一个实施方案中，释放的至少一种分析物是寡肽。如本文所用的术语“寡肽”包括包含经由肽键连接的至少两个氨基酸的所有化合物。在一个实施方案中，所述寡肽包含2至50个氨基酸，在一个实施方案中包含3至25个氨基酸，在一个进一步实施方案中包含4至15个氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸中的至少一个是α-氨基酸，在一个实施方案中是L-α-氨基酸，在一个进一步实施方案中是蛋白氨基酸。如将理解，所述寡肽可以包含另外的化学侧链，包括但不限于甲基基团、乙基基团、亚乙基基团、酮基基团、羟基基团、环状烷基基团、糖残基等。在一个实施方案中，所述寡肽是内源性或治疗性寡肽。在一个进一步实施方案中，所述寡肽是环状寡肽，在一个实施方案中是环状寡肽抗生素，在一个实施方案中是环孢菌素。
在一个实施方案中，释放的至少一种分析物是“聚酮化合物”，该术语是技术人员已知的，并且尤其包括大环内酯类、安沙霉素类、多烯类、四环素类和相关化合物。在一个实施方案中，所述聚酮化合物是大环内酯。如本文所用的术语“大环内酯”涉及一类包含大环内酯结构的化合物。在一个实施方案中，大环内酯环包含8至50个环原子，在一个实施方案中包含12至40个环原子，在一个进一步实施方案中包含15至35个环原子。在一个实施方案中，所述大环内酯包含23个环原子，诸如在他克莫司和吡美莫司中，或所述大环内酯包含31个环原子，诸如在西罗莫司、依维莫司和替西罗莫司中。如技术人员所理解，所述大环内酯可以包含直接或间接连接至大环内酯环和/或内酯环的另外的环结构，并且除了至少一个氧杂原子之外，可能的另外的环还可以包含另外的杂原子，特别是氮原子。此外，所述大环内酯可以进一步包含有机和/或无机侧链，尤其包括甲基基团、乙基基团、亚乙基基团、酮基基团、羟基基团、环状烷基基团、糖残基等。在一个实施方案中，至少一种分析物是依维莫司((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]丙-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮, CAS-编号159351-69-6)，西罗莫司((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E, 30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-2-丙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮，CAS编号53123-88-9)，他克莫司((1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-1,14-二羟基-12-[(1E)-1-[(1R,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]丙-1-烯-2-基]-23,25-二甲氧基-13,19,21,27-四甲基-17-(丙-2-烯-1-基)-11,28-二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.04,9]二十八碳-18-烯-2,3,10,16-四酮, CAS编号104987-11-3)，吡美莫司((1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E)-1-[(1R,3R,4S)-4-氯-3-甲氧基环己基]丙-1-烯-2-基]-17-乙基-1,14-二羟基-23,25-二甲氧基-13,19,21,27-四甲基-11,28-二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.04,9]二十八碳-18-烯-2,3,10,16-四酮, CAS 编号137071-32-0)，或替西罗莫司((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基 3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯,CAS编号162635-04-3)。在一个实施方案中，所述分析物选自依维莫司、西罗莫司、他克莫司、吡美莫司和替西罗莫司，在一个实施方案中选自依维莫司、西罗莫司和他克莫司，在一个进一步实施方案中是依维莫司，在一个实施方案中是西罗莫司，在一个实施方案中是他克莫司。
在一个实施方案中，释放的至少一种分析物是“维生素”，技术人员已知该术语涉及主体少量需要且主体的身体不能合成的有机化合物。还如技术人员已知，术语“维生素”是物种特异性分类，因为取决于物种，化合物可以是维生素或不是维生素。在一个实施方案中，所述维生素是人主体的维生素，即是人维生素。在一个实施方案中，所述分析物是维生素A(视黄醇)、B1 (硫胺素)、B2 (核黄素)、B3 (烟酸)、B5 (泛酸)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (叶酸)、B12 (氰钴维生素)、C(抗坏血酸)、维生素D(胆钙化醇或麦角钙化醇)、E(生育酚)和K(叶绿醌)之一。在一个实施方案中，所述分析物是疏水性维生素，在一个实施方案中是疏水性人维生素，在一个进一步实施方案中是人A、B或D维生素，在一个进一步实施方案中是维生素D。在一个实施方案中，术语“维生素D“应理解为包括所有天然存在的化合物，其含有维生素D2的骨架或维生素D3的骨架。在一个进一步实施方案中，所述维生素是维生素D3，在一个进一步实施方案中是25-羟基-维生素D3。
在一个实施方案中，从根据本发明的样品释放许多分析物。在一个实施方案中，从所述样品释放至少4种，在一个实施方案中至少10种，在一个进一步实施方案中，至少100种分析物。在一个实施方案中，所述释放的分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的至少一种，在一个实施方案中至少两种，在一个进一步实施方案中至少三种，在一个进一步实施方案中全部。
如本文所用的术语“释放分析物”涉及将样品中包含的分析物带入或维持在溶液中。如技术人员所理解，本发明的分析物可以自由溶解于样品中而存在，或者可以与样品的成分(例如，与蛋白，与膜)结合，包埋在囊泡中，等。根据本发明，在提取后发现可溶于提取溶液中的特定分析物的分数是所述样品中存在的总分析物的至少50%，在一个实施方案中是至少60%，在一个进一步实施方案中是至少70%，在一个进一步实施方案中是至少80%，在一个进一步实施方案中是至少90%。因此，在一个实施方案中，本发明的方法的提取效率是至少50%，在一个实施方案中是至少60%，在一个进一步实施方案中是至少70%，在一个进一步实施方案中是至少80%，在一个进一步实施方案中是至少90%。在一个实施方案中，释放分析物包括破坏和/或溶解生物膜和/或包括使蛋白变性和/或沉淀。如技术人员所理解，术语“使蛋白变性”涉及在所述蛋白中诱导构象状态，其不同于其天然构象。在一个实施方案中，变性是使蛋白解折叠以释放由该蛋白结合的辅因子和/或其他分析物。因此，在一个实施方案中，使蛋白变性可包括所述蛋白的沉淀；然而，使蛋白变性也可以是使多肽解折叠和溶解。
如本文所用，术语“主体”涉及脊椎动物。在一个实施方案中，所述主体是哺乳动物，在一个进一步实施方案中，是小鼠、大鼠、猫、狗、仓鼠、豚鼠、绵羊、山羊、猪、牛或马。仍在一个进一步实施方案中，所述主体是灵长类动物。在一个进一步实施方案中，所述主体是人。在一个实施方案中，所述主体患有或怀疑患有与至少一种分析物的正常值的可测量偏差相关的疾病或病况。在一个进一步实施方案中，所述主体接受药物治疗，包括施用至少一种分析物，在一个实施方案中类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素中的至少一种。在一个进一步实施方案中，所述主体接受药物治疗，包括施用睾酮、环孢菌素、依维莫司和维生素D3中的至少一种。在一个进一步实施方案中，所述主体接受药物治疗，包括施用环孢菌素和依维莫司中的至少一种。
如本文所用，术语“离液剂”涉及破坏水分子之间的氢键键合和破坏生物大分子的三级结构的化合物。在一个实施方案中，所述离液剂包含胍盐离子，即是氯化胍或硫氰酸胍，是硫脲，或是尿素。在一个实施方案中，所述离液剂是不包含硫原子的试剂。因此，在一个实施方案中，所述离液剂包含或是氯化胍或尿素，在一个进一步实施方案中包含或是氯化胍，在一个进一步实施方案中包含或是尿素。在一个实施方案中，所述离液剂是氯化胍或尿素，在一个进一步实施方案中是氯化胍，在一个进一步实施方案中是尿素。在一个实施方案中，离液剂、在一个实施方案中氯化胍、在一个进一步实施方案中尿素的浓度是1 M至4M，在一个实施方案中是2 M至3.5 M，其中所述浓度是在所述接触期间处理的样品中的浓度。
如本文所用的术语“有机溶剂”涉及化合物，其分子包含至少一个碳原子并且在IUPAC标准环境温度和压力条件(温度：25℃，压力：105 kPa)下是液体。在一个实施方案中，所述有机溶剂具有至少50℃、在一个实施方案中至少60℃、在一个进一步实施方案中至少70℃、在一个进一步实施方案中至少80℃的沸点。在一个实施方案中，所述有机溶剂是中性有机溶剂，在一个进一步实施方案中是非质子溶剂。在一个实施方案中，所述有机溶剂是极性溶剂，在一个实施方案中是非质子极性溶剂。在一个实施方案中，所述有机溶剂具有至少1.5D、在一个实施方案中至少2D、在一个进一步实施方案中至少2.5D、在一个进一步实施方案中至少3D的偶极矩。在一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、碳酸亚丙酯和乙腈，在一个进一步实施方案中是乙腈。在一个实施方案中，所述有机溶剂、在一个实施方案中乙腈的浓度是2% (v/v)至20% (v/v)，在一个实施方案中是3% (v/v)至15% (v/v)，在一个实施方案中是5% (v/v)至10% (v/v)，其中所述浓度是在所述接触期间处理的样品中的浓度。
如本文所用，术语“去污剂”涉及原则上技术人员众所周知的降低水的表面张力的两亲化合物。在一个实施方案中，所述去污剂是两亲化合物的混合物；在一个进一步实施方案中，所述去污剂是单一两亲化合物，即是表面活性剂。在一个实施方案中，所述去污剂包含非离子表面活性剂，在一个实施方案中由非离子表面活性剂组成。在一个进一步实施方案中，所述去污剂是非离子表面活性剂。在一个实施方案中，所述去污剂包含或是聚乙二醇烷基醚、聚丙二醇烷基醚、聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇烷基苯基醚、甘油烷基酯或糖苷烷基醚。在一个实施方案中，所述糖苷烷基醚是具有5至12个碳原子的烷基链的烷基-糖苷，在一个进一步实施方案中是具有5至12个碳原子的烷基链的烷基-葡糖苷，在一个进一步实施方案中是辛基糖苷。在一个进一步实施方案中，所述去污剂包含或是烷基-糖苷，在一个实施方案中是月桂基葡糖苷、癸基葡糖苷或辛基-葡糖苷，在一个进一步实施方案中是辛基-葡糖苷，在一个进一步实施方案中是β-D-辛基-葡糖苷((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟基甲基)-6-辛氧基恶烷(octoxyoxane)-3,4,5-三醇，CAS No:29836-26-8)。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度是0.2% (w/v)至20% (w/v)，在一个实施方案中是0.3%(w/v)至2% (w/v)，其中所述浓度是在所述接触期间处理的样品中的浓度。
如本文所用，术语“提供碳酸氢根离子的试剂”包括在pH 7的水溶液中与碳酸氢根离子化学平衡的任何化合物。根据本发明的“碳酸氢根离子”(碳酸氢根离子)是具有经验式HCO3 −的阴离子，其形式上具有61.01道尔顿的分子量。碳酸氢根离子可以由含有至少一种碳酸氢盐或碳酸盐的化合物和/或由能够在水解后释放碳酸氢根离子的化合物提供。根据本发明的“碳酸盐”是包含碳酸根离子的化合物；在一个实施方案中，所述碳酸盐是可溶性碳酸盐，尤其是碳酸钠(Na2CO3)、碳酸钾(K2CO3)或碳酸铵((NH4)2CO3)。根据本发明的“碳酸氢盐”是包含HCO3 −离子的化合物，在一个实施方案中选自碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢钾(KHCO3)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、碳酸氢钙(Ca(HCO3)2)和碳酸氢镁(Mg(HCO3)2。根据本发明的一个实施方案，“在水解后能够释放碳酸氢根离子的化合物”是碳酸酯。根据本发明的“碳酸酯”是侧接两个烷氧基基团的羰基基团。这些碳酸酯的一般结构是R1O(C=O)OR2，其中R1和R2是烷基或环烷基，在一个实施方案中独立地选自甲基、乙基、丙酰基和丁基，或R1和R2一起形成烷基-桥，尤其是乙烯基。因此，存在环状碳酸酯(例如碳酸亚乙酯)或非环状碳酸酯(例如碳酸二甲酯)以及其可得的羟基化或卤代衍生物。
如技术人员所理解，碳酸酯引起水溶液的碱化。因此，在一个实施方案中，碳酸盐尤其用于释放对碱性条件不敏感的分析物。在一个进一步实施方案中，尤其是在应当释放对碱性pH敏感的分析物(例如，大环内酯)的情况下，调节在接触步骤期间的pH，或者在一个实施方案中，可以使用碳酸氢盐或碳酸酯。因此，在一个实施方案中，所述提供碳酸氢根离子的试剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙和碳酸氢镁。在一个进一步优选的实施方案中，所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵。进一步优选地，所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠和碳酸氢钾。
在一个实施方案中，所述提供碳酸氢根离子的试剂分别是环状或非环状碳酸酯或其羟基化或卤代衍生物。在一个进一步实施方案中，所述提供碳酸氢根离子的试剂分别是环状或非环状碳酸酯或其卤代衍生物。在一个进一步实施方案中，所述环状或非环状碳酸酯或其卤代衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸亚丙酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲基酯、赤藓糖醇双碳酸酯、甘油1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮、4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮、2,5-二氧杂己二酸二甲酯、1,2-碳酸亚丁酯、顺式2,3碳酸亚丁酯和反式2,3碳酸亚丁酯。在一个进一步实施方案中，所述环状或非环状碳酸酯或其卤代衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸亚丙酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲基酯、赤藓糖醇双碳酸酯、甘油1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮和4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮。在一个进一步实施方案中，所述环状或非环状碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、甘油1,2-碳酸酯、碳酸亚丙酯和碳酸亚乙烯酯。在一个进一步实施方案中，所述环状或非环状碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、甘油1,2-碳酸酯和碳酸亚丙酯。在一个进一步实施方案中，所述环状或非环状碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯和甘油1,2-碳酸酯。在一个进一步实施方案中，所述提供碳酸氢根离子的试剂包含或是如上所指示的碳酸酯，在一个实施方案中包含或是环状碳酸酯，在一个实施方案中包含或是碳酸亚乙酯(1,3-二氧杂环戊烷-2-酮， CAS编号：96-49-1)。
在一个实施方案中，由至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1 M至2 M，在一个实施方案中为0.2 M至0.5 M，其中所述浓度是在所述接触期间处理的样品中的浓度。如本文所用，在形式基础上提供碳酸氢根离子的浓度指示，假设相应的提供碳酸氢根离子的试剂的所有CO3-单元作为碳酸氢根离子存在，在一个实施方案中，与pH无关；因此，例如，假设碳酸盐的0.1 M溶液提供浓度为0.1 M的碳酸氢根离子；此外，假设碳酸酯的0.1 M溶液提供浓度为0.1 M的碳酸氢根离子，与实际水解程度无关。
如技术人员将理解，可以任意混合多于一种提供碳酸氢根离子的试剂以实现本发明中公开的效果。此外，如技术人员所知，在水溶液中，碳酸氢根离子根据以下方程与二氧化碳平衡：
2 H2O + CO2 ⇌ H2O + H2CO3 ⇌ H3O+ + HCO3 -。
因此，碳酸的盐，即碳酸盐和碳酸氢盐，与挥发性二氧化碳平衡，并且尤其合适作为在短期或中期储存试剂中提供碳酸氢根离子的试剂。另一方面，碳酸酯可以尤其考虑用于长期储存试剂，尤其是储存至少4周，在一个实施方案中至少2个月，在一个进一步实施方案中至少3个月，在一个进一步实施方案中至少6个月。
令人惊讶地，在本发明的基础工作中发现，通过在释放混合物(预处理混合物)中包括提供碳酸氢根离子的试剂，可以降低离液剂的浓度，而不会不利地影响提取效率。因此，在一个实施方案中，(i)所述离液剂和(ii)由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度的总和为至少1.5 M，在一个实施方案中为1.5 M至4 M。
如上所示，分析物和它们的提取效率可以对极端pH敏感，尤其是如果接触延长的时间段。因此，在接触步骤期间的pH，在一个实施方案中为3至9，在一个实施方案中为4至8，在一个进一步实施方案中为5至7.5。在一个实施方案中，在接触步骤期间的pH为6.5 ±1.5，在一个进一步实施方案中为6.5 ± 1，在一个进一步实施方案中为6.5 ± 0.5，在一个进一步实施方案中为6.5 ± 0.3。进一步，分析物和它们的提取效率可以对温度偏差敏感，尤其是如果接触延长的时间段。因此，在一个实施方案中，所述接触步骤，在一个实施方案中，在至多50℃、在一个实施方案中至多45℃、在一个进一步实施方案中至多40℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述接触步骤在至少0℃、在一个实施方案中至少10℃、在一个进一步实施方案中至少20℃、在一个进一步实施方案中至少25℃、在一个进一步实施方案中至少30℃的温度下进行。因此，在一个实施方案中，接触步骤在10℃至50℃、在一个实施方案中20℃至45℃、在一个进一步实施方案中25℃至40℃、在一个进一步实施方案为37℃± 2℃、在一个进一步实施方案中约37℃、在一个进一步实施方案中37℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述接触步骤进行至多1 h，在一个实施方案中进行至多30 min，在一个进一步实施方案中进行至多20 min。在一个实施方案中，所述接触步骤进行至少2 min，在一个实施方案中进行至少3 min，在一个进一步实施方案中进行至少5 min，在一个进一步实施方案中进行至少8 min，在一个进一步实施方案中进行至少12 min。因此，在一个实施方案中，所述接触步骤进行2至30 min，在一个实施方案中进行3至20 min，在一个进一步实施方案中进行5至15 min。技术人员能够验证如上所示的条件用于释放目标分析物的适合性，例如，通过在预期条件下孵育目标分析物和测定孵育后剩余的目标分析物的量。在一个实施方案中，对于整个程序，即在一个实施方案中，维持前述pH和温度的条件，同时进行用于释放分析物的方法，在一个进一步实施方案中，同时进行用于测定至少一种分析物的方法。
用于释放分析物的方法还可以包括使样品与另外的试剂接触。例如，在一个实施方案中，所述释放混合物可以进一步包含还原剂，例如硫醇或还原蛋白中的二硫键的其他试剂，尤其是2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl、同型半胱氨酸-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、二硫代赤藓醇(DTE)、N-甲基马来酰亚胺、Ellman氏试剂和1,2-二硫戊烷-3-羧酸。进一步，在一个实施方案中，可以包括pH-稳定剂，例如缓冲剂。
有利地，在本发明的基础工作中发现，通过使样品、尤其是血液或血液来源的样品与本发明的化合物接触，可以高效提取尤其广泛范围的化合物，包括本领域已知难以提取的化合物，诸如维生素D。因此，本发明提供了高效的通用提取方法和相应的试剂，其特别非常适合用于提取类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素，尤其是在应当同时提取前述化合物类别中的两种或更多种的成员的情况下。此外，发现通过在释放混合物中包括提供碳酸氢根离子的试剂，可以显著减少完全释放所需的离液剂的量，因此尤其避免质谱法中的问题，诸如离子抑制。
上面做出的定义加上必要的变更适用于以下内容。下面进一步做出的额外的定义和解释加上必要的变更也适用于本说明书中描述的所有实施方案。
本发明进一步涉及用于从样品释放分析物的释放剂，其包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂。
如本文所用的术语“释放剂”涉及至少包含所指定的化合物的混合物。原则上，所述释放剂可以以固体形式提供，在一个实施方案中以适当的浓度溶解或由使用者直接添加至样品中。在一个实施方案中，所述释放剂是至少包含所指定的化合物的水溶液。在一个进一步实施方案中，释放试剂是三倍浓缩的溶液，在一个实施方案中是即用的，即提供用于直接三倍稀释至如本文所指定的样品中，即通过将一份释放剂与两份样品合并。如技术人员所理解，所述释放剂也可以以不同的浓度比提供，例如在一个实施方案中，作为两倍、四倍或五倍浓缩物。技术人员能够建立适合于特定应用的释放剂的浓缩倍数，尤其考虑释放剂的成分的溶解度，以及样品和目标分析物的特定特性。例如，在分析物在样品中高度浓缩的情况下，提供需要强烈稀释样品的释放剂(例如，1.1倍浓缩释放剂)可以是合适的。另一方面，在预期分析物以低浓度存在于样品中，可以考虑更高的浓缩倍数。
在一个实施方案中，所述释放剂是三倍浓缩的溶液。因此，在一个实施方案中，释放剂、尤其是三倍浓缩的释放剂中的离液剂的浓度为2 M至饱和，在一个实施方案中为2.5M至6 M。在一个进一步实施方案中，释放剂、尤其是三倍浓缩的释放剂中的有机溶剂的浓度为2% (v/v)至30% (v/v)，在一个实施方案中为5% (v/v)至20% (v/v)，在一个实施方案中为15% (v/v)至20% (v/v)。在一个进一步实施方案中，释放剂、尤其是三倍浓缩的释放剂中的去污剂的浓度是0.5% (w/v)至20% (w/v)，在一个实施方案中是1%(w/v)至3% (w/v)。在一个进一步实施方案中，由释放剂、尤其是三倍浓缩的释放剂中的至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1 M至6 M，在一个实施方案中为0.5 M至2 M。在一个进一步实施方案中，释放剂、尤其是三倍浓缩的释放剂中的(i)所述离液剂和(ii)由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度的总和为至少2 M，在一个实施方案中为3 M至8 M。因此，在一个实施方案中，在所述释放剂中，尤其是在三倍浓缩的释放剂中，所述离液剂的浓度为2 M至饱和，在一个实施方案中为2.5 M至6 M；所述有机溶剂的浓度为2% (v/v)至30% (v/v)，在一个实施方案中为5% (v/v)至20%(v/v)，在一个实施方案中为15% (v/v)至20% (v/v)；所述去污剂的浓度为0.5% (w/v)至20% (w/v)，在一个实施方案中为1% (w/v)至3% (w/v)；且由至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1 M至6 M，在一个实施方案中为0.5 M至2 M；且，任选地，(i)所述离液剂和(ii)由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度的总和为至少2 M，在一个实施方案中为3 M至8 M。
除了指定化合物以外，所述释放剂还可以包含化合物。例如，在一个实施方案中，硫醇化合物、缓冲剂等。
本发明还涉及包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂的组合物、在一个实施方案中根据本发明的释放剂和/或本发明的用于从样品释放分析物的方法用于从样品释放至少一种分析物的用途。
进一步，本发明涉及试剂盒，其包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂，在一个实施方案中其包含本发明的释放剂（其包含在壳体中），在一个实施方案中其进一步包含用于至少一种分析物的至少一种检测剂。
如本文所用的术语“试剂盒”是指可以包装在一起或可以不包装在一起的本发明的前述化合物、装置或试剂的集合。试剂盒的组分可以由分开的壳体(即，作为分开部分的试剂盒)包含，或两种或更多种组分可以提供在单个壳体中。因此，所述试剂盒可以包含表示为单一化合物、例如作为用于由使用者溶解的纯化合物和/或作为即用型溶液的化合物。所述试剂盒还可以包含前述化合物中的两种或更多种的混合物，例如，包含离液剂和至少一种提供碳酸氢根离子的试剂的试剂和包含有机溶剂和去污剂的第二试剂，或所述试剂盒可以包含含有所有前述化合物的试剂，尤其是可以包含本发明的释放剂。此外，应理解，在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于实施本文提及的用于从样品释放分析物的方法或用于测定样品中的至少一种分析物的方法。在一个实施方案中，设想为了实施本文提及的方法，组分以即用方式提供。在一个实施方案中，所述化合物中的所有或一些以浓缩液体形式提供，其中浓缩组分使用液体、诸如本文别处指定的水性缓冲溶液或水稀释。此外，在一个实施方案中，试剂盒含有用于实施所述方法的说明书。说明书可以由用户手册以纸张或电子形式提供。此外，所述手册可以包含用于解释当使用本发明的试剂盒实施上面提及的方法时获得的结果的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含水、缓冲液和/或用于实施该方法的合适容器。
所述试剂盒可以进一步包含至少一种分析物的检测剂。如本文所用的术语“检测剂”涉及帮助检测分析物的任何试剂。因此，所述检测剂可以是与分析物相互作用或经历与分析物的化学反应的化合物。在一个实施方案中，所述检测剂是直接或间接结合本发明的分析物的化学分子。如技术人员将理解，所述检测剂也可以是间接检测剂，即不直接接触分析物、但通过本身结合分析物的另外的化合物的方式接触的检测剂。在一个实施方案中，所述检测剂是直接检测剂，即是直接结合分析物的试剂。在一个实施方案中，所述检测剂是抗体，在一个实施方案中是IgG。在一个实施方案中，所述检测剂是单克隆抗体。在一个进一步实施方案中，所述检测剂是与指示剂化合物(即可以通过技术人员已知的方式检测其在样品中的存在的化合物)结合的抗体。已知的指示剂化合物包括染料，电化学活性基团，或珠粒如乳胶珠粒。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含提取容器，其可以是用于单次提取的容器，例如，塑料管或Eppendorf杯，或用于多次提取的设备，尤其是多孔板，例如96孔板。在一个实施方案中，所述提取容器可以包含预定量或体积的本发明的释放试剂；例如，在一个实施方案中，预定体积可以在多孔板的孔中提供或可以干燥至所述孔中。
本发明还涉及用于测定样品中的至少一种分析物的方法，其包括
(a) 根据本发明的用于从样品释放分析物的方法释放所述分析物，以生成提取物；
(b) 测定所述提取物中的所述释放的分析物；和，由此
(c) 测定样品中的所述分析物。
如本文所用的术语“测定”是指测定在从样品获得的提取物中待测定的分析物的至少一种特征性特征。根据本发明的特征性特征是表征分析物的物理和/或化学特性、包括生物化学特性的特征。此类特征包括例如分子量、粘度、密度、电荷、自旋、光学活性、颜色、荧光、化学发光、元素组成、化学结构、与其他化合物反应的能力、在生物读出系统中引发响应(例如，报告基因的诱导)的能力等。所述特性的值可以充当特征性特征，并且可以通过本领域众所周知的技术测定。而且，所述特征性特征可以是通过标准操作(例如，数学计算诸如乘法、除法或对数微积分)从分析物的物理和/或化学特性的值导出的任何特征。在一个实施方案中，所述至少一种特征性特征允许测定和/或化学鉴定分析物及其量。因此，在一个实施方案中，特征性值还包含与由其推导所述特征性值的分析物的丰度相关的信息。例如，分析物的特征性值可以是质谱中的峰。这种峰含有分析物的特征性信息，即m/z信息，以及与提取物中所述分析物的丰度(即其量)相关的强度值。
在一个实施方案中，由样品包含的分析物可以根据本发明定量或半定量地测定。对于定量测定，基于针对上文提及的特征性特征所测定的值，测定分析物的绝对或精确量，或测定分析物的相对量。可以在分析物的精确量无法测定或不应测定的情况下测定相对量。在所述情况下，可以确定分析物的存在量相对于包含第二量的分析物的第二样品是增大还是减少。因此，定量分析分析物还包括有时被称为分析物的半定量分析的分析。
此外，在一个实施方案中，如在本发明的方法中所用的测定，可以包括在前面提及的分析步骤之前使用化合物分离步骤。在一个实施方案中，所述化合物分离步骤产生由样品包含的代谢物的时间分辨的分离。因此，用于待根据本发明使用的合适的分离技术包括所有色谱分离技术，诸如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层色谱、大小排阻或亲和色谱。这些技术是本领域众所周知的，并且可以由本领域技术人员应用，而无需再费周折。在一个实施方案中，LC和/或GC是通过本发明的方法设想的色谱技术。用于这种分析物测定的合适设备也是本领域已知的。在一个实施方案中，质谱法用于测定分析物，尤其是气相色谱质谱(GC-MS)，液相色谱质谱(LC-MS)，直接输注质谱或傅里叶变换离子-回旋共振质谱(FT-ICR-MS)，毛细管电泳质谱(CE-MS)，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)，四极杆质谱，任何依次联用的质谱，诸如MS-MS或MS-MS-MS，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，热解质谱(Py-MS)，离子迁移质谱或飞行时间质谱(TOF)。作为质谱技术的替代或除了质谱技术以外，以下技术可用于化合物测定：核磁共振(NMR)，磁共振成像(MRI)，傅里叶变换红外分析(FT-IR)，紫外(UV)光谱，折射指数(RI)，荧光检测，放射化学检测，电化学检测，光散射(LS)，色散拉曼光谱或火焰离子化检测(FID)。这些技术是本领域技术人员众所周知的，并且可以应用，而无需再费周折。在一个实施方案中，本发明的方法应当通过自动化辅助。例如，样品处理可以通过机器人自动化。在一个实施方案中，数据处理和比较通过合适的计算机程序和数据库辅助。如前文所述的自动化允许在高通量方法中使用本发明的方法。因此，在一个实施方案中，所述方法是用于测定多种分析物的方法，在一个实施方案中，其中所述多种是至少两种，在一个实施方案中至少四种，在一个进一步实施方案中至少十种，在一个进一步实施方案中至少25种，在一个进一步实施方案中至少50种分析物。在一个进一步实施方案中，根据用于测定至少一种分析物的方法的步骤a)，从一种提取物或从多种提取物测定多种分析物。
此外，至少一种分析物也可以通过特定的化学或生物测定来测定。所述测定应当包括允许特异性检测样品中的至少一种分析物的装置。在一个实施方案中，所述装置能够特异性识别分析物的化学结构或能够基于其与其他化合物反应的能力或其在生物读出系统中引发响应(例如，报告基因的诱导)的能力来特异性鉴定分析物。在一个实施方案中，能够特异性识别分析物的化学结构的装置是抗体或与化学结构特异性相互作用的其他蛋白，诸如受体或酶。例如，可以通过本领域众所周知的方法使用分析物作为抗原获得特定抗体。如本文所提及的抗体包括多克隆和单克隆抗体两者，以及其能够结合抗原或半抗原的片段，诸如Fv、Fab和F(ab)2片段。此外，涵盖单链抗体和纳米抗体。还包括人源化杂合抗体，其中表现出期望抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。供体序列通常至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但同样可以包含供体抗体的其他结构和/或功能相关的氨基酸残基。此类杂合物可以通过本领域众所周知的几种方法制备。在一个实施方案中，能够特异性识别分析物的合适蛋白是参与所述分析物的代谢转化的酶。所述酶可以使用分析物作为底物或可以将底物转化为分析物。此外，所述抗体可以用作生成特异性识别分析物的寡肽的基础。例如，这些寡肽应当包含所述分析物的酶的结合结构域或口袋。合适的基于抗体和/或酶的测定可以是RIA(放射免疫测定)，ELISA(酶联免疫吸附测定)，夹心酶免疫测试，电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)，解离增强的镧系元素氟免疫测定(DELFIA)或固相免疫测试。此外，所述分析物还可以基于其与其他化合物反应的能力，即通过特定的化学反应来测定。进一步，由于其在生物读出系统中引发响应的能力，可以在样品中测定所述分析物。应当检测生物响应作为读出值，指示由样品包含的分析物的存在和/或量。所述生物响应可以是，例如，基因表达的诱导或细胞或生物体的表型响应。在一个实施方案中，至少一种分析物的测定是定量过程，例如，还允许测定样品中的至少一种分析物的量。
本发明进一步涉及用于测定样品中的分析物的设备，其包括根据本发明和/或被配置为执行本发明的方法的释放剂。
如本文所用，术语“设备”涉及包括至少所述可操作地相互连接以允许测定的装置的装置系统。如何以操作方式连接设备的装置将取决于包括在设备中的装置的类型。在一个实施方案中，所述装置由单个设备包括。在一个实施方案中，所述设备至少包括分析单元，所述分析单元被配置成从样品提取至少一种分析物；在一个实施方案中，所述分析单元包括根据本发明的释放剂，和/或被配置为执行本发明的方法。所述分析单元还可以配置为检测至少一种分析物。此外，所述设备可以进一步包括评估单元，用于评估从分析单元获得的数据，例如，与测定分析物相关的数据。因此，在一个实施方案中，所述设备进一步包括适于测定至少一种分析物的分析单元和/或适于计算所述样品中的所述分析物的量和/或浓度的评估单元。因此，在一个实施方案中，所述设备是分析设备，在一个实施方案中是体外诊断设备。本领域技术人员将意识到如何连接前述装置而无需再费周折。在一个实施方案中，所述设备适于包括如本文所述的额外特征。
鉴于上述内容，特别设想了以下实施方案：
1. 用于从样品释放分析物的体外方法，其包括使所述样品与(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂接触。
2. 实施方案1的方法，其中所述离液剂的浓度为1 M至4 M，在一个实施方案中为2M至3.5 M。
3. 实施方案1或2的方法，其中所述有机溶剂的浓度为2% (v/v)至20% (v/v)，在一个实施方案中为3% (v/v)至15% (v/v)，在一个实施方案中为5% (v/v)至10% (v/v)。
4. 实施方案1至3中任一项的方法，其中所述去污剂的浓度为0.2% (w/v)至20%(w/v)，在一个实施方案中为0.3%(w/v)至2% (w/v)。
5. 实施方案1至4中任一项的方法，其中由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1 M至2 M，在一个实施方案中为0.2 M至0.5 M。
6. 实施方案1至5中任一项的方法，其中(i)所述离液剂和(ii)由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度的总和为至少1.5 M，在一个实施方案中为1.5 M至4 M。
7. 实施方案1至6中任一项的方法，其中所述浓度是在所述接触期间处理的样品中的浓度。
8. 实施方案1至7中任一项的方法，其中所述样品是生物样品，在一个实施方案中是来自主体的生物样品。
9. 实施方案1至8中任一项的方法，其中所述样品是体液样品，在一个实施方案中是血液、血浆或血清样品。
10. 实施方案1至9中任一项的方法，其中所述分析物中的至少一种是低分子量分析物，在一个实施方案中具有小于5000 Da、在一个实施方案中小于2000 Da的分子量。
11. 实施方案1至10中任一项的方法，其中所述分析物包含类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素中的至少一种。
12. 实施方案1至11中任一项的方法，其中所述分析物包含类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素中的至少两种，在一个实施方案中至少三种，在一个进一步实施方案中全部。
13. 实施方案1至12中任一项的方法，其中所述类固醇激素是雄激素、雌激素和孕激素中的至少一种，在一个实施方案中是睾酮。
14. 实施方案1至13中任一项的方法，其中所述寡肽是内源性或治疗性寡肽，在一个实施方案中是环状寡肽，在一个实施方案中是环状寡肽抗生素，在一个实施方案中是环孢菌素。
15. 实施方案1至14中任一项的方法，其中所述聚酮化合物是大环内酯，在一个实施方案中是抗生素大环内酯和免疫抑制大环内酯中的至少一种，在一个实施方案中是他克莫司、西罗莫司或依维莫司，在一个进一步实施方案中是依维莫司。
16. 实施方案1至15中任一项的方法，其中所述维生素是人维生素，在一个实施方案中是疏水性人维生素，在一个进一步实施方案中是人A、B或D维生素，在一个进一步实施方案中是维生素D，在一个进一步实施方案中是维生素D3，在一个进一步实施方案中是25-羟基-维生素D3。
17. 实施方案1至16中任一项的方法，其中所述分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的至少一种，在一个实施方案中至少两种，在一个进一步实施方案中至少三种，在一个进一步实施方案中全部。
18. 实施方案1至17中任一项的方法，其中所述离液剂、有机溶剂、去污剂和任选环状碳酸酯从三倍浓缩的释放剂提供，在一个实施方案中从根据实施方案19至34中任一项的释放剂提供。
19. 用于从样品释放分析物的释放剂，其包含
(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂。
20. 实施方案19的释放剂，其中所述释放剂是三倍浓缩的溶液。
21. 实施方案19或20的释放剂，其中所述离液剂的浓度为2 M至饱和，在一个实施方案中为2.5 M至6 M。
22. 实施方案19至21中任一项的释放剂，其中所述有机溶剂的浓度为2% (v/v)至30% (v/v)，在一个实施方案中为5% (v/v)至20% (v/v)，在一个实施方案中为15% (v/v)至20% (v/v)。
23. 实施方案19至22中任一项的释放剂，其中所述去污剂的浓度为0.5% (w/v)至20% (w/v)，在一个实施方案中为1%(w/v)至3% (w/v)。
24. 实施方案19至23中任一项的释放剂，其中由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1 M至6 M，在一个实施方案中为0.5 M至2M。
25. 实施方案19至24中任一项的释放剂，其中(i)所述离液剂和(ii)由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度的总和为至少2 M，在一个实施方案中为3 M至8 M。
26. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至25中任一项的释放剂，其中所述离液剂是不包含硫原子的试剂。
27. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至26中任一项的释放剂，其中所述离液剂是盐酸胍和/或尿素，在一个实施方案中是盐酸胍。
28. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至27中任一项的释放剂，其中所述有机溶剂是乙腈。
29. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至28中任一项的释放剂，其中所述去污剂是非离子去污剂，在一个实施方案中是烷基-糖苷。
30. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至29中任一项的释放剂，其中所述去污剂是具有5至12个碳原子的烷基链的烷基-糖苷，在一个进一步实施方案中是具有5至12个碳原子的烷基链的烷基-葡糖苷，在一个进一步实施方案中是辛基糖苷，在一个进一步实施方案中是辛基-葡糖苷，在一个进一步实施方案中是β-D-辛基-葡糖苷((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟基甲基)-6-辛氧基恶烷-3,4,5-三醇，CAS编号：29836-26-8)。
31. 实施方案1至18中任一项的方法或实施方案19至30中任一项的释放剂，其中所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂包含环状碳酸酯，在一个实施方案中包含或是碳酸亚乙酯(1,3-二氧杂环戊烷-2-酮，CAS编号：96-49-1)。
32. 实施方案19至31中任一项的释放剂，其中所述样品是生物样品，在一个实施方案中是来自主体的生物样品。
33. 实施方案19至32中任一项的释放剂，其中所述样品是体液样品，在一个实施方案中是血液、血浆或血清样品。
34. 实施方案19至33中任一项的释放剂，其中所述释放剂是水溶液。
35. 在一个实施方案中包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂的组合物释放剂、根据实施方案19至34中任一项的释放剂和/或根据实施方案1至18中任一项的方法用于从样品释放至少一种分析物的用途。
36. 试剂盒，其包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂，在一个实施方案中包含本发明的释放剂（其包含在壳体中），在一个实施方案中进一步包含用于至少一种分析物的至少一种检测剂。
37. 用于测定样品中的至少一种分析物的方法，其包括
(a) 根据实施方案1至18中任一项的方法释放所述分析物以生成提取物；
(b) 测定所述提取物中的所述释放的分析物；和，由此
(c) 测定样品中的所述分析物。
38. 实施方案37的方法，其中所述方法是用于测定多种分析物的方法。
39. 实施方案37或38的方法，其中所述多种是至少两种，在一个实施方案中至少四种，在一个进一步实施方案中至少十种，在一个进一步实施方案中至少25种，在一个进一步实施方案中至少50种分析物。
40. 实施方案37至39中任一项的方法，其中根据步骤a)从一种提取物或从多种提取物测定所述多种分析物。
41. 用于测定样品中的分析物的设备，其包括根据实施方案19至34中任一项的释放剂和/或被配置为执行根据实施方案1至18和/或37至40中任一项的方法。
42. 实施方案41的设备，其中所述设备是分析设备，在一个实施方案中是体外诊断设备。
43. 实施方案41或42的设备，其中所述设备进一步包括适于测定至少一种分析物的分析单元和/或适于计算所述样品中的所述分析物的量和/或浓度的评估单元。
44. 根据实施方案1至18或37至40中任一项的方法，其中所述接触包括使所述样品在6.5 ± 0.3的pH下与以下接触：
(i) 浓度为约3.3 M的氯化胍，浓度为约0.33 M的碳酸亚乙酯，浓度为约10% (v/v)的乙腈和浓度为约1% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(ii) 浓度为约1.3 M的氯化胍，浓度为约0.33 M的碳酸亚乙酯，浓度为约10% (v/v)的乙腈和浓度为约1% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(iii) 浓度为约2 M的氯化胍，浓度为约0.2 M的碳酸亚乙酯，浓度为约6% (v/v)的乙腈和浓度为约0.6% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；或
(iv) 浓度为约1.3 M的氯化胍，浓度为约0.8 M的碳酸亚乙酯，浓度为约6% (v/v)的乙腈和浓度为约0.6% (w/v)的β-辛基-葡糖苷。
45. 根据实施方案1至18或37至40中任一项的方法，其中所述接触包括使所述样品在6.5 ± 0.3的pH下与以下接触：
(i) 浓度为3.3 M的氯化胍，浓度为0.33 M的碳酸亚乙酯，浓度为10% (v/v)的乙腈和浓度为1% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(ii) 浓度为1.3 M的氯化胍，浓度为0.33 M的碳酸亚乙酯，浓度为10% (v/v)的乙腈和浓度为1% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(iii) 浓度为2 M的氯化胍，浓度为0.2 M的碳酸亚乙酯，浓度为6% (v/v)的乙腈和浓度为0.6% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；或
(iv) 浓度为1.3 M的氯化胍，浓度为0.8 M的碳酸亚乙酯，浓度为6% (v/v)的乙腈和浓度为0.6% (w/v)的β-辛基-葡糖苷。
46. 实施方案20至34中任一项的释放剂、实施方案36的试剂盒或实施方案41至43中任一项的设备，其中所述释放剂包含
(i) 浓度为约5 M的氯化胍，浓度为约0.5 M的碳酸亚乙酯，浓度为约15% (v/v)的乙腈和浓度为约1.5% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(ii) 浓度为约2 M的氯化胍，浓度为约0.5 M的碳酸亚乙酯，浓度为约15% (v/v)的乙腈和浓度为约1.5% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(iii) 浓度为约6 M的氯化胍，浓度为约0.6 M的碳酸亚乙酯，浓度为约18% (v/v)的乙腈和浓度为约1.8% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；或
(iv) 浓度为约4 M的氯化胍，浓度为约2.4 M的碳酸亚乙酯，浓度为约18% (v/v)的乙腈和浓度为约1.8% (w/v)的β-辛基-葡糖苷。
47. 实施方案20至34中任一项的释放剂、实施方案36的试剂盒或实施方案41至43中任一项的设备，其中所述释放剂包含
(i) 浓度为5 M的氯化胍，浓度为0.5 M的碳酸亚乙酯，浓度为15% (v/v)的乙腈和浓度为1.5% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(ii) 浓度为2 M的氯化胍，浓度为0.5 M的碳酸亚乙酯，浓度为15% (v/v)的乙腈和浓度为1.5% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；
(iii) 浓度为6 M的氯化胍，浓度为0.6 M的碳酸亚乙酯，浓度为18% (v/v)的乙腈和浓度为1.8% (w/v)的β-辛基-葡糖苷；或
(iv) 浓度为4 M的氯化胍，浓度为2.4 M的碳酸亚乙酯，浓度为18% (v/v)的乙腈和浓度为1.8% (w/v)的β-辛基-葡糖苷。
本说明书中引用的所有参考文献就其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容而言在此通过引用并入。
在附图中：
图1：用a)未预处理(PT)和b)用F作为预处理(PT)试剂的富集珠粒制备并掺入0.7ng/mL睾酮(Testo)的人血清样品的快速LC-MS色谱图。两种样品a)和b)均一式三份测量。
+ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@25.0 (292.2000 → 99.8000)testo lgc0001.d;
X-轴：采集时间(秒)；Y-轴：计数 x 102
图2：a)未预处理和b)用F4预处理的通过富集珠粒工作流程纯化的以64 ng/mL掺入无分析物的人全血的环孢菌素(CSA)的LC-MS分析。
环孢菌素D6 IS: +ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@30.0(1225.8500 → 1208.8500) cyclo lgc0002.d；
环孢菌素：+ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@30.0 (1219.8500→ 1202.8500) cyclo lgc0002.d；
环孢菌素限定符1：+ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@61.0(1208.8800 → 224.1000) cyclo lgc0002.d；
环孢菌素限定符2：+ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@33.0(1202.8500 → 1184.8000) cyclo lgc0002.d；
X-轴：采集时间(秒)；Y-轴：计数 x 102
图3. a)未预处理和b)用F4预处理的通过富集珠粒工作流程纯化的以250 pg/mL掺入无分析物的人血清的睾酮(Testo)的LCMS分析。
a) +ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@25.0 (289.2200 →96.8000) 样品16.d；
b) +ESI MRM Frag=380.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@25.0 (289.2200 →96.8000) 样品4.d；
X-轴：采集时间(秒)；Y-轴：计数 x 102
以下实施例应当仅举例说明本发明。它们无论如何不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：方法
样品：
维生素D (VitD)的样品：人EDTA血浆，具有0和140或700 ng/mL VitD。
睾酮(Testo)的样品：人EDTA血浆，0和15 ng/mL Testo。
环孢菌素(CSA)的样品：人EDTA全血，具有0和2000 ng/mL CSA。
依维莫司(Eve)的样品：人EDTA全血，以及0和30 ng/mL Eve。
内部标准品(IS)：
10µL IS/100µL样品，溶解于人血清或EDTA血浆中，所述人血清或EDTA血浆具有465 ng/mL VitD (25-羟基维生素D3，d6)，50 ng/mL Testo(睾酮，3x C13)，6600 ng/mLCSA(环孢菌素，d4和3x C13)，100 ng/mL Eve(依维莫司，d4和3x C13)。
样品预处理的程序：
Eppendorf杯用作预处理(PT)容器。将100μL样品(参见上文)与10μL内部标准品(参见上文)混合，在室温(RT)下涡旋10秒，且然后在37℃下在振荡器(1400rpm)上孵育5分钟。然后将所示体积的PT试剂添加至样品中，在室温下涡旋10秒，且然后在37℃下在振荡器(1400rpm)上孵育定义的时间。最后，关于蛋白沉淀、溶血和分析物释放评价预处理的样品，如下所述。
关于溶血和沉淀事件的完全性检查预处理样品：
进行关于蛋白沉淀和全血溶血的PT试剂的定性评价。分别分析蛋白沉淀和溶血。对于蛋白沉淀实验，EDTA血浆用作样品基质。在进行预处理后，将预处理的样品在室温下离心(20000g) 20分钟。通过视觉分析将制剂分类为合适的或不合适的。如果在杯的底部观察到沉淀，则将制剂分类为不合适。对于溶血评价，使用全血(EDTA)作为样品基质。在进行预处理后，将预处理的样品填充至微量血细胞比容毛细管中并在室温下离心(13000rpm) 30分钟。当离心后仍然观察到红血细胞时，该制剂被分类为不适合溶血。在用特定制剂无法获得溶血或观察到沉淀的情况下，不进行关于分析物释放程度的进一步评价。
关于分析物释放的完全性检查预处理样品-直接Elecsys方法：
在预处理样品后，分析物释放的定量在Elecsys 2010分析仪上用商业Elecsys测定(CSA、依维莫司、睾酮、总维生素D)通过自己的省略Elecsys预处理步骤的方案(经由离线沉淀的CSA和依维莫司，经由在线变性的总维生素D，经由R1竞争剂的睾酮)进行。作为0或100%分析物释放的对照，测量含有游离分析物(具有0和700 ng/mL VitD的30% v/v乙腈/水；具有0和15 ng/mL Testo的1%辛基-β-D-吡喃葡糖苷水溶液；具有0和2000 ng/mL CSA的100mM ZnSO4/甲醇:乙二醇90:10；和0和30 ng/mL Eve)的样品的回收率。由于来自预处理样品的强基质效应引起Elecsys测定中的问题(例如降低信号动态，再现性的恶化和/或测量室的污染)，需要实施一些对策。开发并使用具有减少的预处理样品(PT-S)体积和增加的试剂体积的新的Elecsys方案。在一些情况下，基质效应仍然干扰信号，因此在测量前稀释PT-S。Elecsys测量一式三份进行。另外，定期清洁测量室。由于改变的Elecsys方法的不精确性，当显示回收率>90%时，制剂已经被分类为生成“完全分析物释放”，并且当显示回收率80-90%时，制剂被分类为可接受的。良好的制剂显示所有3种特征：完全的分析物释放，完全的溶血，和无沉淀。
关于分析物释放的完全性检查预处理样品-LLE(液-液萃取)方法：
在预处理样品后，将PT-S提交给LLE，以便用Elecsys测定降低最终分析物定量步骤的基质效应。将650μL有机溶剂添加至PT-S中(对于VitD、Testo和CSA，正己烷；对于Eve，乙酸乙酯)并在室温(RT)下温和混合3分钟。在短暂离心(以21000g，40 s，RT)后，将500μL上清液有机相转移到至Eppendorf管中并在30℃下在speedvac中蒸发至干燥。溶解干燥的提取物。CSA和Eve在300μL的Elecsys ISD预处理试剂中，用0.9% NaCl溶液1:2稀释；VitD在100μL 50% v/v乙腈/水中，随后将其80µL用180μL耗尽VitD的人血清稀释。将Testo溶解于30% v/v乙腈/水中，随后将其50µL用200μL不含类固醇的人血清稀释。最后，用原始测定方案在Elecsys上测量溶液。作为100%分析物释放的对照，样品也用良好工作的PT试剂平行处理，如用上面提及的直接Elecsys方法测定，并用LLE方法类似地处理，且最后在Elecsys上通过使用原始测定方案进行定量。由于该方法的不精确性，当显示回收率>90%时，制剂已经被分类为生成“完全分析物释放”，并且当显示回收率80-90%时，制剂被分类为可接受的。良好的制剂显示所有3种特征：完全的分析物释放，完全的溶血，和无沉淀。
实施例2：分析物释放
根据上述方法评价并且产生完全的分析物释放和溶血而不形成沉淀物的第一制剂“F”由以下组成：
5M盐酸胍(Gua)，0.5M碳酸亚乙酯(EtC)，15% ACN，1.5%辛基-β-D-吡喃葡糖苷(OßDG)，pH6.5±0.3，200μL体积/100μL样品，在37℃下15min孵育时间(表1)。
表1：F制剂，200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间
VitD Testo CSA Eve
分析物释放 > 90% > 90% > 90% > 90%
完全溶血 n.a. n.a. 是 是
无沉淀 是 是 是 是
可以显示，所述试剂可以通过来自相同类别的替代试剂进行交换而不影响功能，并且还产生完全的分析物释放和溶血而不形成沉淀物。还通过使用200μL PT试剂/100μL样品和在37℃下15min孵育时间来测试变体(表2)。
· F-V1: 5M尿素, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V2: 5M Gua, 0.5M碳酸亚丙酯, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V3: 5M Gua, 0.5M甘油-1,2-碳酸酯, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V4: 5M Gua, 0.5M EtC, 15%正丙醇, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
表3：F的变体，200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间
。
将F的单一组分向下滴定以显示它们对预处理的影响。还通过使用200μL PT试剂/100μL样品和在37℃下15min孵育时间来测试变体(表3)。
· F-V5: 2.5M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V6: 1.25M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V7: 0.63M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V8: 0M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V9: 5M Gua, 0.25M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V10: 5M Gua, 0.13M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V11: 5M Gua, 0M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V12: 5M Gua, 0.5M EtC, 30% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V13: 5M Gua, 0.5M EtC, 20% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V14: 5M Gua, 0.5M EtC, 10% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V15: 5M Gua, 0.5M EtC, 5% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
· F-V16: 5M Gua, 0.5M EtC, 0% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3。
表3a：F的变体，200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间
(AR：分析物释放，NPr：无蛋白沉淀；Hem：完全溶血)
。
实施例3：珠粒富集干扰
制剂F显示基于珠粒富集的LC-MS/MS分析中Testo和CSA的干扰，即通过离子抑制损失信号强度：在优化珠粒富集工作流程期间，使用实验的设计研究样品的预处理的条件。该研究的读出方法是多重HPLC方法，其具有长色谱步骤(7.5分钟)和质谱检测。选择试剂F作为预处理试剂，并且工作流程条件如下：
对于血清(睾酮/25-OH维生素D3)：100 µL血清 + 100 µL PT-F; 50 µL珠粒，在0.1%甲酸铵中(25 mg/mL)；洗涤：2x，用ACN/H2O 5:95 + 5 mM NH4OH；洗脱：100 µL ACN +2% FA。
对于全血(环孢菌素/依维莫司)：100 µL样品 + 200 µL PT-F; 50 µL珠粒，在15%ACN中 (25 mg/mL)；洗涤：2x，用ACN/H2O 35:65 + 5 mM NH4OH；
洗脱：100 µL ACN + 2% FA
人样品然后使用这些优化的工作流程制备，并掺入对应于医学决策点的分析物浓度。使用具有快速色谱步骤的分析物特异性LC-MS方法进行分析。实施例(图1)显示用F试剂的预处理步骤对睾酮(Testo)的LC-MS分析的灵敏度的影响。对于环孢菌素(CSA)获得类似的信号降低。当使用F作为预处理时，睾酮的信号强度为仅未预处理获得的分析物信号的近似10%。不希望受理论束缚，这种效果最可能是由于富集工作流程中的洗涤程序不足以在预处理步骤后除去所有痕量的试剂这一事实。通过工作流程直到洗脱步骤留下的残余胍盐可能是导致灵敏度损失的强烈离子抑制效果的原因。
具有较少盐酸胍的制剂，F4，F6：
含有较少盐酸胍的两种另外制剂F4和F6根据上述方法评价，并且由以下组成：
· F4: 2M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3, 200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间
· F6: 0.5M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3, 200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间。
结果显示于表4中。比所述15min更短的预处理时间是可以的。对于F4，检查3 min也工作良好。
表4：F4和F6，200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间
。
这些制剂在基于珠粒富集的LC-MS/MS分析中不显示干扰。
胍浓度的降低对样品的分析物释放或溶血具有积极影响。使用环孢菌素(CSA)、睾酮(Testo)和维生素D(VitD)评价F4对使用快速色谱法的LC-MS检测的影响。相比于F的较低浓度的胍对于降低离子抑制效果是有利的。图2显示，使用试剂F4预处理后，可以通过快速LC-MS测量环孢菌素，与未预处理的情况下提取的基质相比没有显著的灵敏度损失。还对于睾酮，可以显示当用F4预处理/释放时没有观察到灵敏度损失(参考图3)，与用F观察到的离子抑制相反(参考图1)。
实施例4：试剂稳定性
在加速保质期研究(ASL，18个月保质期时间模型)中，PT试剂在35℃下应激3周，并且在板上稳定性(OBS)研究中，PT试剂在12℃下应激最长达29天。在两项研究中，试剂在2mL微小管(聚丙烯)中进行应激。将应激的ASL和OBS试剂和相应的非应激试剂(T0)储存在-80℃，直至其功能测试。应激和未应激的PT试剂通过在样品预处理工作流程中应用它们来测试(参考上文，100μL样品，10μL IS，在37℃下用200μL PT试剂预处理15 min)，随后用上述Elecsys程序测量分析物的回收率。将应激样品的回收率值与未应激的类似物(T0，100%)进行比较，并且由于改变的Elecsys方法的不精确性，当显示回收率> 90%时，制剂已被分类为稳定的。结果显示于表5中。
表5：F/F4/F6的ASL & OBS中的回收率，200μL体积/100μL样品和在37℃下15min孵育时间(n.a.：不适用，因为无法实现完全溶血)
。
实施例4：预处理试剂体积的减少
根据上述方法关于更快的PT时间和使用较低用于PT的体积来评价含有最高浓度的单一组分的另外的制剂F0(参见表6)。F0由以下组成：6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN,1.8% OßDG, pH6.5±0.3. 测试的时间和体积描绘于表6中；测试的条件无一引起沉淀。然而，在体积低于50μL的情况下，无法实现完全溶血；因此，对于测定分析物释放测试的最小体积为50μL。对于后续实验的基于这些结果的选定条件是：
F0: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3. 50µL体积/100μL样品和在37℃下5min孵育时间。
表6：用F0、100μL样品并在37℃下以可变时间和体积孵育的分析物释放
。
将F0的单一组分向下滴定以显示它们对预处理的影响。还通过使用50µL PT试剂/100μL样品和在37℃下5min孵育时间来测试变体(表7)。
· F0-V1: 4M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V2: 3M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V3: 1M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V4: 0M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V5: 6M Gua, 0.3M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V6: 6M Gua, 0.15M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V7: 6M Gua, 0M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V8: 6M Gua, 0.6M EtC, 9% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V9: 6M Gua, 0.6M EtC, 4.5% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V10: 6M Gua, 0.6M EtC, 0% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V11: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 0.9% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V12: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 0.45% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V13: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 0% OßDG, pH6.5±0.3。
表7：F0的变体，50µL体积/100μL样品和在37℃下5min孵育时间
(AR：分析物释放，NPr：无蛋白沉淀；Hem：完全溶血)
。
评价其他pH值对F0和其他温度对用F0预处理的影响。还通过使用50µL PT试剂/100μL样品和5min孵育时间来测试变体(表8)。60℃导致小瓶边缘的沉淀和结壳(crustification)。
· F0-V14: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH5.0. PT于37℃。
· F0-V15: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH8.0. PT于37℃。
· F0-V16: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3. PT于6℃。
· F0-V17: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3. PT于22℃。
· F0-V18: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3. PT于50℃。
· F0-V19: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3. PT于60℃。
表 8：F0的变体，50µL体积/100μL样品和在37℃下5min孵育时间
(AR：分析物释放，NPr：无蛋白沉淀；Hem：完全溶血)
。
用F0变体F0-V7，发现不需要碳酸亚乙酯来实现完全的分析物释放。在下一步骤中，检查碳酸亚乙酯是否有助于减少F0中所需的盐酸胍的量，因此可以使其对LC-MS/MS分析的干扰(例如离子抑制)最小化。由于VitD是在分析物释放方面最难的情况，所以这些实验仅用VitD进行。最后，用工作变体(F0-29)测试其他分析物。通过使用50µL PT试剂/100μL样品和5min孵育时间来测试变体(表9)；仅对于2种变体(V26，V-27)，测试的孵育时间为15min。
· F0-V20: 2M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V21: 2M Gua, 1.2M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V22: 2M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V23: 3M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V24: 3M Gua, 1.2M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V25: 3M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V26: 2M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。15 min。
· F0-V27: 3M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。15 min。
· F0-V28: 4M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
· F0-V29: 4M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3。
表9：F0的变体，50µL体积/100μL样品和在37℃下5min孵育时间
(AR：分析物释放，NPr：无蛋白沉淀；Hem：完全溶血)
。
从用上述变体F-V11和F0-V7的实验也将理解，包括提供碳酸氢根离子的试剂允许使离液剂的浓度降低近似2倍。
此外，通过采取来自F0的仅一种组分以及含有增溶剂ACN或OβDG的双组分变体来评价简约制剂。通过使用50µL PT试剂/100μL样品和5min孵育时间来测试变体(表10)。
· F0-V30: 6M Gua
· F0-V31: 0.6M EtC
· F0-V32: 18% ACN
· F0-V33: 1.8% OßDG
· F0-V34: 6M Gua, 1.8% OßDG
· F0-V35: 6M Gua, 18% ACN
· F0-V36: 0.6M EtC, 1.8% OßDG
· F0-V37: 0.6M EtC, 18% CAN。
表10：F0的变体，50µL体积/100μL样品和在37℃下5min孵育时间
(AR：分析物释放，NPr：无蛋白沉淀；Hem：完全溶血)
。
实施例5：珠粒工作流程
在珠粒-富集工作流程中检查制剂F、F4和F0。将100μL样品(掺入VitD、Testo、CSA和Eve的血清)在室温下平衡15分钟。然后将PT试剂(F和F4：200μL；F0：50μL)添加至样品中并在37℃下孵育(F和F4：15 min；F0 5 min)。添加50μL珠粒悬浮液(~2.5mg珠粒)并在室温下平衡5分钟后，进行磁性分离。实施两个洗涤步骤，其各自含有200μL水溶液，随后为用100μL乙腈(ACN)/2%甲酸水溶液(FA) 70/30或乙腈/2%甲酸98/2的洗脱步骤。磁性分离后，将80μL上清液与5μL IS(在50%甲醇/水中)混合，其中注入5μL，并通过LC-MS/MS定量。对于该研究，在最后一步添加IS，以测定工作流程后的总分析物产率。在珠粒-富集工作流程中发现的分析物回收率取决于几个参数，如用于分析物捕获所用的珠粒类型(经由大小排阻的固相提取、反相和/或离子交换)和珠粒缓冲液组成、洗涤条件、珠粒洗脱溶剂、预处理试剂制剂和体积、预处理时间。LC-MS/MS条件：来自Phenomenex的柱，F5 (2.6μm颗粒，150x2.1mm)；40℃柱温；具有溶剂A (2mM乙酸铵，0.1%甲酸/水)和溶剂B (2mM乙酸铵，0.1%甲酸/95%ACN加5%水)的梯度(参见表11)；具有多反应监测的MS/MS。
表11：LC梯度
时间(min) 流速(µL/min) A (%) B (%)
0.0 400 97 3
1.5 400 95 5
1.8 400 50 50
4.8 400 0 100
6.3 400 0 100
6.4 400 97 3
7.5 400 97 3
对于PT试剂F、F4和F0与不同珠粒类型和不同珠粒缓冲液的组合获得的结果概述于表13中。获得良好或可接受的产率，特别是F4和F0与通过ACN/2% FA 98/2的分析物洗脱的组合。
表12：富集-珠粒工作流程和LC-MS/MS定量中的分析物回收率
。
实施例6：通用制剂
发现几种PT试剂对于完全的分析物释放和溶血(在ISD的情况下)是通用的，并且显示无沉淀(参见表13)。该制剂是稳定的且即用于1-步骤PT工艺，并且与珠粒-富集工作流程相容。为了降低LC-MS/MS干扰(诸如离子抑制)的可能性并同时减少PT所需的试剂体积，开发制剂F0-V29。
表13：通用PT制剂
PT试剂 PT体积 PT时间 样品体积 PT温度
F: 5M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3 200 µL 15 min 100 µL 37℃
F-V11: 5M Gua, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3 200 µL 15 min 100 µL 37℃
F4: 2M Gua, 0.5M EtC, 15% ACN, 1.5% OßDG, pH6.5±0.3 200 µL 3或15 min 100 µL 37℃
F0: 6M Gua, 0.6M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3 50 µL 5 min 100 µL 37℃
F0-V7: 6M Gua, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3 50 µL 5 min 100 µL 37℃
F0-V29: 4M Gua, 2.4M EtC, 18% ACN, 1.8% OßDG, pH6.5±0.3 50 µL 5 min 100 µL 37℃

Claims (29)

1.用于从样品释放分析物的体外方法，其包括使所述样品与(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂接触，
(1)其中所述离液剂的浓度为1M至4M；
其中所述有机溶剂的浓度为2％(v/v)至20％(v/v)；
其中所述去污剂的浓度为0.2％(w/v)至20％(w/v)；和/或
其中由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1M至2M，
(2)其中所述离液剂是盐酸胍和/或尿素；
其中所述有机溶剂是乙腈；
其中所述去污剂是烷基-糖苷；和
其中所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂包含环状碳酸酯，
(3)其中所述样品是体液样品、分离细胞的样品、来自组织或器官的样品或从外体表面或内体表面获得的洗涤/冲洗液的样品，和
(4)其中所述分析物包含类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素中的至少一种；其中所述类固醇激素是雄激素、雌激素和孕激素中的至少一种；
其中所述寡肽是环状寡肽抗生素；
其中所述聚酮化合物是大环内酯；和/或
其中所述维生素是维生素D。
2.权利要求1的方法，其中所述去污剂是β-D-辛基-葡糖苷。
3.权利要求1或2的方法，其中所述样品是体液样品。
4.权利要求3的方法，其中所述样品是血液、血浆或血清样品。
5.权利要求1至2和4中任一项的方法，其中所述大环内酯是他克莫司、西罗莫司或依维莫司。
6.权利要求1的方法，其中所述类固醇激素是睾酮。
7.权利要求1的方法，其中所述寡肽是环孢菌素。
8.权利要求1的方法，其中所述聚酮化合物是依维莫司。
9.权利要求1的方法，其中所述维生素是维生素D3。
10.权利要求9的方法，其中所述维生素是25-羟基-维生素D3。
11.权利要求1的方法，其中所述分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的至少一种。
12.权利要求11的方法，其中所述分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的至少两种。
13.权利要求12的方法，其中所述分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的至少三种。
14.权利要求13的方法，其中所述分析物包含睾酮、环孢菌素、依维莫司和25-羟基-维生素D3中的全部。
15.用于从样品释放分析物的释放剂，其包含
(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂，
(1)其中所述释放剂是三倍浓缩的溶液，且
其中所述离液剂的浓度为2M至饱和；
其中所述有机溶剂的浓度为2％(v/v)至30％(v/v)；
其中所述去污剂的浓度为0.5％(w/v)至20％(w/v)；
其中由所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂形式上提供的碳酸氢根离子的浓度为0.1M至6M，
(2)其中所述离液剂是盐酸胍和/或尿素；
其中所述有机溶剂是乙腈；
其中所述去污剂是烷基-糖苷；和
其中所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂包含环状碳酸酯，
(3)其中所述样品是体液样品、分离细胞的样品、来自组织或器官的样品或从外体表面或内体表面获得的洗涤/冲洗液的样品，和
(4)其中所述分析物包含类固醇激素、寡肽、聚酮化合物和维生素中的至少一种；其中所述类固醇激素是雄激素、雌激素和孕激素中的至少一种；
其中所述寡肽是环状寡肽抗生素；
其中所述聚酮化合物是大环内酯；和/或
其中所述维生素是维生素D。
16.权利要求15的释放剂，其中所述去污剂是β-D-辛基-葡糖苷。
17.权利要求15至16中任一项的释放剂，其中所述至少一种提供碳酸氢根离子的试剂是碳酸亚乙酯。
18.(I)包含(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂的组合物释放剂和/或(II)根据权利要求1至14中任一项的方法用于从样品释放至少一种分析物的用途，其中所述组合物是根据权利要求15至17中任一项的释放剂。
19.试剂盒，其包含在壳体中包含的(i)离液剂、(ii)有机溶剂、(iii)去污剂和(iv)至少一种提供碳酸氢根离子的试剂，所述试剂盒包含根据权利要求15至17中任一项的释放剂。
20.权利要求19的试剂盒，其进一步包含用于至少一种分析物的至少一种检测剂。
21.用于测定样品中的至少一种分析物的方法，其包括
(a)根据权利要求1至14中任一项的方法释放所述分析物以生成提取物；
(b)测定所述提取物中的所述释放的分析物；和，由此
(c)测定样品中的所述分析物。
22.权利要求21的方法，其中所述方法是用于测定多种分析物的方法。
23.权利要求22的方法，其中所述多种分析物是至少两种。
24.权利要求23的方法，其中所述多种分析物是至少四种。
25.权利要求24的方法，其中所述多种分析物是至少十种。
26.权利要求25的方法，其中所述多种分析物是至少25种。
27.权利要求26的方法，其中所述多种分析物是至少50种。
28.用于测定样品中的分析物的设备，其包括根据权利要求15至17中任一项的释放剂。
29.权利要求28的设备，其中所述设备进一步包括适于测定至少一种分析物的分析单元和/或适于计算所述样品中的所述分析物的量和/或浓度的评估单元。
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