CN110849694B - 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用 - Google Patents

一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110849694B
CN110849694B CN201911213516.3A CN201911213516A CN110849694B CN 110849694 B CN110849694 B CN 110849694B CN 201911213516 A CN201911213516 A CN 201911213516A CN 110849694 B CN110849694 B CN 110849694B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tacrolimus
whole blood
pretreatment liquid
blood sample
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911213516.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110849694A (zh
Inventor
周建平
周裕军
许秀丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Diagreat Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Diagreat Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Diagreat Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Diagreat Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911213516.3A priority Critical patent/CN110849694B/zh
Publication of CN110849694A publication Critical patent/CN110849694A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110849694B publication Critical patent/CN110849694B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明提供了一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用，属于免疫抑制剂治疗药物浓度检测领域，所述他克莫司全血样本的前处理液，包括缓冲液、蛋白沉淀剂和表面活性剂；所述缓冲液选自Tris、磷酸盐、HEPES、柠檬酸和MES缓冲液中的一种或两种；所述蛋白沉淀剂选自甲醇、磺基水杨酸和三氯乙酸中的一种或两种；所述表面活性剂选自SDS、吐温20、曲拉通x100和Brij‑35中的一种或两种。本发明所述他克莫司全血样本前处理液所需样本量少，操作简单，兼容性好，对抗体和酶活性影响小、能够快速、温和的对他克莫司全血样本进行前处理，处理后的样本上清液能够直接应用于他克莫司的免疫学检测。

Description

一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用
技术领域
本发明属于免疫抑制剂治疗药物浓度检测领域，尤其涉及一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus，FK506，商品名普乐可复)是中性、疏水性大环内酯类新型免疫抑制剂，系日本藤泽(Fujisaw a)制药公司于1984年首次从链霉菌肉汤培养基中分离得到。它与内源性细胞内受体(胞浆结合蛋白FKBP12)结合，形成一个亲免素复合物，有效地抑制T细胞激活，抑制白细胞介素-2(IL-2)的产生。作用机理和体内外免疫抑制作用与环孢素相似，但免疫抑制作用比环孢素强。他克莫司能有效防止器官排斥反应，并能逆转对环孢素无效的排斥反应。临床实验表明他克莫司对多种器官移植及免疫系统疾病有很好的疗效，已被广泛用于肝、肾、心、肺、胰等器官的移植。
他克莫司的药代动力学研究表明，其在器官移植的患者个体间和个体内的药代动力学存在很大的差异，过高的药物浓度会导致严重的肾毒性。因此为使他克莫司产生最佳的免疫抑制作用，减小毒副作用，对器官移植后接受他克莫司治疗的病人进行药物监测及药物动力学研究是很有意义的。此外，药代动力学研究显示，全血比血浆更适合用于反映他克莫司的药物动力学特征。
目前，国内外监测他克莫司药物浓度的方法主要有以下几种：微粒子化学发光法(雅培)，均相酶免法(西门子)，质谱法。人体内，与他克莫司结合的蛋白，主要是白蛋白和α1-酸性糖蛋白，且他克莫司与红细胞高度结合。因此，这些检测方法都需要进行样本的前处理。其中质谱法的前处理，往往采用高浓度的有机溶剂，如甲醇，乙腈等，配合高浓度的硫酸锌去沉淀全血蛋白，但是该前处理液因含有大量有机溶剂和高浓度硫酸锌，会严重损伤抗体和酶的活性，因此不能适用于他克莫司免疫测定试剂。雅培的微粒子化学发光法采用甲醇和硫酸锌的混合液沉淀蛋白，再用EDTA中和多远的硫酸锌，西门子采用甲醇和硫酸铜沉淀蛋白，再用EDTA中和，均需要多步处理，且处理后不能完全中和的金属离子对抗体和酶依然存在一定的活性损伤。因此，急需一种简单快速、兼容免疫检测试剂的他克莫司样本前处理方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用；所述他克莫司全血样本前处理液所需样本量少，操作简单，兼容性好，对抗体和酶活性影响小、能够快速、温和的对他克莫司全血样本进行前处理，处理后的样本上清液能够直接应用于他克莫司的免疫学检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种他克莫司全血样本的前处理液，包括缓冲液、蛋白沉淀剂和表面活性剂；
所述缓冲液选自Tris、磷酸盐、HEPES、柠檬酸和MES缓冲液中的一种或两种；
所述蛋白沉淀剂选自甲醇、磺基水杨酸和三氯乙酸中的一种或两种；
所述表面活性剂选自SDS、吐温20、曲拉通x100和Brij-35中的一种或两种。
优选的，所述缓冲液为Tris，所述Tris在前处理液中的浓度为10～100mM。
优选的，所述蛋白沉淀剂为5-磺基水杨酸和甲醇；所述5-磺基水杨酸在前处理液中的浓度为1wt％～5wt％；所述甲醇在前处理液中的体积浓度为10％～60％。
优选的，所述表面活性剂为SDS和Brij-35，所述SDS的浓度为0.05wt％～0.5wt％，Brij-35的浓度为0.1wt％～1wt％。
优选的，所述前处理液的pH值为6～8。
本发明提供了所述的前处理液的使用方法，包括以下步骤：
将所述前处理液与他克莫司全血样本混合、涡旋振荡、固液分离，收集液相组分为处理后的样本上清液。
优选的，所述前处理液与他克莫司全血样本的体积比为1:(0.8～1.2)；所述他克莫司全血样本的体积为100～300μL。
优选的，所述固液分离的方法为离心，所述离心的转速为10000～14000rpm，所述离心的时间为5～15min。
本发明提供了所述的前处理液在他克莫司全血样本免疫学检测中的应用。
优选的，所述免疫学检测方法包括放射免疫法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法、侧向层析法和免疫比浊法。
本发明的有益效果：本发明提供的他克莫司全血样本的前处理液，包括缓冲液、蛋白沉淀剂和表面活性剂；使用方法简单，将所述前处理液与全血样本混合作用即可获取的处理后的样本上清液；处理后的样本上清液能够直接应用于他克莫司的免疫学检测；采用本发明所述的前处理液，无需中和即可配套多种他克莫司免疫检测试剂，所需样本量少，操作简单，兼容性好，对抗体和酶活性影响小，因此通过配套他克莫司免疫检测试剂可以满足临床对他克莫司药物浓度监测的快速、准确、高通量、低成本的迫切需求。
进一步的，本发明将Tris、甲醇、5-磺基水杨酸、SDS、Brij-35按照限定的浓度组合形成的前处理液，能够高效、快速的提取全血样本中结合态的他克莫司，所述前处理液在中性条件下进行反应，对后续免疫检测影响小。
附图说明
图1为他克莫司荧光免疫层析试剂测定同高效液相-质谱相关性分析图；
图2为他克莫司磁微粒化学发光试剂测定同高效液相-质谱相关性分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种他克莫司全血样本的前处理液，包括缓冲液、蛋白沉淀剂和表面活性剂；所述缓冲液选自Tris、磷酸盐、HEPES、柠檬酸和MES缓冲液中的一种或两种；所述蛋白沉淀剂选自甲醇、磺基水杨酸和三氯乙酸中的一种或两种；所述表面活性剂选自SDS、吐温20、曲拉通x100和Brij-35中的一种或两种。
在本发明中，所述缓冲液优选为Tris，所述Tris在前处理液中的浓度优选为10～100mM，更优选为40～60mM，最优选为50mM。在本发明中，所述缓冲液的作用是提供一种缓冲环境。
在本发明中，所述蛋白沉淀剂优选为5-磺基水杨酸和甲醇；所述5-磺基水杨酸在前处理液中的浓度优选为1wt％～5wt％，更优选为3wt％～4.5wt％，最优选为4wt％。在本发明中，所述甲醇在前处理液中的体积浓度优选为10％～60％，更优选为30％～50％，最优选为40％。在本发明中，所述蛋白沉淀剂的作用是将血浆蛋白沉淀下来，并释放出游离的他克莫司分子，将所述5-磺基水杨酸和甲醇的浓度限定在上述范围内，能够有效的沉淀血浆中的蛋白，并增加他克莫司分子的溶解性，并且在沉淀蛋白后的甲醇和5-磺基水杨酸的浓度对下游的抗体酶活性无显著影响。
在本发明中，所述表面活性剂优选为SDS和Brij-35，所述SDS的浓度优选为0.05wt％～0.5wt％，更优选为0.08％～0.12％，最优选为0.1％；在本发明中，所述Brij-35的浓度优选为0.1wt％～1wt％，更优选为0.4wt％～0.6wt％，最优选为0.5wt％。在本发明中，所述表面活性剂的作用是裂解红细胞并提高他克莫司的溶解度；所述SDS和Brij-35的浓度限定在上述范围内，能够快速的裂解红细胞，提高他克莫司的释放和溶解。
在本发明中，所述前处理液的pH值优选为6～8，更优选为6.5～7.5，最优选为7.0。在本发明中，所述前处理液为中性溶液，在中性条件下对他克莫司全血样本进行处理，对后续免疫检测影响小，检测结果更准确。
本发明提供了所述的前处理液的使用方法，包括以下步骤：将所述前处理液与他克莫司全血样本混合、涡旋振荡、固液分离，收集液相组分为处理后的样本上清液。
在本发明中，将所述前处理液与他克莫司全血样本混合；所述前处理液与他克莫司全血样本的体积比优选为1:(0.8～1.2)，更优选为1:1。在本发明中，所述他克莫司全血样本的体积优选为为100～300μL，更优选为150～250μL，最优选为200μL。
在本发明中，所述涡旋振荡的时间优选为5～30s，更优选为10～20s。本发明对所述涡旋振荡的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的涡旋振荡器进行；所述涡旋振荡的目的是将所述前处理液与他克莫司全血样本充分混匀。
在本发明中，所述固液分离的方法优选的为离心，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。本发明在所述离心后，收集液相组分为处理后的样本上清液；所述处理后的样本上清液能够直接进行他克莫司免疫学检测。
本发明提供了所述的前处理液在他克莫司全血样本免疫学检测中的应用。在本发明中，按照上述使用方法用所述前处理液处理他克莫司全血样本后，对所述处理后的样本上清液进行免疫检测。在本发明中，所述免疫学检测方法优选的包括放射免疫法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法、侧向层析法和免疫比浊法。本发明对上述免疫学检测方法的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的操作步骤即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
他克莫司全血样本前处理液的制备
他克莫司全血样本前处理液的配置按照下表1所示(以水为溶剂)，配置完成后，常温放置即可。
表1他克莫司全血样本前处理液的组成
组分名称 配比含量/浓度
Tris缓冲液 50mM
甲醇(v/v) 40％
5-磺基水杨酸(w/v) 4％
SDS(w/v) 0.1％
Brij-35(w/v) 0.5％
实施例2
他克莫司全血样本前处理液的制备
他克莫司全血样本前处理液的配置按照下表2所示，配置完成后，常温放置即可。
表2他克莫司全血样本前处理液的组成
组分名称 配比含量/浓度
Tris缓冲液 50mM
甲醇(v/v) 50％
5-磺基水杨酸(w/v) 3％
SDS(w/v) 0.1％
Brij-35(w/v) 0.5％
实施例3
他克莫司全血样本前处理液的制备
他克莫司全血样本前处理液的配置按照下表3所示，配置完成后，常温放置即可。
表3他克莫司全血样本前处理液的组成
组分名称 配比含量/浓度
Tris缓冲液 50mM
甲醇(v/v) 50％
5-磺基水杨酸(w/v) 3％
SDS(w/v) 0.3％
Brij-35(w/v) 0.7％
实施例4
他克莫司全血前处理液应用于他克莫司荧光免疫层析试剂
采用实施例1中的他克莫司全血前处理液进行样本前处理，并配套荧光免疫层析试剂进行他克莫司浓度的测定，结果同液相-质谱法进行相关性对比。
具体实施步骤如下：
1、他克莫司荧光免疫层析试纸条的制备：
(1)活化：取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于400μL活化缓冲液中(50mM MES pH6.0)，加入0.5mg EDC和0.5mgNHS，混匀后室温震荡活化15min；
(2)偶联：将(1)所述混悬液于4℃10000rpm离心10min后弃上清，重悬于活化缓冲液中，加入2μg抗他克莫司单克隆抗体溶液，混匀后室温震荡偶联30min；
(3)封闭：将(2)所述混悬液加入10％的酪蛋白溶液100μL，混匀后室温震荡封闭过夜；
(4)贮存：将(3)所述混悬液于4℃10000rpm离心10min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中(0.01％NaN3、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
(5)玻璃纤维垫的制备：将贮存的荧光微球标记的他克莫司单克隆抗体以贮存缓冲液稀释后，用金标点膜喷金仪喷金，37℃干燥15h，取出密封保存。
(6)硝酸纤维素(NC)膜的制备：用0.05mol/L、pH 7.2的PB缓冲液将他克莫司半抗原-OVA偶联物稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.2μL/cm；用0.05mol/L、pH7.2的PB缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(C)，喷膜量为1.2μL/cm；37℃干燥5h，备用。
(7)样品吸收垫的制备：将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、1％吐温-20、pH 7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h，备用。
(8)试纸条的组装：将样品吸收垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与玻璃纤维垫始段相连，玻璃纤维垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。
2、他克莫司样本前处理及测定
(1)准确吸取200μL他克莫司全血样本，加入200μL他克莫司全血样本前处理液，立即涡旋混匀20s。
(2)混合液12000rpm离心10min，小心吸取上清。
(3)吸取80μL(2)中的离心上清加入到上述他克莫司荧光免疫层析试纸条的加样孔中，静置反应15min。
(4)他克莫司荧光免疫层析试纸条插入荧光免疫分析仪中，读取对应的荧光强度值，根据已建立的反应曲线计算出样本中的他克莫司含量。
3、液相-质谱法测定他克莫司样本浓度
将上述2中测定过的他克莫司样本，采用高效液相-质谱法进行测定。人他克莫司全血样品用乙腈沉淀蛋白后，上清液用叔丁基甲醚提取后选用ZORBAX SB C18(2.1×100mm.,3.5cm)色谱柱，以甲醇-10mM乙酸铵溶液(均含0.1％甲酸)为流动相梯度洗脱，采用电喷雾离子化源，正离子方式，多反应监测(MRM)扫描方式进行测定。
4.检测结果的相关性分析
收集临床50例他克莫司人全血样本，分别采用的本发明的他克莫司全血样本前处理液配套荧光免疫层析试纸条和高效液相-质谱法进行检测。采用线性回归方程进行两种测定结果的相关性分析，结果如图1所示：两种方法学相关系数R2＝0.9852，相关性良好，表明本发明提出的他克莫司样本前处理液配套荧光层析试纸条的有效性。
表4荧光免疫层析试纸条和高效液相-质谱法的检测结果对比
Figure BDA0002298824740000081
Figure BDA0002298824740000091
Figure BDA0002298824740000101
实施例5
他克莫司全血前处理液应用于他克莫司磁微粒化学发光试剂
采用实施例1中的他克莫司全血前处理液对实施例4中的人他克莫司全血样本前处理，并配套磁微粒化学发光试剂进行他克莫司浓度的测定，结果同液相-质谱法进行相关性对比。
1、试剂1的制备(磁珠组分)
(1.1)活化：取市售的表面含有羧基的磁珠5mg混悬于1000μL活化缓冲液中(15mMMES pH6.5)，加入2mg EDC和2mgNHS，混匀后室温震荡活化60min；
(1.2)偶联：将(1.1)所述混悬液于磁吸后弃上清，重悬于活化缓冲液中，加入10μg抗他克莫司单克隆抗体溶液，混匀后室温震荡偶联120min；
(1.3)封闭：将(1.2)所述混悬液加入10％的酪蛋白溶液100μL，混匀后室温震荡封闭过夜；
(1.4)贮存：将(1.3)所述混悬液于磁吸后弃上清，重悬于贮存缓冲液中(0.01％NaN3、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此法洗涤磁珠3次，稀释到磁珠浓度到0.2mg/mL 4℃保存，作为试剂1组分。
2、试剂2的制备(他克莫司-碱性磷酸酶偶联物组分)
(2.1)取2mg他克莫司羧基衍生物溶于1mL二甲基亚砜，加入1mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应15min。
(2.2)10mg小牛肠碱性磷酸酶溶于2mL PBS，再加入(2.1)中活化的他克莫司，室温震荡反应2h。
(2.3)反应产物，对PBS透析4次，收集。
(2.4)用含0.1％BSA的PBS溶液稀释(2.3)中的透析产物到20μg/mL的浓度，即为试剂2组分。
3、样本稀释液的制备
PBS溶液中加入0.1％的BSA即为样本稀释液。
4、他克莫司样本前处理
(1)准确吸取200μL全血样本，加入200μL他克莫司全血样本前处理液，立即涡旋混匀20s。
(2)混合液12000rpm离心10min，小心吸取上清，即为处理完成的样品。
5、测定方法
测定过程在全自动化学发光仪上进行，测定程序如下：
a.吸取30μL步骤4中制备的前处理后样品，加入50μL步骤3中制备的样本稀释液，再加入50μL步骤1中制备的试剂1(磁珠标记的他克莫司抗体)，混合后反应10min。
b.加入50μL步骤2中制备的试剂2(他克莫司-碱性磷酸酶)，混合反应5min。
c.反应磁珠复合物清洗4次。
d.加入200μL碱性磷酸酶底物，37度孵育5min后，读取光子数。
e.根据已建立的反应曲线，计算对应的样本浓度。
表5磁微粒化学发光和高效液相-质谱法检测结果对比
Figure BDA0002298824740000121
Figure BDA0002298824740000131
Figure BDA0002298824740000141
6、相关性分析
将磁微粒化学发光检测结果同实施例4中的高效液相-质谱法的测定结果采用线性回归方程进行相关性分析，结果如图2所示：两种方法学相关系数R2＝0.981，相关性良好，表明本发明提出的他克莫司样本前处理液配套磁微粒化学发光试剂的有效性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种他克莫司全血样本的前处理液，其特征在于，由缓冲液、蛋白沉淀剂和表面活性剂组成；
所述缓冲液选自Tris、磷酸盐、HEPES、柠檬酸和MES缓冲液中的一种或两种；
所述蛋白沉淀剂为甲醇和5-磺基水杨酸；所述5-磺基水杨酸在前处理液中的浓度为1wt％～5wt％；所述甲醇在前处理液中的体积浓度为10％～60％；
所述表面活性剂为SDS和Brij-35；所述SDS的浓度为0.05wt％～0.5wt％，Brij-35的浓度为0.1wt％～1wt％。
2.根据权利要求1所述的前处理液，其特征在于，所述缓冲液为Tris，所述Tris在前处理液中的浓度为10～100mM。
3.根据权利要求1所述的前处理液，其特征在于，所述前处理液的pH值为6～8。
4.权利要求1～3任意一项所述的前处理液的使用方法，包括以下步骤：
将所述前处理液与他克莫司全血样本混合、涡旋振荡、固液分离，收集液相组分为处理后的样本上清液。
5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述前处理液与他克莫司全血样本的体积比为1:(0.8～1.2)；所述他克莫司全血样本的体积为100～300μL。
6.根据权利要求4或5所述的使用方法，其特征在于，所述固液分离的方法为离心，所述离心的转速为10000～14000rpm，所述离心的时间为5～15min。
7.权利要求1～3任意一项所述的前处理液在他克莫司全血样本免疫学检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测方法包括放射免疫法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法、侧向层析法和免疫比浊法。
CN201911213516.3A 2019-12-02 2019-12-02 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用 Active CN110849694B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911213516.3A CN110849694B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911213516.3A CN110849694B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110849694A CN110849694A (zh) 2020-02-28
CN110849694B true CN110849694B (zh) 2022-03-18

Family

ID=69607063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911213516.3A Active CN110849694B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110849694B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113607525B (zh) * 2021-08-09 2024-06-14 安徽信灵检验医学科技股份有限公司 一种用于血液消解的真空采血管添加剂及其制备方法
CN114964939B (zh) * 2021-12-20 2024-09-13 上海云泽生物科技有限公司 一种药物-蛋白解离组合物、含其的环孢霉素检测试剂盒及应用
CN115236216B (zh) * 2022-06-07 2024-03-01 合肥和合医疗科技有限公司 高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的试剂盒，其制备方法和检测方法
CN118050442B (zh) * 2024-01-25 2024-09-10 杭州颐源医药技术有限公司 用于测定全血中他克莫司浓度的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5635406A (en) * 1995-06-07 1997-06-03 Abbott Laboratories Stabilized standards and calibrators containing rapamycin and tacrolimus bound to anti-rapamycin and anti-tacrolimus antibodies
WO2008082979A2 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Diagnostic test for the detection of a molecule or drug in whole blood
WO2008148547A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Roche Diagnostics Gmbh Detection of an analyte in a sample of hemolyzed whole blood
US7790401B2 (en) * 2007-08-06 2010-09-07 Siemens Healthcare Diagnostics Methods for detection of immunosuppressant drugs
CN101852800B (zh) * 2010-05-18 2012-11-07 同昕生物技术（北京）有限公司 半定量检测人全血中他克莫司药物浓度的胶体金试纸条及检测方法
CN102368054B (zh) * 2011-06-30 2013-07-31 同昕生物技术（北京）有限公司 检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒及其化学发光底物显色液
CN104749009B (zh) * 2015-03-30 2018-05-04 上海云泽生物科技有限公司 用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂
CN104764883A (zh) * 2015-03-31 2015-07-08 上海云泽生物科技有限公司 一种检测环孢霉素a浓度的免疫分析方法和试剂盒
US10948484B2 (en) * 2016-04-11 2021-03-16 Veravas, Inc. Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results
CN110494753B (zh) * 2017-03-28 2023-09-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于分析物测定的通用预处理试剂
CN109187839A (zh) * 2018-10-25 2019-01-11 美康生物科技股份有限公司 准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法
CN109406650A (zh) * 2018-10-25 2019-03-01 美康生物科技股份有限公司 用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110849694A (zh) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110849694B (zh) 一种他克莫司全血样本前处理液及其使用方法和应用
Clark et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): theoretical and practical aspects
Sparbier et al. Selective isolation of glycoproteins and glycopeptides for MALDI-TOF MS detection supported by magnetic particles
US4517303A (en) Specific binding assays utilizing analyte-cytolysin conjugates
EP2232257B1 (en) Stabilization of solid support assay reagents
US6114180A (en) Synthetic calibrators for use in immunoassays, comprising the analytes or partial sequences thereof which are conjugated to inert carrier molecules
CN104204802B (zh) 免疫层析检测方法
JP2858534B2 (ja) 変性タンパク質に対するモノクローナル抗体
EP2574926B1 (en) Chromatographic kit and chromatography method
EP2823304B1 (en) Sandwich assay for immunosuppressant drugs
CZ294954B6 (cs) Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku
CN111246918B (zh) 对称二甲基精氨酸的检测
JP2000514196A (ja) グリコヘモグロビン（％）の定量
EP1898215B1 (en) Method of assaying endocrine substance in specimen
EP3368900B1 (en) Sandwich assay for small molecules
CN110779787B (zh) 一种环孢霉素全血样本的前处理剂及其使用方法
EP3564673B1 (en) L-fabp immunoassay method and assay reagent used in said method
CN111551730A (zh) 荧光微球封闭液及应用该封闭液的试剂盒
US4454226A (en) Enzymatic immunoassay
JP2009522581A (ja) 競合免疫アッセイによるｆｋ７７８の濃度の決定
CN112763703B (zh) 一种免疫磁珠及其制备方法和应用
JPS58211662A (ja) 試験試料中の被検体を測定するための均一系結合分析方法および該方法に用いる試薬系
JP2010101673A (ja) イムノクロマトグラフ法による高感度測定キット
JP3360174B2 (ja) 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬
Driedger et al. Immunoaffinity sample purification and MALDI-TOF MS analysis of α-solanine and α-chaconine in serum

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant