CZ294954B6 - Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku - Google Patents

Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku Download PDF

Info

Publication number
CZ294954B6
CZ294954B6 CZ20002606A CZ20002606A CZ294954B6 CZ 294954 B6 CZ294954 B6 CZ 294954B6 CZ 20002606 A CZ20002606 A CZ 20002606A CZ 20002606 A CZ20002606 A CZ 20002606A CZ 294954 B6 CZ294954 B6 CZ 294954B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
poly
chromatographic
conjugate
polycation
blood sample
Prior art date
Application number
CZ20002606A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20002606A3 (cs
Inventor
Toru Yoshimura
Toshihiro Ogasawara
Michihiro Saito
John P. Groff
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of CZ20002606A3 publication Critical patent/CZ20002606A3/cs
Publication of CZ294954B6 publication Critical patent/CZ294954B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/162—HIV-1, HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, DC4-Binding site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/824—Immunological separation techniques
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/105831—Protein or peptide standard or control [e.g., hemoglobin, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/106664—Blood serum or blood plasma standard or control

Abstract

Chromatografické zkušební zařízení zahrnuje chromatografický nosič, který vymezuje dráhu toku a podporuje kapilární tok, aplikační místo pro krevní vzorek, detekční místo s nedifuzně navázanou zachycující látkou, difuzně navázaný polykationt pro oddělování plazmy nebo séra z krevního vzorku proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu a difuzně navázaný polyaniont pro neutralizaci polykationtu po směru toku vzhledem k navázanému polykationtu. Při způsobu u vzorků plné krve se použije činidlo oddělující červené krvinky, pro agregaci červených krvinek a pro umožnění toku plazmy nebo séra kapilárním účinkem, a neutralizační činidlo pro neutralizování jakýchkoli účinků, které by na zařízení a způsob mohlo mít činidlo oddělující červené krvinky.ŕ

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká chromatografíckých zkušebních zařízení a způsobu detekce analyzované složky ve vzorku plné krve, zejména zařízení a způsobu používajícího činidlo oddělující červené krvinky pro shromáždění červených krvinek, a neutralizační činidlo pro neutralizování jakýchkoliv možných negativních účinků činidla oddělujícího červené krvinky na zkušebním systému.
Dosavadní stav techniky
Moderní klinické diagnostické metody se běžně provádějí na krevních vzorcích. S mnoha diagnostickými stanoveními bohužel interferují červené krvinky. Při zkouškách analyzované složky mohou červené krvinky inhibovat vázání specifických párových členů. Červené krvinky mají také enzymovou aktivitu, která, v závislosti na použité zkoušce, může interferovat s vytvořeným signálem. Dále, při rychlém testu používajícím chromatografícké zkušebních zařízení, zejména chromatografícké zařízení pro imunologické testy, mohou červené krvinky inhibovat tok tekutiny, který je nezbytný pro reakce probíhající v zařízení. Z tohoto i jiných důvodů se mnoho zkušebních metodologií provádí na plazmě nebo na séru, které musí být nejprve odděleny ze vzorku plné krve.
Pro oddělování červených krvinek z plazmy v plném krevním vzorku existuje mnoho známých postupů. Dobře známým způsobem v oboru je centrifugace, kterou se oddělí od plné krve plazma (před srážením) a sérum (po srážení). V tomto postupu se usazují červené krvinky na dno testovací zkumavky a sérum se odděluje dekantací nebo jiným způsobem. Rozvrstvování plné krve centrifugám' má nicméně mnoho nevýhod. Obecně, centrifugace vyžaduje odebrání velkého krevního vzorku. Proces je dále zdlouhavý a vyžaduje nepohodlné laboratorní vybavení, které často v lékařské ordinaci není k dispozici. Zvláštní riziko vystavení choroboplodným zárodkům majícím původ v krvi.
Pro snížení nebo eliminování potřeby centrifugace byla vyvinuta zkušební zařízení, která pro oddělení červených krvinek z kapalné části krve používají gradientní nebo zachycovací membrány. Používají se také znehybněné protilátky proti červeným krvinkám.
Jiné známé postupy pro oddělování Červených krvinek z plazmy nebo séra zahrnují (1) kombinování vzorku plné krve s činidlem vázajícím červené krvinky filtrací směsi skrz pevný savý prvek, na který je vázán alespoň jeden specifický vázající párový člen pro odstranění aglutinovaných červených krvinek, (2) vedení plné krve skrz filtr ze skleněných mikrovláken, ve kterém mize ale nemusí být zabudováno srážecí činidlo, (3) použití bariérové nebo vylučovací vrstvy polysacharidového materiálu pro zamezení průchodu červených krvinek a jejich interference s detekcí nebo vizualizací signálu na suchém testovacím proužku, a (4) použití nosiče, který má polykationtový povrch vázající červené krvinky, ale ne plazmu.
Mnohé z těchto pokusů pro oddělování červených krvinek z plazmy jsou drahé, komplikované, mohou mít za následek neúplné oddělení červených krvinek a mohou způsobit hemolýzu. Hemolýza vede k nespecifickému vázání nebo způsobuje vysoké pozadí zapříčiňující ztrátu citlivosti zkoušky. Toto může být důsledkem volného hemoglobinu, který může zbavit detekční oblast takovým způsobem, že tato oblast může získat barvu v rozmezí od růžové do tmavě kaštanové. V důsledku toho může být vytváření vizuálního chemického signálu zcela nebo částečně znejasněné přítomností hemoglobinového zbarvení v detekční oblasti. Použití oddělovacího
- 1 CZ 294954 B6 činidla, jako je polykationt, má ve zkušebním systému sklon k interferenci se systémem, často agregací jiných činidel nebo vázajících členů než červených krvinek.
Existuje tudíž potřeba zařízení a způsobu detekce analyzované složky v krevním vzorku bez nepříznivého ovlivňování zkušebního systému. Takové zařízení a způsob by měly být vhodné pro vzorky plné krve rozličných velikostí, zahrnujících malé vzorky.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká chromatografického zařízení zahrnujícího chromatografícký nosič, který vymezuje dráhu toku tekutiny schopnou podporování kapilárního toku, aplikační místo pro uvedený krevní vzorek v toku tekutiny umožňujícím styk s chromatografickým nosičem, detekční místo na chromatografíckém nosiči umístěné mimo aplikační místo, difúzně navázanou označenou látku umístěnou po směru toku vzhledem k aplikačnímu místu, difúzně navázané činidlo oddělující červené krvinky pro oddělování plazmy nebo séra z krevního vzorku proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu a difúzně navázané neutralizační činidlo schopné vázat se s oddělujícím činidlem po směru toku vzhledem k navázanému oddělujícímu činidlu a proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu, čímž je neutralizován kladný náboj oddělujícího činidla. Činidlo oddělující červené krvinky je s výhodou umístěno na aplikačním místě, takže červené krvinky budou odděleny od séra nebo plazmy předtím, než sérum nebo plazmaprojde chromatografíckým nosičem.
Předložený vynález je zaměřen také na způsob detekce přítomnosti analyzované složky ve vzorku, s výhodou v krevním vzorku, který zahrnuje poskytnutí chromatografíckého nosiče, který vymezuje dráhu toku tekutiny schopnou podporování kapilárního toku, podél které jsou (a) aplikační místo pro krevní vzorek v toku tekutiny umožňujícím styk s uvedeným chromatografíckým nosičem, (b) detekční místo na chromatografíckém nosiči umístěné mimo aplikační místo, (c) difúzně navázanou označenou látku umístěnou po směru toku vzhledem k aplikačnímu místu, (d) difúzně navázané činidlo oddělující červené krvinky pro oddělování plazmy nebo séra z uvedeného krevního vzorku proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu a (e) difúzně navázané neutralizační činidlo schopné vázat se s oddělujícím činidlem po směru toku vzhledem k navázanému oddělujícímu činidlu a proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu, čímž je neutralizován kladný náboj oddělujícího činidla; uvedení do styku aplikačního místa s krevním vzorkem, tak že činidlo oddělující červené krvinky odděluje plazmu nebo sérum od krevního vzorku a neutralizační činidlo neutralizuje kladný náboj oddělujícího činidla při toku vzorku po dráze toku; a detekce přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje výhodné provedení chromatografíckého zkušebního zařízení podle předkládaného vynálezu.
Předložený vynález je založen na pozorování, že červené krvinky ve vzorcích plné krve interferují se stanovením přítomnosti nebo množství analyzované složky v krevním vzorku, které by jinak mohlo být stanoveno zkušebními systémy. Například při imunologických testech při styku vzorku plné krve s aplikačním místem je nepravděpodobný pohyb po proužku kapilárním účinkem, což je způsobeno brzdicí nebo interferující přítomností červených krvinek. Předložený vynález překonává tento problém bez interference s citlivostí zkušebního systému.
Pro porozumění provedení předloženého vynálezu mohou být užitečné následující definice.
„Analyzovaná složka“ nebo „analyzovaná složka, která je předmětem zájmu“ představuje směs nebo sloučeninu detekovanou nebo měřenou, která má alespoň jeden epitop nebo vazné místo.
-2CZ 294954 B6
Analyzovaná složka může být jakákoli látka, pro kterou existuje přirozeně se vyskytující pro analyzovanou složku specifický vázající člen, nebo pro kterou může být pro analyzovanou složku specifický vázající člen vytvořen. Analyzované složky zahrnují, aniž by na ně byly omezeny, toxiny, organické směsi, proteiny, peptidy, mikroorganismy, aminokyseliny, nukleové kyseliny, hormony, steroidy, vitamíny, léčiva (zahrnující drogy poskytované pro terapeutické účely a také drogy podávané pro nezákonné účely) a metabolity výše uvedených látek nebo jejich protilátky. Termín „analyzovaná složka“ zahrnuje také jakékoli antigenní látky, hapteny, protilátky, makromolekuly a jejich kombinace.
„Chromatografický nosič“ představuje jakýkoli vhodný porézní, absorpční, savý, izotropický nebo kapilární materiál, který zahrnuje detekční místo zařízení, a skrz který se může dostat analyzovaná složka nebo testovací vzorek kapilárním nebo vzlínavým účinkem. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že chromatografický nosič může být vyroben z jednoho nebo i více než jednoho materiálu (např. různé oblasti, části, vrstvy, plochy nebo místa mohou být vyrobeny z různých materiálů), takže pokud jsou vícenásobné vrstvy navzájem ve styku umožňujícím tok tekutiny, umožňují tím průchod testovacího vzorku mezi materiály. Styk umožňující tok tekutiny dovoluje průchod alespoň některých složek vzorku, tj. analyzované složky, mezi oblastmi porézního materiálu, a je s výhodou jednotný podél styčné plochy mezi odlišnými oblastmi. Jako chromatografický nosič mohou být použity materiály přírodní, syntetické nebo v přírodě se vyskytující synteticky modifikované materiály, které zahrnují, aniž by na ně byly omezeny: papír (vláknitý) nebo membrány (mikroporézní) z celulózových materiálů jako je papír, celulóza a materiály odvozené od celulózy jako je acetát celulózy a nitrocelulóza, skleněné vlákno, látka, jak se vyskytuje v přírodě (např. bavlna), tak také syntetické materiály (např. nylon), porézní gely a podobně.
„Značkovací látka“ představuje látku, která je schopná produkovat signál, který je vizuálně nebo pomocí nástrojů detekovatelný. Různé vhodné značkovací látky použitelné v předloženém vynálezu zahrnují značky, které tvoří signály bud’ chemickými, nebo fyzikálními prostředky. Příklady zahrnují enzymy a substráty, chromageny, fluorescenční směsi, chemiluminescenční směsi, obarvené a obarvitelné organické polymerní latexové částice a liposomy nebo jiné vezikuly obsahující přímo viditelné látky. V předloženém vynálezu jsou použity s výhodou radioaktivní značkovací látky, koloidní kovové částice nebo koloidní nekovové částice. Výhodné značkovací látky zahrnují koloidní zlato a latexové částice.
„Označená látka“ nebo „konjugát“ představuje látku zahrnující detekovatelnou značkovací látku připojenou ke specifickému vázajícímu členu. Připojení může být kovalentní nebo nekovalentní vazbou a může zahrnovat hybridizaci nukleové kyseliny. Značka dovoluje označené látce vytvářet detekovatelný signál, který se vztahuje přímo nebo nepřímo k množství analyzované složky v testovacím vzorku. Složka specifického vázajícího členu označené látky je vybrána pro navázání přímo nebo nepřímo na analyzovanou složku.
„Specifický vázající člen“ představuje člen specifického vázajícího páru, tj. dvou různých molekul, přičemž se jedna z molekul specificky váže na druhou molekulu chemickým nebo fyzikálním způsobem. Pokud specifický vázající člen je složka imunitní reakce, může být například protilátkou, antigenem, haptenem nebo jejich komplexem, a pokud je použita protilátka, může to být monoklonální nebo polyklonální protilátka, rekombinační protein nebo protilátka, chimérická protilátka, jejich směs (směsi) nebo fragment (fragmenty), a také směs protilátky a jiných specifických vázajících členů. Specifické příklady specifických vázajících členů zahrnují biotin a avidin, protilátku a jejich odpovídající antigen (žádný z nich nemá vztah ke zkoušenému vzorku), jednoprovazcovou nukleovou kyselinu a její komplement a podobně.
„Zachycovací látka“ představuje jeden nebo více specifických vázajících členů, které jsou připojeny v nebo na části chromatografického nosiče pro vytvoření jednoho nebo více „záchytných míst“, ve kterých je analyzovaná složka, označené činidlo a/nebo kontrolní činidlo znehybněno na chromatografickém nosiči. Způsob připojení není pro předložený vynález rozhodující.
-3 CZ 294954 B6
Zachycující látka usnadňuje sledování detekovatelného signálu v podstatě oddělením analyzované složky a/nebo označené látky od nenavázaných zkušebních činidel a zbývajících složek v testovacím vzorku. Zachycující látka se může znehybnit na chromatografickém nosiči před nebo v průběhu provádění zkoušky pomocí jakéhokoli vhodného způsobu připojení. Zachycující látku lze dále použít na jednom detekčním místě nebo na více místech nebo na chromatografíckém nosiči. Zachycující látku lze také použít v různých konfiguracích pro realizaci různých druhů detekce nebo měření. Zachycující látka může mít například konfiguraci písmene, čísla, obrázku, symbolu nebo jakékoli jejich kombinace.
Předložený vynález poskytuje zejména chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky ve vzorku, s výhodou v krevním vzorku. Výhodným tvarem zařízení je chromatografický proužek mající chromatografícký nosič vymezující dráhu toku tekutiny, který je schopen nést kapilární tok, aplikační místo pro krevní vzorek a detekční místo umístěné mimo aplikační místo pro detekci přítomnosti nebo množství analyzované složky přítomné v krevním vzorku. Zařízení s výhodou zahrnuje také označenou látku (nebo konjugát) difúzně navázanou na chromatografický nosič. Ve výhodném vytvoření je označená látka navázaná na analyzovanou složku si konkuruje s analyzovanou složkou v navázání na detekční místo. Zařízení obsahuje výhodně dvě přídavná činidla difúzně navázaná na chromatografický nosič: (1) činidlo oddělující červené krvinky proti směru toku (dále se směr pohybu vzorku způsobený kapilárním účinkem nazývá „po směru toku“ a opačný směr se nazývá „proti směru toku“) vzhledem k detekčnímu místu, které má schopnost oddělit plazmu nebo sérum od krevního vzorku, a (2) neutralizační činidlo po směru toku vzhledem k činidlu oddělujícímu červené krvinky a proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu pro neutralizování jakéhokoli účinku činidla oddělujícího červené krvinky na chromatografický systém, zejména opačného účinku.
V souvislosti s předloženým vynálezem se termín „difúzně vázat“ používá pro dané činidlo definovatelné jako jakékoli z činidel použitých v předloženém vynálezu, která zahrnují, aniž by na ně byla omezena, označenou látku, specifický vázající člen, činidlo oddělující červené krvinky nebo neutralizační činidlo, a zamýšlí se označit, že činidlo je vázáno (činidla jsou vázána) způsobem, který dovoluje vázanému činidlu (vázaným činidlům) téci po diáze toku.
Pro účely předloženého vynálezu může být použit jakýkoli zkušební systém. Upřednostňovány jsou systémy pro imunologické testy zahrnující, aniž by na ně byly omezeny, systémy laterálního toku, systémy vertikálního toku, systémy sání a měřící tyčinky. Obecný popis známých zkušebních systémů je uveden níže.
Obecně, na chromatografickém proužku jsou na chromatografickém nosiči umístěny alespoň aplikační místo pro vzorek a detekční místo. Roztok vzorku, v tomto případě s výhodou krevní vzorek, podezřelý z toho, že obsahuje analyzovanou složku, která je předmětem zájmu, tj. analyzovanou složku, projde chromatografickým nosičem kapilárním účinkem po připojení k místu aplikace vzorku, a označená látka nebo konjugát obsažený v označujících prostředcích předem uspořádaných na chromatografickém nosiči se akumuluje na detekčním místě v přímém nebo nepřímém poměru k přítomnému množství zkoušené látky v roztoku vzorku, ovlivněném vázající reakcí (jako je imunologická reakce), takže přítomnost množství zkoušené látky v roztoku vzorku může být zajištěna měřením přítomnosti nebo množství takto akumulované označené látky nebo konjugátu. Jsou známé různé druhy chromatografických proužků a v předloženém vynálezu mohou být použity všechny z těchto známých chromatografických proužků, zahrnujících také ty, které budou popsány níže. Zde používaný termín „chromatografické zkušební zařízení“ znamená chromatografický proužek, který je vyroben takovým způsobem, že může být použit při zkoušce a může být uskladňován a transportován.
Dále je popsán typický příklad chromatografického proužku. Aplikační místo pro vzorek může být umístěno ve stejném prostoru, kde je označená látka, výhodně v pozici proti směru toku označené látky. Pokud je roztok vzorku, podezřelý z toho, že obsahuje zkoušenou analyzovanou složku, ve styku s místem aplikace, roztok vzorku projde chromatografickým nosičem ve směru
-4CZ 294954 B6 toku spolu s analyzovanou složkou ovlivněnou kapilárním účinkem. Typická analyzovaná složka je směs, která se váže ve specifickém tvaru k zachycující látce upevněné k detekčnímu místu, nebo je to směs, která se váže ve specifickém tvaru ke konjugátu, který se váže specificky k zachycující látce na detekčním místě. Analyzovaná složka je například protilátka, když zachycující látka je antigen nebo konjugát obsahuje antigen, a analyzovanou složka je antigen, když zachycující látka je protilátka nebo konjugát obsahuje protilátku. Podle následujícího příkladu může být analyzovanou složka nukleová kyselina, která se váže ke komplementárnímu konjugátu a k zachycující látce.
Je-li aplikační místo pro vzorek umístěno proti směru toku vzhledem k označené látce, označená látka může být uspořádána v sousedství aplikačního místa pro vzorek nebo na místě odloučeném od aplikačního místa pro vzorek.
Přidání označené látky může být ovlivněno různými prostředky, například jejím přidáním na jiné místo mimo detekční místo chromatografického nosiče po přidání roztoku vzorku.
Protože označená látka je uspořádána takovým způsobem, že se přemisťuje kapilárním účinkem roztoku vzorku, označená látka se pohybuje po směru toku, když je roztok vzorku přidán do prostředků pro přidávání vzorku.
Detekční místo je zpravidla umístěno po směru toku vzhledem k označené látce a v jisté vzdálenosti od označené látky. Na detekčním místě je umístěna na chromatografický nosič zachycující látka, která se váže pouze na analyzovanou složku nebo na konjugát ve specifickém tvaru, nebo se váže specificky na každou ze zkoušených látek a označenou látku. V důsledku toho se v jednom provedení analyzovaná složka (někdy připojená k označené látce) přemisťovaná kapilárním účinkem roztoku vzorku váže k zachycující látce nebo ke konjugátu, který se pak váže k zachycující složce. Označená látka se tedy váže k navázané zkoušené látce, čímž ovlivňuje akumulaci označené látky v detekčních prostředcích v reakci na přítomnost nebo množství analyzované složky. Označená látka a analyzovaná složka přemisťované kapilárním účinkem se eventuelně kompetitivně vážou k zachycující látce nebo ke konjugátu, který se pak váže k zachycující látce, čímž ovlivňuje akumulaci označené látky nepřímo úměrně k množství zkoušené látky.
Existuje případ, při kterém se jistá označená látka váže jak k zachycující látce (nebo ke konjugátu, který se pak váže k zachycující látce), tak také k analyzované složce, nikoli však současně, přičemž se nejprve analyzovaná složka váže k označené látce a zbývající označená látka, která nebyla navázána na zkoušenou látku, se váže k zachycující látce. V důsledku toho je možno analyzovat přítomnost nebo množství analyzované složky měřením označené látky akumulované v detekčních prostředcích.
Podle potřeby jsou různé látky umístěny proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu. Například konjugát takto může být umístěn pohyblivým způsobem.
V některých případech může být umístěno jedno nebo více přídavných detekčních míst po směru toku vzhledem k prvnímu detekčnímu místu. Po směru toku vzhledem k detekčnímu místu může být také další rozšíření chromatografického nosiče, takže roztok vzorku může být zcela vypuštěn, nebo může být nosič opatřen materiálem pro použití při absorpci roztoku vzorku.
Přítomnost nebo množství analyzované složky, která je předmětem zájmu, může tedy být zjištěna měřením přítomnosti nebo množství označené látky akumulované na detekčním místě. V jednom příkladu to bude názorně dokázáno.
Předložený vynález je zamýšlen pro použití jakéhokoli krevního vzorku zahrnujícího sérum a plazmu, ale výhodněji je použit s krevním vzorkem obsahujícím červené krvinky, např. s plnou krví.
-5 CZ 294954 B6
S výhodou jsou před zkouškou na analyzovanou složku, která je předmětem zájmu, z krevního vzorku odstraněny červené krvinky, aby zkouška proběhla s požadovanou citlivostí. Podle předkládaného vynálezu je tedy činidlo oddělující červené krvinky navázáno na chromatografický nosič. Činidlo oddělující červené krvinky je s výhodou difúzně navázáno na chromatografický nosič. Činidlo oddělující červené krvinky může být navázáno na chromatografický nosič na jakémkoli místě, kde bude fungovat při oddělování červených krvinek z plazmy nebo séra. Výhodně je difúzně navázáno na chromatografický nosič proti směru toku směrem k detekčnímu místu. Nejvýhodněji je činidlo oddělující červené krvinky difúzně navázáno na místě aplikace vzorku. Toto umístění je výhodné, protože způsobuje agregaci červených krvinek jakmile jsou aplikovány na chromatografický nosič, přičemž interference v toku séra nebo plazmy po nosiči kapilárním účinkem je minimální, pokud je nějaká.
Činidlo oddělující červené krvinky podle předkládaného vynálezu může být jakákoli látka schopná agregace červených krvinek. Výhodná činidla jsou kladně nabité materiály jako jsou polykationty, zahrnující například poly-1-lysin hydrobromid, poly(dimetyldialylamonium) chlorid (Merquat®-100, Merquat®-280, Merquat®- 550), poly-l-arginin hydrochlorid, poly-l-hystidin, poly(4-vinyl-pyridin), poly(4-vinylpyridm) hydrochlorid, poly(4-vinyl-pyridin) zesíťovaný, metylchloridovou kvartemí sůl, poly(4-vinylpyridin-ko-styren), poly(4-vinylpyridin poly(fluorovodík), poly(4-vinylpyridin-P-toluen-sulfonát), poly(4-vinylpyridin tribromid), poly(4-vinylpyrolidon-2-dimetylaminoetylmetakrylát), polyvinylpyrolidon zesíťovaný, polyvinylpyrolidon, poly(melamin-formaldehyd), částečně metylovaný, hexadimetrinbromid, poly(glu, lys) 1 : 4 hydrobromid, poly(lys, ala) 3 : 1 hydrobromid, poly(lys, ala) 2 : 1 hydrobromid, poly1—lysin sukcinylatovaný, poly(lys, ala) 1 : 1 hydrobromid a poly(lis, trp) 1 : 4 hydrobromid. Nejvýhodnější polykationt je poly(dimetyldialylamonium) chlorid (Merquat®- 100).
Činidlo oddělující červené krvinky podle předkládaného vynálezu může být použito v jakémkoli vhodném množství, které působí oddělování červených krvinek od zbytku vzorku. S výhodou může činidlo oddělující červené krvinky být přítomno v koncentraci od asi 0,04 % do asi 1,3 % (hmotnost na objem), výhodněji od asi 0,13 % do asi 0,33 % (hmotnost na objem), a nejvýhodněji od asi 0,20 % do asi 0,33 % (hmotnost na objem).
Kladný náboj činidla oddělujícího červené krvinky má sklon k agregaci jakéhokoli záporně nabitého činidla přítomného na proužku. Například označená látka nebo konjugát navázaný na chromatografický nosič může být také agregován činidlem oddělujícím červené krvinky interferující s vázáním analyzované složky na konjugát, nebo při konkurenční zkoušce, s vázáním označené látky a analyzované složky, která je předmětem zájmu, k zachycující látce na detekčním místě nebo konjugátu. Konečně, je možné nalézt kompromis citlivosti a přesnosti systému pro imunologické testy.
Pokud je tedy činidlo oddělující červené krvinky kladně nabitý materiál, předložený vynález s výhodou používá neutralizační činidlo. Neutralizační činidlo je schopné neutralizovat kladný náboj činidla oddělujícího červené krvinky, čímž eliminuje nebo alespoň minimalizuje jakoukoli interferenci se zkušebním systémem způsobenou činidlem oddělujícím červené krvinky. Neutralizační činidlo je s výhodou difúzně navázáno na chromatografický nosič. Neutralizační činidlo může být difúzně navázáno na jakékoli místo na chromatografickém nosiči, kde bude působit neutralizaci činidla oddělujícího červené krvinky, ale s výhodou je umístěno po směru toku vzhledem k činidlu oddělujícímu červené krvinky a proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu, a výhodněji je umístěno na stejném místě na chromatografií jako difúzně navázaná označená látka.
Neutralizační činidlo může být jakýkoli polyaniont schopný neutralizace kladného náboje činidla oddělujícího červené krvinky. Výhodné polyanionty zahrnují poly(kyselinu akrylovou), poly(kyselinu akrylovou, Na sůl), poly(metylmetakrylovou kyselinu), poly(Na-4-styren sulfonát), poly(vinylsulfonovou kyselinu), poly-l-asparagovou kyselinu, a karboxymetylcelulózu, přičemž nejvýhodnější je dextransulfát.
-6CZ 294954 B6
Neutralizační činidlo může být přítomno v jakémkoli množství, které působí neutralizaci kladného náboje činidla oddělujícího červené krvinky. Obecně, koncentrace neutralizačního činidla je závislá na koncentraci použitého činidla oddělujícího červené krvinky. S výhodou je neutralizační činidlo přítomno v koncentraci od asi 0,33 % do asi 20 % (hmotnost na objem), výhodněji od asi 0,34 % do asi 10 % (hmotnost na objem), a nejvýhodněji od asi 0,34 % do asi 10 % (hmotnost na objem).
Obrázek 1 znázorňuje vytvoření imunochromatografického zkušebního zařízení podle předloženého vynálezu. Zařízení 10 zahrnuje chromatografícký nosič 20. Na chromatografickém nosiči 20 je umístěno aplikační místo 30 pro krevní vzorek. V tomto výhodném provedení je umístěno činidlo oddělující červené krvinky, tj. Merquat®-100, na aplikačním místě 30. V sousedství aplikačního místa 30 je konjugátová podložka 40 obsahující konjugát, tj. selenem označenou vázající látku a neutralizační činidlo, tj. dextran sulfátu. Dále po směru toku je detekční místo 50, které po provedení zkoušky ukáže kontrolní pás 60, a pokud je přítomna zkoušená látka, testovací pás 70.
V jiném provedení předloženého vynálezu může být uveden do styku s aplikačním místem pufr, s výhodou po uvedení aplikačního místa do styku se vzorkem. Pufrové pomocné prostředky udržují odpovídající rychlost toku tekutiny po dráze toku na chromatografíckém nosiči. Pufr může být jakákoli látka, která je schopna tečení kapilárním účinkem po dráze toku tekutiny, zahrnující, aniž by na něj byla omezena, fosforečnanový pufr, solný -fosforečnanový pufr, Tris-HCI pufr, uhličitanový pufr, citronanový pufr, HEPES (2-hydroxypiperazin-N'-2-etansulfonová kyselina) pufr, MOPS (3-(N-morfolin)propansulfonová kyselina) pufr, MES (2-(N-morfolin)etansulfonová kyselina) pufr a podobně. Ačkoli koncentrace a pH, které budou účinkovat v požadovaném zkušebním zařízení, mohou být jakékoli, molarita je s výhodou v rozmezí od asi 10 mM do asi 100 mM a pH je asi 5 až 9 výhodněji asi 6 až 8. Použitý pufr je nejvýhodněji 50 mM fosforečnanový pufr, pH 7,4.
Objem tekutiny použitý v předloženém vynálezu závisí na velikosti zařízení. Vhodné je použít dostatečný objem tekutiny pro tok tekutiny skrze zařízení k detekčnímu místu. S výhodou je objem, tekutiny v rozmezí od asi 25 μΐ do asi 100 μΐ, výhodněji od asi 40 μΐ do asi 60 μΐ. V případě potřeby může být pufr tedy přidán v rozmezí objemu od asi 10 μΐ do asi 40 μΐ a výhodněji od asi 20 μΐ do asi 30 μΐ.
Předložený vynález je také zaměřen na způsob detekce přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku. Způsob s výhodou používá chromatografické zařízení pro imunologické testy podle předloženého vynálezu. Přesněji, způsob zahrnuje (1) poskytnutí chromatografického nosiče, který vymezuje dráhu toku tekutiny schopnou podporování kapilárního toku, podél kterého jsou aplikační místo pro krevní vzorek, který je ve styku s chromatografíckým nosičem, detekční místo na chromatografíckém nosiči umístěné mimo aplikační místo, difúzně označená látka (nebo konjugát), která se váže k detekčnímu místu, nebo soutěží s analyzovanou složkou o navázání na detekční místo, difúzně navázané činidlo oddělující červené krvinky pro oddělení plazmy nebo séra z uvedeného krevního vzorku proti směru toku vzhledem k detekčnímu místu, a konjugát navázaný na chromatografícký nosič, (2) uvedení aplikačního místa do styku s krevním vzorkem tak, že činidlo oddělující červené krvinky odděluje červené krvinky z plazmy nebo séra krevního vzorku, a neutralizační činidlo neutralizuje kladný náboj oddělujícího činidla, a (3) detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku.
Činidlo oddělující červené krvinky je s výhodou kladně nabitý materiál a dráha toku tekutiny obsahuje difúzně navázané neutralizační činidlo, které je s výhodou schopné vázat se s uvedeným činidlem oddělujícím červené krvinky a je umístěno po směru toku vzhledem k uvedenému činidlu oddělujícímu červené krvinky a proti směru toku vzhledem k uvedenému detekčnímu místu, čímž je neutralizován kladný náboj uvedeného oddělujícího činidla.
-7CZ 294954 B6
Ve výhodném provedení podle obrázku 1 je tedy aplikován krevní vzorek na aplikační místo 30 a činidlo oddělující červené krvinky odděluje červené krvinky jejich agregací a dovolením, aby se plazma nebo sérum pohybovalo kapilárním účinkem dolu po chromatografickém nosiči 20. Neutralizační činidlo v konjugátové podložce 40 neutralizuje účinek činidla oddělujícího červené krvinky na zařízení 10 a konjugát a analyzovaná složka se váže na konjugát přítomný v konjugátové podložce 40. Analyzovaná složka navázaná na konjugát pokračuje v pohybování po směru toku k detekčnímu místu 50. Pokud je přítomna analyzovaná složka, která je předmětem zájmu, objeví se testovací pás 70. Kontrolní pás 60 ukáže, zdaje analyzovaná složka, která je předmětem zájmu, přítomna nebo ne, což udává, že zkouška probíhá správně.
Předložený vynález může výhodně zahrnovat nereaktivní kryt nebo uzavření kolem zařízení. Výhodně kryt uzavírá alespoň chromatografický nosič pro zabránění styku se záchytnými místy a jejich kontaminaci. Kryt může zahrnovat také zvýšenou plochu přiléhající k aplikačnímu místu pro usnadnění přijetí a/nebo zadržení jistého objemu vzorku. Navíc může kryt zahrnovat vyříznutou oblast nebo oblasti ve tvaru písmene, čísla, obrázku, symbolu nebo jakékoli jejich kombinace. V tomto provedení vyříznutá oblast nebo oblasti určují tvar jednotlivých detekčních míst, pokud je proužek zcela uzavřen. S výhodou je dostatečná část proužku obalená pro ochranu použitého vzorku před stykem s detekčními místy bez toho, že by dříve prošel skrz část proužku.
Zařízení a způsob podle předloženého vynálezu mohou být použity v jakémkoli zkušebním systému, ve kterém krevní vzorek obsahuje analyzovanou složku, která je předmětem zájmu. Příklady výhodných systémů zahrnují, aniž by na ně byly omezeny, virus hepatitidy C (hepatitis C virus „HCV“), virus hepatitidy A (hepatitis A virus - „HAV“), virus HIV (human immunodeficiency virus - „HIV“), povrchovou protilátku hepatitidy B (hepatitis B surface antibody „HbsAb“), povrchovou protilátku hepatitidy B (hepatitis B surface antigen - „HbsAg“), jádrovou protilátku hepatitidy B (hepatitis B core antibody - „HbcAb“), jádrovou protilátku hepatitidy B (hepatitis B core antigen - „HbcAg“), karcinoembryonický antigen (carcinoembryonic antigen „CEA“), alfafetoproten(alpha-fetoproten - „AFP“), indikátor pankreatické rakoviny (pancreatic cancer markér -„CA 19-9“), syfilis, tuberkulózu, malárii, leishmaniózu a horečku dengue.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje výhodné provedení chromatografického zkušebního zařízení podle předloženého vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady dále ilustrují předložený vynález, ale neměly by být vykládány jako jakýmkoli způsobem omezující jeho rozsah.
Příklad 1
Agregace červených krvinek versus agregace Se-konjugátu polykationty
Pro účely předloženého vynálezu je požadována agregace červených krvinek v plné krvi, zatímco není žádoucí agregace selenového konjugátu. Byly testovány různé polykationty, aby bylo zjištěno, které by způsobily dostatečnou agregaci červených krvinek, a současně pouze minimální agregaci selenového konjugátu.
Selenový konjugát HIV-1 rekombinačního proteinu byl připraven následujícím způsobem: nejprve byl připraven selenový koloid reakcí 32 mM oxidu seleničitého s 91 mM 1-askorbové kyseliny ve vodném roztoku po dobu 72 hodin při 42 °C. Tento selenový koloid byl zředěn na
-8CZ 294954 B6 optickou hustotu 30 při vlnové délce 550 nm a pak byla umožněna reakce s 40 pg/ml rekombinačního HIV-1 obalového proteinu v 30 mM Tris pufru, při pH 7,4 po dobu 20 minut při teplotě okolí. Tento selenový koloid - označený HIV-1 proteinový konjugát byl pak zředěn na optickou hustotu 30 při vlnové délce 550 nm v 10 mM Tris pufru, při pH 7,4 a obsahu 0,1 % kaseinu, a inkubován po dobu 20 minut při teplotě okolí. Roztok konjugátu byl pak odstředěn při 1970 násobku g po dobu 20 minut při 4 °C, supematant odtažen a granule odstraněny. Pak byl přidán do supernatantu objem 30 mM Tris pufru, při pH 7,4 a obsahu 2 % kaseinu, ekvivalentní jedné desetině objemu supernatantu. Nakonec byl roztok konjugátu zředěn na optickou hustotu 10 při vlnové délce 550 nm v 50 mM Tris pufru, při pH 7,4 a obsahu 1 % kaseinu, 2 % sacharózy a 2 % laktózy.
Byly připraveny 0,25 % (hmotnost na objem) vodné roztoky následujících polykationtů: poly-l-lysin hydrobromid, molekulová hmotnost (m.v.) 37 000, poly-l-arginin hydrochlorid, m.v. 12 100, 42 400 a 92 000, poly-l-histidin, m.v. 18 400, hexadimetrinbromid, poly(Iysin, alanin) 3 : 1 hydrobromid, m.v. 35 000, poly(lysin, alanin) 2 : 1 hydrobromid, m.v. 49 300, poly(lysin, alanin) 1 : 1 hydrobromid, m.v. 41 600, polydysin, triptofan) 1 : 4 hydrobromid, m. v. 38 000 (všechny z výše uvedených polykationtů byly nakoupeny od firmy Sigma, St. Louis,MO), poly(chlorid dialyldimetylamonný), m.v. 105 až 106 (Merquat®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).
Schopnost těchto polykationtů agregovat buď červené krvinky v plné krvi nebo selenový konjugát byla sledována v oddělených reakcích přidáním 350 μΐ 0,25 % různých polykationtových roztoků do stejného objemu buď plné krve nebo selenového konjugátu. Roztoky byly míchány a uskladňovány při teplotě okolí po dobu 10 minut, pak byla vizuálně vyhodnocena agregace. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. Jedno plus (+) znamená slabou agregaci, 2+ znamenají střední agregaci a 3+ a 4+ znamenají silnou agregaci.
Tabulka 1
Agregace
Polykationt Molekulová Červené Se-
hmotnost krvinky konj ugát
Poly-l-lys Hbr 37000 2+ 2 +
Merquat®-100 105 až 106 2 + 2+
Poly-l-Arg HCI 12100 2+ 2+
Poly-l-Arg HCI 42400 2 + 2+
Poly-l-Arg HCI 92000 2+ 2 +
Poly-l-his 18400 + 4 +
Hexadimetrin Br ř* +
Póly(lys, ala) 3:1 HBr 35000 2 + 2 +
Poly(lys, ala) 2:1 HBr 49300 + 2 +
Poly(lys, ala) 1:1 HBr 41600 + 2 +
Póly(lys, trp) 1:4 HBr 38000 3+ 3+
Vhodnou volbu představuje polykationt, který způsobuje agregaci červených krvinek (2+ nebo větší) zatímco způsobuje minimální agregaci selenového konjugátu (2+ nebo menší). Tato kritéria splňují polykationty s 2+ v obou kategoriích. Pro další práci byly vybrány poly-l-lysin Hbr a Merquat®-! 00, s tím, že cenově nejvýhodnější je Merquat®-! 00.
-9CZ 294954 B6
Příklad 2
Zamezení agregaci konjugátu polyaniontovou neutralizací
A) Zamezení toku a agregace konjugátu použitím dextransulfátu
Při použití poly-l-lysinu jako polykationtového činidla agregujícího červené krvinky byly testovány různé koncentrace polyaniontu dextransulfátu pro zjištění, zda by kladný náboj polykationtu mohl být neutralizován dextransulfátem, čímž je zajištěno zamezení agregace selenového konjugátu způsobené polykationtem. Dextran sulfát byl přidán až poté, co polykationt způsobil agregaci červených krvinek, ale před interakcí polykationtu se selenovýmkonjugátem. Následující experiment vyhodnocoval účinek polykationtu a dextransulfátu na agregaci selenového konjugátu a jeho následující schopnost téci po imunochromatografíckém proužku.
Byl sestaven imunochromatografický proužek, složený z podložky vzorku, neutralizační podložky, konjugátové podložky a detekčního proužku. Podložka vzorku byla připravena napuštěním 4 mm širokého a 20 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) vodným roztokem 0,33 % poly-l-lysin hydrobromidu, m.v. 37 000 (Sigma, St. Louis, MO), pak sušením ve vakuu.
Neutralizační podložky obsahující různé koncentrace dextransulfátu byly připraveny napuštěním 4 mm širokých a 13 mm dlouhých filtrů vyrobených z vlněné drtě a polyesteru (Sontara 8801, Du pont., Wilmington, Delware) vodnými roztoky obsahujícími 0%, 1,1%, 3,3% nebo 10% dextransulfátu, m.v. 5 000 (Sigma, St. Louis, MO). Po napuštění byly podložky sušeny ve vakuu.
Konjugátová podložka byla připravena napuštěním 4 mm širokého a 4,3 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) selenovým koloidem - označeným HIV-1 rekombinačním proteinovým konjugátem připraveným a zředěným podle příkladu 1. Po napuštění byla konjugátová podložka sušena ve vakuu.
Detekční proužek byl filtr z nitrocelulózové membrány 4 mm široký 40 mm dlouhý (katalog #H9643G1, Millipore, Bedford, MA). Do nitrocelulózové membrány byl přidán HIV-1 krycí antigen v koncentraci 5 mg/ml v 100 mM Tris pufru, při pH 7,4 obsahující 1 % sacharózy, pro vytvoření linie napříč proužkem v místě asi 1 cm od konce membrány. Vyznačená oblast byla překryta polyesterovým laminátem (kód #7733, Adhesives Research lne., Glen Rock, PA). Toto bylo umožněno pro odpovídající sušení, aby byl antigen upevněn k nitrocelulóze.
Imunochromatografické proužky, 4 mm široké, byly sestaveny za použití výše uvedených součástek jejich umístěním konci k sobě podélně s 1 mm přesahem mezi každou oblastí, s 20 mm dlouhou podložkou vzorku na jednom konci, vedle které byla umístěna jedna z 13 mm dlouhých neutralizačních vložek, následovaná 4,3 mm dlouho konjugátovou podložkou a nakonec 40 mm dlouhým detekčním proužkem. Sestavený proužek pak byl překryt polyesterovým laminátem (kód #8648, Adhesives Research lne., Glen Rock, PA) z vrcholu detekčního proužku na 10 mm od spodku proužku, přičemž bylo ponecháno přibližně 10 mm podložky vzoiku nepokrytých. Pak bylo použito 80 μΐ plazmy na podložky vzorku každého z imunochromatografických proužků obsahujících neutralizační podložky s buď 0 %, 1,1 %, 3,3 % nebo 10 % dextransulfátu. Agregace červeného selenového konjugátu a schopnost konjugátu téci po proužku byla vizuálně sledována.
Výsledky, znázorněné níže v tabulce 2, ukazují, že bez přítomnosti dextransulfátu pro neutralizování náboje z polykationtového roztoku se selenový konjugát agregoval a nebyl schopen téci po proužku. Byl tam obrácený vztah mezi agregací a tokem konjugátu, s koncentrací dextransulfátu 3,3 % a větší, vhodnou pro zamezení agregace konjugátu a dovolení konjugátu téci po proužku.
- 10CZ 294954 B6
Tabulka 2
Koncentrace dextrasulfátu Agregace konjugátu Tok konjugátu
0% ++ -
1,1 % + +/-
3,3 % - +
10% - 4~
B) Agregace červených krvinek za přítomnosti dextransulfátu
Za účelem stanovení účinku dextransulfátu na agregaci červených krvinek byl opakován výše uvedený experiment za použití plné krve jako vzorku s 10 % dextransulfátem na 4,3 mm dlouhou a 4 mm širokou neutralizační podložku. Po sestavení imunochromatografíckého proužku popsaném výše a po použití této neutralizační podložky bylo na podložku vzorku aplikováno 80 μΐ plné krve. O patnáct minut později byl vizuálně sledován výsledek agregace červených krvinek a byla měřena schopnost výsledné plazmy téci po proužku. Červené krvinky, zadrženy na podložce vzorku, byly agregovány a netekly po proužku, zatímco plazma tekla po proužku 33 mm za 15 minut. To ukazuje, že polykationt ve vzorkové podložce byl stále schopen způsobit agregaci červených krvinek ve vzorku plné krve, a že přítomnost polykationtu, dextransulfátu, v neutralizační podložce neinterferovala s touto agregaci červených krvinek.
C) Zamezení agregace konjugátu pomocí polyaniontů
Pro posouzení schopnosti zamezovat agregaci selenového konjugátu byly testovány jiné anionty než v příkladu 2A. 15,5 mm dlouhá a 4 mm široká podložka vzorku byla napuštěna vodným roztokem obsahujícím 0,26% Merquat®-100 a pak byla sušena při 55 °C. Nebyly použity neutralizační podložky a místo toho byl selenový konjugát zředěn na 10 mM Tris pufr, při pH7,4 a obsahu 1 % kaseinu, 2 % sacharózy a 2 % laktózy a 0 %, 1,1 % nebo 3,3 % polyaniontů dextran sulfátu, m.v. 5 000 (Sigma, St. Louis, MO) , nebo 0 %, 0,5 %, 1 % nebo 2 % jednoho z následujících polyaniontů (všechny od firmy Aldrich Chemical, Milwaukee, WI): poly(akrylová kyselina), m.v. 5 000, poly(sodík-4-styren sulfonát), m.v. 70 000, poly(vinylsulfonová kyselina, sodná sůl), poly(metylmetakrylová kyselina), m.v. 9 500, poly(akrylová kyselina, sodná sůl), m.v. 2100. Konjugátové podložky byly napuštěny různými roztoky selenového konjugátu a byly sušeny ve vakuu. Detekční proužek byl připraven jak je popsáno v příkladu 2A a byly sestaveny imunochromatografícké proužky. Pak bylo aplikováno 50 μΐ plazmy na podložky vzorků každého z imunochromatografických proužků obsahujících konjugátové podložky s různými polyanionty. Agregace červeného selenového konjugátu byla vizuálně sledována. Tabulka 3 zachycuje relativní množství agregace konjugátu při různých testovaných koncentracích polyaniontů.
Tabulka 3
Agregace selenového konjugátu
Koncentrace polyaniontů
Polyaniont 0% 0,5 % 1-1,1 % 2% 3,3 %
Dextransulfát ++ nt + nt -
Poly(akrylová kyselina) ++ - - - nt
Poly(Na-4-styren sulfonát ++ ++ ++ + nt
Poly(vinylsulfonová kyselina) ++ +/- - - nt
Poly(metylakrylová kyselina) ++ - - - nt
Poly(akrylová kyselina, Na sůl) ++ + +/- - nt
Nt = netestováno
-11 CZ 294954 B6
Jako předtím, agregoval selenový konjugát pokud nebyl přítomný polyaniont pro neutralizaci kladného náboje polykationtu z podložky vzorku (který je nezbytný pro agregaci červených krvinek při testování, plné krve). Všechny z polyaniontů použitých v konjugátové podložce zabránily výskytu agregace konjugátu alespoň v jedné z testovaných koncentrací. Tento experiment ukázal také, že polyaniont nemusel být aplikován na oddělenou podložku, ale mohl být kombinován se selenovým konjugátem na konjugátové podložce.
Příklad 3
Použití dextranu sulfátu v neutralizační podložce versus konjugátová podložka v testu na HIV-1 protilátku
Imunochromatografické proužky byly připraveny jako v příkladu 2A buď s, nebo bez 4 mm širokého a 4,3 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH), neutralizační podložky. Pokud byla použita, byla neutralizační podložka napuštěna vodným roztokem obsahujícím 3,3 % dextransulfátu a pak byla sušena ve vakuu. V proužcích bez neutralizační podložky byl selenový konjugát zředěn v 10 mM Tris pufru, při pH 7,4 a obsahu 1 % kaseinu, 2 % sacharózy, 2 % laktózy a 3,3 % dextransulfátu, konjugátová podložka byla napuštěna tímto roztokem a byla sušena ve vakuu. Použitá podložka vzorku byla jako v příkladu 2A, kromě toho, že byla napuštěna vodným roztokem 0,2 % Merquat®-100.
Lidské sérum obsahující HIV-1 protilátky bylo zředěno 1 :2 048 buď v HIV negativní lidské plné krvi (založené na objemu plazmy) s hodnotou hematokritu 50 % nebo v HIV negativní lidské plazmě. Byla provedena tři následná 1 : 2 sériová ředění, opět za použití buď plné krve, nebo plazmy jako ředidla. 80 μΐ negativní plné krve nebo vzorků z HIV-1 pozitivních sérií ředěných plnou krví bylo přidáno do podložky vzorku imunochromatografických proužků připravených s dextransulfátem na oddělené neutralizační podložce nebo s dextransulfátem v roztoku selenového konjugátu na konjugátové podložce. 80 μΐ negativní plazmy nebo vzorků z HIV-1 pozitivní plazmy sérií ředění bylo testováno pouze na imunochromatografických proužcích s dextransulfátem na konjugátové podložce. Výsledky byly odečteny 15 minut po aplikaci vzorku (tabulka 4). Pozitivní výsledek ukázal červenou barvu na detekčním proužku, kde byl na HIV-1 antigenu na vyznačené oblasti proužku navázán červený selenový HIV-1 antigen, komplex konjugát-HIV-1 protilátka. Negativní výsledek na detekčním proužku neukázal žádnou barvu v této oblasti.
Tabulka 4
Dextrasulfát v neutralizační podložce Dextrasulfát v konjugátové podložce
Zředění vzorku Plná krev Plná krev Plazma
1 : 2 048 + + +
1 :4 096 + + +
1 : 8 192 - + +
1 : 16 384 nt - -
Negativní kontrola — — —
Nt = netestováno
Výsledky v tabulce 4 naznačují, že HIV-1 protilátky jsou zjistitelné z plné krve na imunochromatografickém testovacím proužku za použití polykationtu Merquat®-100 pro agregaci červených krvinek a pro dovolení vzorku téci po proužku, a polyaniontů dextransulfátu jako neutralizačního činidla, zabraňujícího agregaci selenového konjugátu polykationtem a dovolujícího konjugátu vázat se a vytvářet komplex s kladným vzorkem a téci po proužku k detekční
- 12 CZ 294954 B6 oblasti. Ukázalo se, že polyaniont byl efektivní, pokud byl použit buď v oddělené neutralizační podložce, nebo kombinován se selenovým konjugátem na konjugátové podložce. V tomto testu prokázala senzitivita detekce HIV-1 protilátek zlepšení, když byl polyaniont (dextransulfát) použit v konjugátové podložce a ne na oddělené neutralizační podložce.
Navíc výsledky v tabulce 4 naznačují, že polykationt efektivně agreguje červené krvinky v plné krvi, jak ukazuje stejná senzitivita detekce HIV-1 protilátek v plné krvi, kde musejí být červené krvinky agregovány pro tok vzorku, i v plazmě, kde nejsou žádné červené krvinky, které by bránily vzorku v toku. To také ukazuje, že přítomnost polyaniontu, buď v oddělené neutralizační podložce, nebo v konjugátové podložce, neinterferuje se schopností polykationtu efektivně způsobovat agregaci červených krvinek v plné krvi.
Příklad 4
Použití Merquat -100 a různých polyaniontů v HBsAg testu
Imunochromatografické proužky byly připraveny pro detekci povrchového antigenu hepatitidy B (hepatitis B surface antigen - HBsAg) ve vzorcích plné krve. Merquat®-100 byl použit jako polykationt pro agregaci červených krvinek v podložce vzorku a různé polyanionty byly v konjugátové podložce ohodnoceny jako polykationtová neutralizační činidla pro zamezení agregace selenového konjugátu.
Byly sestaveny imunochromatografické proužky, složené z podložky vzorku, konjugátové podložky a detekčního proužku. Podložka vzorku byla připravena napuštěním 4 mm širokého a
15,5 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken vodným roztokem 0,26 % Merquat®-100, a pak sušením při 55 °C.
Selenový konjugát byl připraven za použití selenového koloidu, jako v příkladu 1, a 12 pg/ml myší monoklonální protilátky proti HbsAg (anti-Hbs). Tento selenovým koloidem označený anti-Hbs konjugát byl pak zředěn na optickou hustotu 2,6 při vlnové délce 550 nm v Tris pufru obsahujícím jeden z následujících polyaniontů: 0,5 % póly(akrylová kyselina), m.v. 2 000 (poly(acrylic acid) - PAA-2 000), 0,5 % poly(akrylová kyselina), m. v. 240 000 (PAA-240 000), 0,5 % dextran sulfát, m.v. 5000, 0,8 % poly-l-aspartová kyselina), m. v. 36 300, 0,5 % karboxymetylcelulóza, m.v. 90 000 (carboxymethyl cellulose - CMC). Dextran sulfát a poly-1- aspartová kyselina byly ze Sigma, St. Louis, MO, a zbývající polyanionty byly z Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.
Konjugátová podložka byla připravena napuštěním 4 mm širokého a 4,3 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken selenovým koloidem označeným anti-Hbs konjugátem připraveným a zředěným jedním z výše uvedených polyaniontů. Po napuštění byla konjugátová podložka sušena ve vakuu.
Detekční proužek byl 4 mm široký a 40 mm dlouhý nitrocelulózový membránový filtr, připravený jako v příkladu 2 za použití myší monoklonální anti-Hbs v koncentraci 3 mg/ml a přidaný do nitrocelulózové membrány tak, aby vytvořil linii napříč proužkem v místě asi 1 cm od konce membrány. Označená oblast byla překryta polyesterovým laminátem. To bylo umožněno pro odpovídající sušení, aby byla upevněna protilátka k nitrocelulóze.
Imunochromatografické proužky byly sestaveny za použití výše uvedených komponent jejich umístěním konci k sobě podélně s 1 mm přesahem, s podložkou vzorku na jednom konci, vedle kterého byla umístěna konjugátová podložka, a nakonec detekční proužek. Sestavený proužek byl pak překryt polyesterovým laminátem, přičemž bylo ponecháno přibližně 10 mm podložky vzorku nepokrytých.
-13 CZ 294954 B6
Rekombinant HbsAg byl přidán k HbsAg negativní lidské plné krvi s hodnotou hematokritu 50 % s koncentrací 12,5 ng/ml. Na plné krvi byla provedena série tří dalších ředění. 50 μΐ negativní plné krve nebo vzorků ze sérií ředění HbsAg pozitivní plné krve bylo přidáno do podložky vzorku imunochromatografických proužků připravených s různými polyanionty v konjugátové podložce. Výsledky byly odečteny 15 minut po aplikaci vzorku (tabulka 5). Pozitivní výsledek ukázal červenou barvu na detekčním proužku, kde byl na anti-HBs na vyznačené oblasti proužku navázán červený selenový anti-HBs komplex konjugát-HBsAg. Negativní výsledek neukázal žádnou barvu v této oblasti na detekčním proužku. Agregace červeného selenového konjugátu u vstupu do detekčního proužku byla vizuálně sledována.
Tabulka 5
Koncentrace HbsAg (ng/ml)
Polyanion 12,5 6,25 3,13 1,56 0 Agregace konjugátu
PAA-2 000 + + + - - -
PAA-240 000 + + - - - +
Dextransulfát + + + - - -
Póly-1-asp + + + - - -
CMC + - - - - +
Zatímco všechny polykationty dovolily detekci objevit HbsAg, ty polykationty, které zabraňují agregaci konjugátu, PAA-2000, dextran sulfát a poly-l-aspartová kyselina, ukazují dvojnásobnou až čtyřnásobnou senzitivitu detekce HbsAg ve vzorcích plné krve.
Výše uvedený experiment byl opakován, přičemž byl použit konjugát označený selenovým koloidem zředěný v Tris pufru obsahujícím PAA-2000 jako polyaniont, který byl, kromě 25 μΐ 50 mM fosfátového pufru, při pH 7,4, přidán do podlážky vzorku jednu minutu po přidání HbsAg vzorků plné krve. Výsledky získané za použití tohoto postupu, s přidáním pufru po aplikaci vzorku, byly identické s výsledky bez tohoto kroku. Testy mohly tedy být dělány buď s nebo bez přidání pufru po aplikaci vzorku.
Příklad 5
Použití Merquat®-100 a dextransulfátu v testu na tuberkulózu
Imunochromatografické proužky byly připraveny pro detekci protilátky proti mykobakteriu tuberkulózy (anti-Mtb) ve vzorcích plné krve. Merquat®-100 byl použit jako polykationt pro agregaci červených krvinek v podložce vzorku a různé koncentrace polyaniontu dextransulfátu byly ohodnoceny v konjugátové podložce jako polykationtové neutralizační činidlo pro zamezení agregace selenového konjugátu.
Byly sestaveny imunochromatografické proužky, složené z podložky vzorku, konjugátové podložky a detekčního proužku. Podložka vzorku byla připravena napuštěním 4 mm širokého a
15,5 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken vodným roztokem 0,26 % Merquat®-100, a pak sušením ve vakuu.
Selenový konjugát byl připraven za použití selenového koloidu, jako v příkladu 1, a 3,5 pg/ml rekombinantu Mtb antigenu z E. coli. Tento selenovým koloidem označený Mtb konjugát byl pak zředěn na optickou hustotu 2,5 při vlnové délce 550 nm v Tris pufru obsahujícím buď 0 %, 0,34 %, 1,1 %, nebo 3,3 % dextransulfátu.
-14CZ 294954 B6
Konjugátová podložka byla připravena napuštěním 4 mm širokého a 4,3 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken selenovým koloidem označeným Mtb konjugátem připraveným a zředěným jednou z výše uvedených koncentrací dextranu. Po napuštění byla konjugátová podložka sušena ve vakuu.
Detekční proužek byl 4 mm široký a 40 mm dlouhý nitrocelulózový membránový filtr, připravený jako v příkladu 2 za použití rekombinantu Mtb antigenu v koncentraci 0,15 mg/ml a přidaný do nitrocelulózové membrány tak, aby vytvořil linii napříč proužkem v místě asi 1 cm od konce membrány. Označená oblast byla překryta polyesterovým laminátem. To bylo umožněno pro odpovídající sušení, aby byla upevněna protilátka k nitrocelulóze.
Imunochromatografické proužky byly sestaveny za použití výše uvedených komponent jejich umístěním konci k sobě podélně s 1 mm přesahem, s podložkou vzorku na jednom konci, vedle kterého byla umístěna konjugátová podložka, a nakonec detekční proužek. Sestavený proužek byl pak překryt polyesterovým laminátem, přičemž bylo ponecháno přibližně 10 mm podložky vzorku nepokrytého.
Anti-Mtb pozitivní sérum bylo zředěno 1 : 100 negativní lidskou plnou krví s hodnotou hematokritu 50 %. Na plné krvi byla provedena tři další 1 : 2 série ředění. 50 μΐ negativní plné krve nebo vzorků ze sérií ředění anti-Mtb pozitivní plné krve bylo přidáno do podložky vzorku imunochromatografických proužků připravených s různými koncentracemi dextransulfátu v konjugátové podložce. Výsledky byly odečteny 15 minut po aplikaci vzorku (tabulka 6). Pozitivní výsledek ukázal červenou barvu na detekčním proužku, kde byl na Mtb na vyznačené oblasti proužku navázán červený selenový Mtb komplex konjugát-anti-Mtb. Negativní výsledek neukázal žádnou barvu v této oblasti na detekčním proužku. Agregace červeného selenového konjugátu u vstupu do detekčního proužku byla vizuálně sledována.
Tabulka 6
dextrasulfát Anti - Mtb ředění
% 1 : 100 1 : 200 1 :400 Neg. kontrola Agregace konjugátu
0 - - - - ++
0,34 - - - - ++
U + - - - +
3,3 + + - - -
Údaje v tabulce 6 ukazují, že test nefunguje bez přítomnosti polyaniontu, v tomto případě dextransulfátu, pro zamezení agregace konjugátu. Mezi agregací konjugátu a sensitivitou testu je inverzní vztah. Při koncentraci dextransulfátu 3,3 % se nevyskytuje žádná agregace konjugátu a test ukazuje největší senzitivitu detekce anti-Mtb.
Příklad 6
Test syfilis za použití Merquat-100 a dextransulfátu
Imunochromatografické proužky byly připraveny pro detekci protilátky proti treponema pallidum (anti-TP) ve vzorcích plné krve, nebo ve vzorcích plazmy. Srovnáním senzitivity detekce v plné krvi nebo v plazmě lze určit, zda by byly červené krvinky v plné krvi efektivně agregovány polykationtem, aby neinterferovaly se senzitivitou detekce zkoušky, čímž by ji snížily. Merquat®-100 byl použit jako polykationt pro agregaci červených krvinek v podložce vzorku a polyaniont dextransulfát byl použit v konjugátové podložce jako polykationtové neutralizační činidlo pro -zamezení agregace selenového konjugátu.
- 15CZ 294954 B6
Byly sestaveny imunochromatografícké proužky, složené z podložky vzorku, konjugátové podložky a detekčního proužku. Podložka vzorku byla připravena napuštěním 4 mm širokého a
15,5 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken vodným roztokem 0,2 % Merquat®-100, a pak sušením při 55 °C.
Selenový konjugát byl připraven za použití selenového koloidu, jako v příkladu 1, a 7,5 pg/ml treponema pallidum lyzátu (TP). Tento selenovým koloidem označený TP konjugát byl pak zředěn na optickou hustotu 2,8 při vlnové délce 550 nm v Tris pufru obsahujícím 3,3 % dextransulfátu.
Konjugátová podložka byla připravena napuštěním 4 mm širokého a 4,3 mm dlouhého filtru ze skleněných vláken selenovým koloidem TP konjugátem připraveným jak je uvedeno výše. Po napuštění byla konjugátová podložka sušena ve vakuu.
Detekční proužek byl 4 mm široký a 40 mm dlouhý nitrocelulózový membránový filtr, připravený jako v příkladu 2 za použití treponema pallidum lyzátu v koncentraci 44 (pg/ml a přidaný do nitrocelulózové membrány tak, aby vytvořil linii napříč proužkem v místě asi 1 cm od konce membrány. Označená oblast byla překryta polyesterovým laminátem. To bylo umožněno pro odpovídající sušení, aby byl upevněn TP lyzát k nitrocelulóze.
Imunochromatografícké proužky byly sestaveny za použití výše uvedených komponent jejich umístěním konci k sobě podélně s I mm přesahem, s podložkou vzorku na jednom konci, vedle kterého byla umístěna konjugátová podložka, a nakonec detekční proužek. Sestavený proužek byl pak překryt polyesterovým laminátem, přičemž bylo ponecháno přibližně 10 mm podložky vzorku nepokrytých.
Anti-TP pozitivní lidské sérum bylo zředěno 1 : 10,8 negativní lidskou plnou krvi s hodnotou hematokritu 50 % nebo negativní lidskou plazmou. Na plné krvi byla provedena čtyři další 1 : 2 série ředění, opět za použití buď plné krve, nebo plazmy jako ředidla. 60 μΐ negativní plné krve nebo plazmy, nebo vzorků ze sérií ředění anti-TP pozitivní plné krve nebo plazmy bylo přidáno do podložky vzorku imunochromatografíckých proužků. Výsledky byly odečteny 15 minut po aplikaci vzorku (tabulka 7). Pozitivní výsledek ukázal červenou barvu na detekčním proužku, kde byl na TP lyzát na vyznačené oblasti proužku navázán červený selenový TP komplex konjugátanti-TP. Negativní výsledek neukázal žádnou barvu v této oblasti na detekčním proužku.
Údaje v tabulce 7 ukazují, že senzitivita detekce anti-TP vzorků je stejná jak pro plnou krev tak pro plazmu, což signalizuje, že polykationt Merquat®-100 je účinný pro agregaci červených krvinek v plné krvi.
Tabulka 7
Ředění vzorku anti-TP Plná krev Plazma
1 : 10,8 + +
1 : 21,6 + +
1 :43,2 + +
1 : 86,4 + +
1 : 172,8 - -
Negativní kontrola - -
Všechny zde citované spisy, patenty a patentové přihlášky, jsou zde začleněny v takovém rozsahu, jako by byl každý jednotlivý dokument začleněn, individuálním a specifickým odkazem a byl zde v úplnosti vyložen.
-16CZ 294954 B6
Zatímco tento vynález byl popsán s důrazem na výhodná provedení, odborníkům v oboru bude zřejmé, že výhodná provedení mohou být obměňována. Rozumí se, že vynález může být využíván i jinak, než jak je zde specificky popsán. Tento vynález zahrnuje také všechny modifikace v rámci smyslu a rozsahu vynálezu, jak je uvedeno v popisu a patentových nárocích.

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku vyznačující se t í m , že zahrnuje:
    chromatografícký nosič, který vymezuje dráhu toku tekutiny a podporuje kapilární tok, aplikační místo pro uvedený krevní vzorek v toku tekutiny umožňujícím styk s uvedeným chromatografickým nosičem, detekční místo na chromatografickém nosiči umístěné mimo uvedené aplikační místo mající na sebe nedifúzně navázánu zachycující látku, difúzně navázanou označenou látku umístěnou po směru toku vzhledem k aplikačnímu místu, difúzně navázaný polykationt pro oddělování plazmy nebo séra z uvedeného krevního vzorku proti směru toku vzhledem k uvedenému detekčnímu místu a difúzně navázaný polyaniont pro neutralizování polykationtu po směru toku vzhledem k uvedenému navázanému polykationtu a proti směru toku vzhledem k uvedenému detekčnímu místu.
  2. 2. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené zařízení je zařízení pro imunologické testy.
  3. 3. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polykationt je navázán na uvedené místo pro aplikaci uvedeného krevního vzorku.
  4. 4. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polykationt je vybrán ze skupiny sestávající z poly-l-lysin hydrobromidu, poly-1arginin hydrochloridu, poly-l-histidinu, poly(lysin, alanin) 3 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, alanin) 2 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, alanin) 1 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, tryptofan) 1 : 4 hydrobromidu a póly(dialyl-dimetylamoniumchloridu).
  5. 5. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polykationt je póly(dialyldimetylamoniumchlorid).
  6. 6. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polyaniont je vybrán ze skupiny sestávající z dextransulfátu, poly(akrylové kyseliny), poly(sodno-4-styren sulfonátu), poly(vinylsulfonové kyseliny), poly(metylmetakrylové kyseliny), poly-l-aspartové kyseliny a karboxymetylcelulózy.
  7. 7. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polyaniont je dextransulfát.
  8. 8. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polyaniont je difúzně navázán na chromatografícký nosič na stejném místě jako uvedená označená látka.
    - 17CZ 294954 B6
  9. 9. Chromatografické zkušební zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená označená látka je látka označená selenem.
  10. 10. Způsob detekce přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    poskytnutí chromatografíckého nosiče, který vymezuje dráhu toku tekutiny a podporuje kapilární tok, podél kterého jsou (a) aplikační místo pro uvedený krevní vzorek v toku tekutiny umožňujícím styk s uvedeným chromatografíckým nosičem, (b) detekční místo na uvedeném chromatografickém nosiči umístěné mimo aplikační místo mající na sebe nedifúzně navázánu zachycující látku, c) označenou látku umístěnou po směru toku vzhledem k aplikačnímu místu, (d) difúzně navázaný polykationt pro oddělování plazmy nebo séra z uvedeného krevního vzorku proti směru toku vzhledem k uvedenému detekčnímu místu a (e) difúzně navázaný polyaniont pro neutralizování polykationtu po směru toku vzhledem k uvedenému navázanému polykationtu a proti směru toku vzhledem k uvedenému detekčnímu místu;
    uvádějící ve styk aplikační místo s uvedeným krevním vzorkem; a detekující přítomnost analyzované složky v uvedeném krevním vzorku.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená označená látka je látka označená selenem.
  12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený polyaniont je difúzně navázán na chromatografícký nosič ve stejném místě jako uvedená označená látka.
  13. 13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený polykationt je vybrán ze skupiny sestávající z póly-1-lysin hydrobromidu, poly-l-arginin hydrochloridu, poly-1histidinu, poly(lysin, alanin) 3 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, alanin) 2 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, alanin) 1 : 1 hydrobromidu, poly(lysin, tryptofan) 1 :4 hydrobromidu a poly(dialyldimetylamoniumchloridu).
  14. 14. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený polyaniont je vybrán ze skupiny sestávající z dextransulfátu, poly(akrylové kyseliny), poly(sodno-4-styren sulfonátu), poly(vinylsulfonové kyseliny), poly(metylmetakrylové kyseliny), poly-l-aspartové kyseliny a karboxymetylcelulózy.
  15. 15. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že analyzovanou složkou je virus selhání lidské imunity HIV typu 1 nebo virus selhání lidské imunity HIV typu 2.
  16. 16. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že analyzovanou složkou je povrchová protilátka hepatitidy B.
  17. 17. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že analyzovanou složkou je mikroorganismus Treponema pallidum.
CZ20002606A 1998-01-15 1998-12-29 Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku CZ294954B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/007,651 US6673629B2 (en) 1998-01-15 1998-01-15 Neutralization of polycations in a chromatographic device for whole blood use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002606A3 CZ20002606A3 (cs) 2001-02-14
CZ294954B6 true CZ294954B6 (cs) 2005-04-13

Family

ID=21727406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002606A CZ294954B6 (cs) 1998-01-15 1998-12-29 Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku

Country Status (30)

Country Link
US (1) US6673629B2 (cs)
EP (2) EP1371984B1 (cs)
JP (1) JP4270751B2 (cs)
KR (1) KR100575390B1 (cs)
CN (2) CN1125343C (cs)
AR (1) AR014312A1 (cs)
AT (2) ATE244890T1 (cs)
AU (1) AU748387B2 (cs)
BR (1) BR9814007A (cs)
CA (1) CA2318459C (cs)
CO (1) CO5090841A1 (cs)
CZ (1) CZ294954B6 (cs)
DE (2) DE69830675T2 (cs)
DK (2) DK1371984T3 (cs)
ES (2) ES2202931T3 (cs)
HK (1) HK1035027A1 (cs)
HU (1) HU225975B1 (cs)
ID (1) ID26635A (cs)
IL (1) IL136236A (cs)
LT (1) LT2000071A (cs)
MY (1) MY129171A (cs)
NO (1) NO327714B1 (cs)
NZ (1) NZ504710A (cs)
PL (1) PL196464B1 (cs)
PT (2) PT1047943E (cs)
TR (1) TR200002051T2 (cs)
TW (1) TW594012B (cs)
UY (1) UY25351A1 (cs)
WO (1) WO1999036781A1 (cs)
ZA (1) ZA9811953B (cs)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100513216B1 (ko) * 2000-06-28 2005-09-07 마츠시타 덴끼 산교 가부시키가이샤 바이오센서
WO2002037099A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-10 International Reagents Corporation Procede de diagnostic de la nephropathie
JP2002303629A (ja) * 2001-04-06 2002-10-18 Matsushita Electric Ind Co Ltd 免疫クロマトデバイス及びそれを用いた被検物質測定方法
US6841159B2 (en) * 2002-01-30 2005-01-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Rapid lateral flow assay for determining exposure to Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria
EP1547606A4 (en) * 2002-08-02 2006-07-12 Emi Sumida PROCESS FOR PREPARING PLASMA RICH IN PLATELETS
JP2006520190A (ja) * 2003-01-21 2006-09-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム
ES2366646T3 (es) * 2003-11-05 2011-10-24 Elan Pharma International Limited Composiciones en forma de nanopartículas que tienen un péptido como estabilizante superficial.
SE0400662D0 (sv) * 2004-03-24 2004-03-24 Aamic Ab Assay device and method
SE527036C2 (sv) * 2004-06-02 2005-12-13 Aamic Ab Analysanordning med reglerat flöde och motsvarande förfarande
GB0417601D0 (en) * 2004-08-06 2004-09-08 Inverness Medical Switzerland Assay device & method
CN101048663B (zh) * 2004-09-23 2015-04-01 三路影像公司 用于固定生物样品的聚阳离子聚合物涂层
US7816122B2 (en) * 2005-10-18 2010-10-19 Idexx Laboratories, Inc. Lateral flow device with onboard reagents
DE102005056592A1 (de) * 2005-11-25 2007-05-31 Basf Ag Herstellung und Verwendung von hochfunktionellen, hoch-oder hyperverzweigten Polylysinen
US7618810B2 (en) * 2005-12-14 2009-11-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Metering strip and method for lateral flow assay devices
US20080023395A1 (en) * 2006-07-31 2008-01-31 Sigma Aldrich Co. Compositions and Methods for Isolation of Biological Molecules
JP5386354B2 (ja) * 2006-09-08 2014-01-15 ワイス・エルエルシー アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製におけるアルギニン洗浄
EA016156B1 (ru) * 2006-11-29 2012-02-28 Микросенс Медтек Лимитед Захват микроорганизмов, подобных микобактериям
GB0623866D0 (en) * 2006-11-29 2007-01-10 Wilson Stuart M Capture of mycobacteria like micro-organisms
WO2008124021A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-16 Clavina Diagnostics, Inc. Method of detecting red cell antigen-antibody reactions
CN101750244B (zh) * 2008-10-13 2014-03-12 艾博生物医药(杭州)有限公司 一种分离血液样本中红细胞的方法以及运用
EP2269737B1 (en) 2009-07-02 2017-09-13 Amic AB Assay device comprising serial reaction zones
KR100946566B1 (ko) * 2009-11-18 2010-03-11 주식회사 인포피아 측방 유동 면역 분석 디바이스
US20120302456A1 (en) * 2010-11-23 2012-11-29 President And Fellows Of Harvard College Vertical flow-through devices for multiplexed elisa driven by wicking
US9885707B2 (en) 2012-03-30 2018-02-06 Sekisui Medical Co., Ltd. Immunochromatographic test strip and detection method using immunochromatography for detecting object in red blood cell-containing sample
WO2013147308A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法
JP6399632B2 (ja) * 2013-10-02 2018-10-03 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー
EP3057600B1 (en) 2013-10-18 2019-03-13 Fortus Medical, Inc. Method of preparing a bone marrow aspirate enhanced bone graft
EP3236261B1 (en) * 2014-12-16 2020-09-09 Sekisui Medical Co., Ltd. Test strip for use in immunochromatography for detecting analyte in sample containing red blood cells, and immunochromatography using said test strip
WO2016183017A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Fortus Medical, Inc. Bone fragment and tissue harvesting system
JP6675834B2 (ja) 2015-05-21 2020-04-08 デンカ生研株式会社 イムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法
AU2017207860A1 (en) * 2016-01-15 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Method for detecting an analyte
JP6738608B2 (ja) * 2016-01-22 2020-08-12 田中貴金属工業株式会社 クロマトグラフ媒体
WO2018049082A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Fortus Medical, Inc. Bone void filler preparation system
EP3568077B1 (en) 2017-01-11 2021-02-24 Cypher Medical, LLC Method of estimating blood volume
US11602588B2 (en) 2017-06-07 2023-03-14 Forcyte Medical, Llc Connective tissue progenitor cell aspiration and processing system
WO2019182788A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 Fortus Medical, Inc. Osteomedullary tissue processing system
CN110308276A (zh) * 2019-06-14 2019-10-08 郑州轻工业学院 一种增加黄曲霉毒素b1胶体金检测试纸条分析灵敏度的样品垫处理液
FI3986588T3 (fi) * 2019-06-20 2024-01-19 UCB Biopharma SRL HPCL pohjainen flokkulaatio aineiden tunnistus proteiini näytteestä
CN110823670B (zh) * 2019-11-27 2023-03-24 香港大德昌龙生物科技有限公司 用于分离血细胞的组合物、血细胞分离方法、检测试剂盒和检测装置
CA3230920A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Jason J. SUN Agglutinating agents, devices and methods for whole blood assays

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4308232A (en) * 1979-07-09 1981-12-29 Sherwood Medical Industries Inc. Anticoagulant stopper coating
DE3029579C2 (de) * 1980-08-05 1985-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Mittel zur Abtrennung von Plasma oder Serum aus Vollblut
US5073484A (en) 1982-03-09 1991-12-17 Bio-Metric Systems, Inc. Quantitative analysis apparatus and method
US4594327A (en) 1983-11-02 1986-06-10 Syntex (U.S.A.) Inc. Assay method for whole blood samples
US4678757A (en) * 1985-04-11 1987-07-07 Smithkline Diagnostics, Inc. Device and method for whole blood separation and analysis
US4806311A (en) * 1985-08-28 1989-02-21 Miles Inc. Multizone analytical element having labeled reagent concentration zone
US4935147A (en) * 1985-12-20 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle separation method
US4753776A (en) 1986-10-29 1988-06-28 Biotrack, Inc. Blood separation device comprising a filter and a capillary flow pathway exiting the filter
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
EP0325413A3 (en) 1988-01-19 1990-10-24 Syntex (U.S.A.) Inc. Method and device for separating plasma from red cells
US5459080A (en) * 1988-01-29 1995-10-17 Abbott Laboratories Ion-capture assays using a specific binding member conjugated to carboxymethylamylose
US5459078A (en) * 1988-01-29 1995-10-17 Abbott Laboratories Methods and reagents for performing ion-capture digoxin assays
US5670381A (en) 1988-01-29 1997-09-23 Abbott Laboratories Devices for performing ion-capture binding assays
DE3903114A1 (de) * 1989-02-02 1990-08-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung
US4933092A (en) 1989-04-07 1990-06-12 Abbott Laboratories Methods and devices for the separation of plasma or serum from whole blood
US5306623A (en) * 1989-08-28 1994-04-26 Lifescan, Inc. Visual blood glucose concentration test strip
US5435970A (en) * 1989-12-18 1995-07-25 Environmental Diagnostics, Inc. Device for analysis for constituents in biological fluids
US5212060A (en) 1990-04-27 1993-05-18 Genesis Labs, Inc. Dry test strip comprising a dextran barrier for excluding erythrocytes
US5186843A (en) * 1991-07-22 1993-02-16 Ahlstrom Filtration, Inc. Blood separation media and method for separating plasma from whole blood
DE69327891T2 (de) * 1992-07-06 2000-07-20 Terumo Corp Material zur Entfernung von pathogener Substanz und mit diesem Material hergestellter Blutfilter
AU706456B2 (en) 1995-03-27 1999-06-17 Lifescan, Inc. Chemical timer for a direct-reading reagent test strip
US5725774A (en) 1995-04-07 1998-03-10 Lxn Corp. Whole blood separation method and devices using the same
US5753497A (en) * 1995-12-22 1998-05-19 Universal Health Watch Inc Diagnostic assay providing blood separation

Also Published As

Publication number Publication date
DK1371984T3 (da) 2005-10-10
ES2202931T3 (es) 2004-04-01
TW594012B (en) 2004-06-21
DE69816339T2 (de) 2004-06-09
AU2209299A (en) 1999-08-02
TR200002051T2 (tr) 2000-12-21
JP4270751B2 (ja) 2009-06-03
ATE298425T1 (de) 2005-07-15
CZ20002606A3 (cs) 2001-02-14
MY129171A (en) 2007-03-30
EP1371984B1 (en) 2005-06-22
US6673629B2 (en) 2004-01-06
DE69830675D1 (de) 2005-07-28
CA2318459C (en) 2010-12-21
ES2244861T3 (es) 2005-12-16
IL136236A (en) 2005-07-25
PL196464B1 (pl) 2008-01-31
KR100575390B1 (ko) 2006-05-03
US20010006823A1 (en) 2001-07-05
PT1047943E (pt) 2003-11-28
CN1285918A (zh) 2001-02-28
IL136236A0 (en) 2001-05-20
WO1999036781A1 (en) 1999-07-22
DK1047943T3 (da) 2003-11-03
CA2318459A1 (en) 1999-07-22
KR20010034165A (ko) 2001-04-25
HU225975B1 (en) 2008-02-28
PT1371984E (pt) 2005-11-30
EP1047943B1 (en) 2003-07-09
NO20003569D0 (no) 2000-07-11
NO20003569L (no) 2000-09-14
BR9814007A (pt) 2000-10-31
HK1035027A1 (en) 2001-11-09
CN1495428A (zh) 2004-05-12
EP1371984A1 (en) 2003-12-17
ID26635A (id) 2001-01-25
EP1047943A1 (en) 2000-11-02
NZ504710A (en) 2002-05-31
DE69816339D1 (de) 2003-08-14
CN1213303C (zh) 2005-08-03
DE69830675T2 (de) 2006-05-04
AU748387B2 (en) 2002-06-06
PL342658A1 (en) 2001-07-02
HUP0100557A2 (hu) 2001-06-28
ATE244890T1 (de) 2003-07-15
ZA9811953B (en) 1999-06-30
UY25351A1 (es) 1999-09-27
NO327714B1 (no) 2009-09-14
JP2002509254A (ja) 2002-03-26
CO5090841A1 (es) 2001-10-30
LT2000071A (lt) 2000-11-27
CN1125343C (zh) 2003-10-22
AR014312A1 (es) 2001-02-07
HUP0100557A3 (en) 2003-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ294954B6 (cs) Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku
JP7330945B2 (ja) 分析物検出の改善のためのアッセイ法
JP2609438B2 (ja) 検定方法
Grauballe et al. Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques
WO2011062405A2 (ko) 측방 유동 면역 분석 디바이스
EP0106370A2 (en) Specific binding assays utilizing analyte-cytolysin conjugates
US4495296A (en) Labeled anti-hapten antibodies and their use as a universal reagent for solid phase radio- and/or enzyme-immunoassays
JP5775197B1 (ja) 免疫クロマト分析キット及び免疫クロマト分析方法
AU592971B2 (en) Solid phase diffusion assay
EP3339862A1 (en) Immunological detection method and test strip used therefor
JP2017009571A (ja) マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
US20070092978A1 (en) Target ligand detection
US6686167B2 (en) Test device for detecting semen and method of use
CA2266747A1 (en) Diagnostic test devices with improved fluid movement and resistance to interferences
EP4191244A1 (en) Test reagent with ameliorated signal reduction
JP2002214236A (ja) 血中抗原検出方法及び装置
MXPA00006963A (en) Neutralization of polycations in a chromatographic device for whole blood use
JPH0382962A (ja) Ｂ型肝炎ウィルスＣｏｒｅ抗原に対する抗体の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20181229