ES2244861T3 - Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre. - Google Patents
Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre.Info
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Abstract
Un dispositivo de ensayo de cromatografía para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre incluyendo: un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar, un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía, un lugar de detección en dicho soporte de cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento, una sustancia marcada unida de forma difusiva situada en dicho lugar de aplicación, un policatión unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba de dicho lugar de detección, y un polianión unido de forma difusiva para neutralizar el policatión hacia abajo de dicho policatión unido y hacia arriba de dicho lugar de detección.
Description
Dispositivo cromatográfico y procedimiento de
detección de un analito en una muestra de sangre.
La presente invención se refiere a dispositivos
de ensayo de cromatografía y un método de detectar un analito en una
muestra de sangre entera, y más en particular a un dispositivo y
método que emplean un agente separador de glóbulos rojos para
agregar glóbulos rojos, y un agente neutralizante para neutralizar
el efecto negativo que el agente separador de glóbulos rojos pueda
tener en el sistema de ensayo.
Se realizan rutinariamente métodos modernos de
diagnóstico clínico en muestras de sangre. Por desgracia, los
glóbulos rojos interfieren con muchas determinaciones de
diagnóstico. En ensayos de un analito, los glóbulos rojos pueden
inhibir la unión entre elementos específicos del par de unión.
Igualmente, los glóbulos rojos tienen actividad enzimática que,
dependiendo del ensayo empleado, puede interferir con la señal
producida. Además, en un formato de prueba rápida usando un
dispositivo de ensayo de cromatografía, en particular un dispositivo
de inmunoensayo de cromatografía, los glóbulos rojos pueden inhibir
el flujo de fluido que es necesario para que se produzcan reacciones
en el dispositivo. Por esta y otras razones, muchas metodologías de
ensayo se realizan en plasma o suero que primer hay que separar de
una muestra de sangre entera.
Hay muchas técnicas conocidas para separar
glóbulos rojos de plasma en una muestra de sangre entera. La
centrifugación es un método conocido en la técnica por el que se
separa plasma (antes de la coagulación) y suero (después de la
coagulación) de la sangre entera. En este procedimiento, los
glóbulos rojos sedimentan en la parte inferior del tubo de prueba, y
el suero se separa por decantación o algún otro método. Sin embargo,
la estratificación de sangre entera por centrifugación tiene muchas
desventajas. En general, la centrifugación requiere tomar una
muestra grande de sangre. Además, el proceso es lento y requiere
equipo engorroso de laboratorio frecuentemente no mantenido en un
consultorio médico. Finalmente, la manipulación adicional de la
sangre aumenta la exposición a los peligros potenciales de patógenos
transportados en la sangre.
Para reducir o eliminar la necesidad de
centrifugación, se han desarrollado dispositivos de ensayo que
emplean membranas de gradiente o membranas de atrapamiento para
separar glóbulos rojos de la porción líquida de la sangre. También
se han usado anticuerpos antiglóbulos rojos inmovilizados.
Otras técnicas conocidas para separar glóbulos
rojos de plasma o suero incluyen (1) combinar una muestra de sangre
entera con un agente de unión de glóbulos rojos filtrando la mezcla
a través de un elemento bíbulo sólido al que se une al menos un
elemento específico del par de unión para quitar los glóbulos rojos
aglutinados; (2) pasar sangre entera a través de un filtro de
microfibras de vidrio que puede tener o no un agente aglutinante
incorporado; (3) emplear una capa de barrera o exclusión de material
polisacárido para evitar que pasen glóbulos rojos a su través e
interfieran con la detección o visualización de una señal en una
tira de prueba seca; y (4) usar un soporte que tiene una superficie
policatiónica que une glóbulos rojos pero no plasma.
Muchas de estas técnicas para la separación de
glóbulos rojos del plasma son costosas, complicadas, pueden dar
lugar a separación incompleta de glóbulos rojos, y pueden producir
hemolisis. La hemolisis conduce a unión no específica o alto ruido
de fondo que produce una pérdida de la sensibilidad del ensayo. Esto
puede ser el resultado de la hemoglobina libre que puede colorear la
zona de detección de tal manera que la zona pueda obtener un color
del orden de rosa a granate oscuro. Como resultado, la producción de
una señal química visual puede ser oscurecida total o parcialmente
por la presencia del color de la hemoglobina en la zona de
detección. Además, el uso de un agente separador, tal como un
policatión, en un sistema de ensayo tiende a interferir con el
sistema, agregando frecuentemente otros reactivos o elementos de
unión además de los glóbulos rojos.
Por consiguiente, se necesita un dispositivo y
método para detectar un analito en una muestra de sangre sin afectar
adversamente al sistema de ensayo. Dicho dispositivo y método
deberán ser adecuados para muestras de sangre entera de varios
tamaños, incluyendo muestras pequeñas.
La presente invención se refiere a un dispositivo
de cromatografía incluyendo un soporte de cromatografía que define
un recorrido para flujo de fluido capaz de soportar flujo capilar,
un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de
flujo de fluido con el soporte de cromatografía, un lugar de
detección en el soporte de cromatografía separado del lugar de
aplicación, una sustancia marcada unida de forma difusiva situada
hacia abajo del lugar de aplicación, un agente separador de glóbulos
rojos unido de forma difusiva para separar plasma o suero de la
muestra de sangre hacia arriba del lugar de detección, y un agente
neutralizante unido de forma difusiva capaz de unión con el agente
separador hacia abajo del agente separador unido y hacia arriba de
dicho lugar de detección, por lo que se neutraliza una carga
positiva de dicho agente separador. Preferiblemente, el agente
separador de glóbulos rojos está situado en el lugar de aplicación
de manera que los glóbulos rojos se separarán del suero o plasma
antes de que el suero o plasma se baje por el soporte de
cromatografía.
EP-A-0 325 413
describe un dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo
una zona con un reactivo policatiónico unido de forma difusiva
situado hacia arriba del lugar de detección para capturar/separar
glóbulos rojos de suero de plasma. El dispositivo no tiene medios
para neutralizar el exceso de reactivo policatiónico.
US-A-5.670.381 describe un
dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo un reactivo
policatiónico unido de forma no difusiva en la zona de detección, un
reactivo de marcación, y un reactivo de captura que consta de un
conjugado de captura de molécula-polianión, donde la
marca y reactivo de captura están unidos de forma difusiva a la zona
de aplicación de muestra. El reactivo policatiónico tiene la función
de facilitar la migración de conjugado de captura en la zona de
detección. WO-A-96/31270 describe un
dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo una zona con
un poliol unido de forma difusiva situado hacia arriba del lugar de
detección para filtrar glóbulos rojos de suero de plasma.
EP-A-0 735 369 describe una tira de
prueba incluyendo un temporizador químico para minimizar las
lecturas de prueba no fiables debidas a alta coloración de la
muestra.
La presente invención también se refiere a un
método para detectar la presencia de un analito en una muestra,
preferiblemente una muestra de sangre, que incluye disponer un
soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de
fluido capaz de soportar flujo capilar, a lo largo del que hay (a)
un lugar de aplicación para la muestra de sangre en contacto de
flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía, (b) un lugar de
detección en el soporte de cromatografía separado del lugar de
aplicación, (c) una sustancia marcada unida de forma difusiva
situada hacia abajo del lugar de aplicación, (d) un agente separador
de glóbulos rojos unido de forma difusiva para separar plasma o
suero de dicha muestra de sangre hacia arriba del lugar de
detección, y (e) un agente neutralizante unido de forma difusiva
capaz de unión con el agente separador situado hacia abajo del
agente separador unido y hacia arriba del lugar de detección por lo
que una carga positiva del agente separador es neutralizada; poner
el lugar de aplicación en contacto con la muestra de sangre de tal
manera que el agente separador de glóbulos rojos separe el plasma o
suero de la muestra de sangre, y el agente neutralizante neutralice
la carga positiva del agente separador cuando la muestra fluya a lo
largo del recorrido de flujo; y detectar la presencia de analito en
la muestra de sangre.
La figura 1 ilustra una realización preferida del
dispositivo de ensayo de cromatografía de la presente invención.
La presente invención se basa en la observación
de que los glóbulos rojos en muestras de sangre entera interfieren
con las determinaciones de la presencia o cantidad de analito en una
muestra de sangre que de otro modo se podrían realizar fácilmente
mediante sistemas de ensayo. Por ejemplo, en un inmunoensayo, es
improbable que una muestra de sangre entera en contacto con un lugar
de aplicación baje por la tira mediante acción capilar debido a la
presencia obstaculizante o interferente de los glóbulos rojos. La
presente invención supera este problema sin interferir con la
sensibilidad del sistema de ensayo.
Las definiciones siguientes pueden ser útiles
para comprender las realizaciones de la presente invención.
"Analito" o "analito de interés" se
refiere al compuesto o la composición a detectar o medir, que tiene
al menos un epítopo o lugar de unión. El analito puede ser cualquier
sustancia para la que existe un elemento natural de unión específico
de analito o para el que se puede preparar un elemento de unión
específico de analito. Los analitos incluyen, aunque sin limitación,
toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos,
aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas,
medicamentos (incluyendo los administrados a efectos terapéuticos
así como los administrados para fines ilícitos), y metabolitos de o
anticuerpos para alguna de las sustancias anteriores. El término
"analito" también incluye cualesquiera sustancias antigénicas,
haptenos, anticuerpos, macromoléculas y sus combinaciones.
"Soporte cromatográfico" se refiere a
cualquier material poroso, absorbente, bíbulo, isotrópico o capilar
adecuado, que incluya el lugar de detección del dispositivo y
mediante el que el analito o la muestra de prueba se pueden
transportar por acción capilar o de mecha. Los expertos en la
técnica apreciarán que el soporte de cromatografía se puede hacer de
un solo material o más de un material (por ejemplo, zonas
diferentes, porciones, capas, zonas o lugares se pueden hacer de
materiales diferentes) a condición de que las capas múltiples estén
en contacto de flujo de fluido una con otra, por lo que es posible
el paso de muestra de prueba entre los materiales. El contacto de
flujo de fluido permite el paso de al menos algunos componentes de
la muestra, es decir analito, entre las zonas del material poroso y
es preferiblemente uniforme a lo largo de la interface de contacto
entre las zonas diferentes. Se puede usar materiales naturales,
sintéticos o naturalmente existentes que están modificados
sintéticamente, como el soporte de cromatografía, e incluyen, aunque
sin limitación: papel (fibroso), o membranas (microporosas) de
materiales de celulosa tal como papel; celulosa y derivados de
celulosa tal como acetato de celulosa y nitrocelulosa; fibra de
vidrio; tela, tanto natural (por ejemplo algodón) como sintética
(por ejemplo nylon); geles porosos; y análogos.
"Marcador" se refiere a cualquier sustancia
que sea capaz de producir una señal que es detectable por medios
visuales o instrumentales. Varias marcas adecuadas para ser
utilizadas en la presente invención incluyen marcas que producen
señales mediante medios químicos o físicos. Los ejemplos incluyen
enzimas y sustratos, cromógenos, compuestos fluorescentes,
compuestos quimiluminiscentes, partículas de color o coloreables de
látex de polímero orgánico, y liposomas u otras vesículas
conteniendo sustancias visibles directamente. En la presente
invención se emplean preferiblemente marcas radiactivas, partículas
metálicas coloidales o partículas no metálicas coloidales. Las
marcas preferidas incluyen partículas coloidales de oro y látex.
"Sustancia marcada" o "conjugado" se
refiere a una sustancia incluyendo una marca detectable unida a un
elemento de unión específico. La unión puede ser unión covalente o
no covalente, y puede incluir hibridación de ácido nucleico. La
marca permite que la sustancia marcada produzca una señal detectable
que está relacionada directa o indirectamente con la cantidad de
analito en una muestra de prueba. El componente elemento de unión
específico de la sustancia marcada se selecciona para unión directa
o indirecta al analito.
"Elemento específico de unión" se refiere a
un elemento de un par de unión específico, es decir, dos moléculas
diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la
segunda molécula mediante medios químicos o físicos. Si el elemento
de unión específico es un inmunorreactivo puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo, antígeno, hapteno, o su complejo, y si se utiliza un
anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una
proteína recombinante o anticuerpo, un anticuerpo quimérico,
mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una
mezcla de un anticuerpo y otros elementos de unión específicos. Los
ejemplos específicos de elementos de unión específicos incluyen
biotina y avidina, un anticuerpo y su antígeno correspondiente (que
no tienen relación con una muestra a analizar), un ácido nucleico de
cadena única y su complemento, y análogos.
"Sustancia de atrapamiento" se refiere a uno
o varios elementos de unión específicos que están unidos dentro o en
una porción del soporte cromatográfico para formar uno o varios
"lugares de captura" donde el analito, reactivo marcado, y/o
reactivo de control se inmovilizan en el soporte de cromatografía.
El método de unión no es crítico para la presente invención. La
sustancia de atrapamiento facilita la observación de la señal
detectable separando sustancialmente el analito y/o la sustancia
marcada de reactivos de ensayo no unidos y los componentes restantes
en la muestra de prueba. La sustancia de atrapamiento se puede
inmovilizar en el soporte de cromatografía antes o durante la
realización del ensayo por medio de cualquier método de unión
adecuado. Además, la sustancia de atrapamiento se puede prever en un
solo lugar de detección o en lugares múltiples sobre o en el soporte
de cromatografía. La sustancia de atrapamiento también puede estar
dispuesta en varias configuraciones para producir diferentes
formatos de detección o medición. Por ejemplo, la sustancia de
atrapamiento se puede configurar como una letra, número, icono o
símbolo, o cualquier combinación de los mismos.
En particular, la presente invención proporciona
un dispositivo de ensayo de cromatografía para detectar la presencia
de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre.
El dispositivo tiene preferiblemente forma de una tira
cromatográfica que tiene un soporte cromatográfico que define un
recorrido para flujo de fluido y que es capaz de soportar flujo
capilar, un lugar de aplicación para la muestra de sangre, y un
lugar de detección separado del lugar de aplicación para detectar la
presencia o cantidad de analito presente en la muestra de sangre.
Preferiblemente, el dispositivo también incluye una sustancia
marcada (o conjugado) unida de forma difusiva al soporte
cromatográfico. En una realización preferida, la sustancia marcada
se unirá al analito o competirá con el analito por la unión en el
lugar de detección. El dispositivo contiene preferiblemente dos
agentes adicionales unidos de forma difusiva al soporte
cromatográfico: (1) un agente separador de glóbulos rojos hacia
arriba (en adelante, la dirección del movimiento de una muestra
producido por acción capilar se denomina "hacia abajo" y la
dirección contraria se denomina "hacia arriba") del lugar de
detección que es capaz de separar plasma o suero de la muestra de
sangre, y (2) un agente neutralizante hacia abajo del agente
separador de glóbulos rojos y hacia arriba del lugar de detección
para neutralizar cualquier efecto, en particular un efecto adverso,
del agente separador de glóbulos rojos en el sistema de
cromatografía.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "unido de forma difusiva" aplicada a un reactivo dado
se puede definir como cualquier reactivo utilizado en la presente
invención, incluyendo, aunque sin limitación, una sustancia marcada,
elemento de unión específico, agente separador de glóbulos rojos o
agente neutralizante, para denotar que el (los) reactivo(s)
está(n) unido(s) de una forma que permite que el (los)
reactivo(s) unido(s) fluyan a lo largo del recorrido
de flujo.
A los efectos de la presente invención, se puede
emplear cualquier sistema de ensayo. Se prefieren sistemas de
inmunoensayo, incluyendo, aunque sin limitación, sistemas de flujo
lateral, sistemas de flujo vertical, sistemas de impregnación, y
varillas de inmersión. A continuación se expone una descripción
general de sistemas de ensayo conocidos.
En general, en una tira de cromatografía, se
dispone al menos un lugar de aplicación de muestra y un lugar de
detección en un soporte de cromatografía. Una solución de muestra,
en este caso preferiblemente una muestra de sangre, sospechosa de
tener un analito de interés, es decir un analito, se mueve a través
del soporte de cromatografía por acción capilar cuando se añade al
lugar de aplicación de muestra, y una sustancia marcada o conjugado
que se contiene en un medio marcador dispuesto en un soporte de
cromatografía con anterioridad se acumula en el lugar de detección
en proporción directa o inversa a la presencia o cantidad de la
sustancia a analizar en la solución de muestra, efectuada por una
reacción de unión (tal como una reacción inmunológica), de manera
que la presencia o cantidad de sustancia a analizar en la solución
de muestra se pueda hallar midiendo la presencia o cantidad de la
sustancia marcada o conjugado así acumulado. Se conocen varios tipos
de tiras de cromatografía, y todas estas tiras de cromatografía
conocidas, incluyendo las que se describirá más adelante, se pueden
usar en la presente invención. El término "dispositivo de ensayo
de cromatografía" en el sentido en que se usa aquí significa una
tira de cromatografía que se produce de tal forma que se pueda usar
en un ensayo y sea capaz de almacenar y transportar.
A continuación se describe un ejemplo típico de
una tira de cromatografía. Un lugar de aplicación de muestra puede
estar situado en el mismo lugar donde la sustancia marcada está
presente, preferiblemente en una posición hacia arriba de la
sustancia marcada. Cuando una solución de muestra, sospechosa de
contener un analito a analizar, se pone en contacto con el lugar de
aplicación de muestra, la solución de muestra se mueve a través del
soporte de cromatografía en la dirección hacia abajo junto con el
analito por acción capilar. Típicamente, el analito es un compuesto
que se une de forma específica a una sustancia de atrapamiento
fijada al lugar de detección, o es un compuesto que se une de forma
específica a un conjugado que se une específicamente a la sustancia
de atrapamiento en el lugar de detección. Por ejemplo, el analito es
un anticuerpo cuando la sustancia de atrapamiento es un antígeno o
el conjugado contiene un antígeno, y el analito es un antígeno
cuando la sustancia de atrapamiento es un anticuerpo o el conjugado
contiene un anticuerpo. Como otro ejemplo, el analito puede ser un
ácido nucleico que se une a un conjugado y sustancia de atrapamiento
complementario.
Cuando el lugar de aplicación de muestra está
situado en una posición hacia arriba a una sustancia marcada, la
sustancia marcada se puede disponer junto al lugar de aplicación de
muestra o en una posición desconectada del lugar de aplicación de
muestra.
La adición de la sustancia marcada se puede
efectuar por varios medios, por ejemplo añadiéndola a una cierta
posición fuera del lugar de detección de la tira de cromatografía
después de la adición de la solución de muestra.
Puesto que la sustancia marcada está dispuesta de
tal manera que se mueva por la acción capilar de la solución de
muestra, la sustancia marcada se mueve en la dirección hacia abajo
cuando la solución de muestra se añade a los medios de adición de
muestra.
El lugar de detección está situado en general en
una posición hacia abajo de la sustancia marcada y a una cierta
distancia de la sustancia marcada. En el lugar de detección, una
sustancia de atrapamiento que se une solamente a un analito o un
conjugado de forma específica, o se une específicamente a cada una
de las sustancias a analizar y una sustancia marcada, está fijado al
soporte de cromatografía. En consecuencia, en una realización el
analito (enlazado a veces a una sustancia marcada), movido por
acción capilar de la solución de muestra, se une a la sustancia de
atrapamiento o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de
atrapamiento. La sustancia marcada se une a la sustancia a analizar
así unida, efectuando por ello acumulación de la sustancia marcada
en los medios detectores en respuesta a la presencia o cantidad del
analito. Alternativamente, la sustancia marcada y el analito, movido
por acción capilar, se unen de forma competitiva a la sustancia de
atrapamiento o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de
atrapamiento, efectuando por ello acumulación de la sustancia
marcada en proporción inversa a la cantidad de sustancia a
analizar.
Hay un caso en el que una cierta sustancia
marcada se une tanto a una sustancia de atrapamiento (o un conjugado
que a su vez se une a una sustancia de atrapamiento) y un analito,
pero no simultáneamente y, en ese caso, el analito se une en primer
lugar a la sustancia marcada y la sustancia marcada restante que no
se unió a la sustancia a analizar se une a la sustancia de
atrapamiento. En consecuencia, la presencia o cantidad del analito
se puede analizar midiendo la sustancia marcada acumulada en los
medios detectores.
Según requiera la ocasión, varias sustancias
están situadas hacia arriba del lugar de detección. Por ejemplo, un
conjugado puede estar situado de forma móvil.
En algunos casos, se puede disponer uno o varios
lugares de detección adicionales hacia abajo del primer lugar de
detección. Además, hacia abajo del lugar de detección puede haber
otra extensión del soporte de cromatografía de manera que una
solución de muestra se pueda descargar completamente o el soporte
pueda estar equipada con un material para uso en la absorción de la
solución de muestra.
Así, la presencia o cantidad de un analito de
interés en una solución de muestra se puede hallar midiendo la
presencia o cantidad de una sustancia marcada acumulada en el lugar
de detección. En un caso, esto se puede llevar a cabo
visualmente.
La presente invención pretende usarse con
cualquier muestra de sangre, incluyendo suero y plasma, pero se usa
preferiblemente con una muestra de sangre conteniendo glóbulos
rojos, por ejemplo, sangre entera.
Antes de analizar el analito de interés en la
muestra de sangre, los glóbulos rojos se quitan preferiblemente si
el ensayo ha de operar con la sensibilidad deseada. Así, según la
presente invención, se une un agente separador de glóbulos rojos al
soporte de cromatografía. Preferiblemente, el agente separador de
glóbulos rojos está unido de forma difusiva al soporte de
cromatografía. El agente separador de glóbulos rojos puede unirse al
soporte de cromatografía en cualquier posición que sirva para
separar los glóbulos rojos del plasma o suero. Es preferible unir de
forma difusiva el soporte cromatográfico hacia arriba del lugar de
detección. Muy preferiblemente el agente separador de glóbulos rojos
está unido de forma difusiva en el lugar de aplicación de muestra.
Esta posición es preferible porque produce agregado de los glóbulos
rojos tan pronto como se aplican al soporte de cromatografía dando
lugar a mínima, o nula, interferencia en el flujo del suero o plasma
a lo largo del soporte por acción capilar.
El agente separador de glóbulos rojos de la
presente invención puede ser cualquier sustancia capaz de agregar
glóbulos rojos. Los agentes preferidos son materiales de carga
positiva tal como policationes, incluyendo por ejemplo, hidrobromuro
de poli-L-lisina; cloruro de
poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100, Merquat® 280,
Merquat® 550); hidrocloruro de
poli-L-arginina;
poli-L-histidina;
poli(4-vinilpiridina), hidrocloruro de
poli(4-vinilpiridina);
poli(4-vinilpiridina) entrecruzada, sal
cuaternaria de cloruro de metilo;
poli(4-vinilpiridina-co-estireno);
poli(4-vinilpiridinio poli(fluoruro de
hidrógeno)); poli(sulfonato de
4-vinilpiridinio-P-tolueno);
poli(4-vinilpiridinio-tribromuro);
poli(metacrilato de
4-vinilpirrolidona-co-2-dimetilaminoetilo);
poli vinilpirrolidona, entrecruzada; poli vinilpirrolidona,
poli(melamina-co-formaldehído);
parcialmente metilada; bromuro de hexadimetrina; poli(Glu,
Lys) 1:4 hidrobromuro; poli(Lys, Ala) 3:1 hidrobromuro;
poli(Lys, Ala) 2:1 hidrobromuro;
poli-L-lisina succinilada;
poli(Lys, Ala) 1:1 hidrobromuro; y poli(Lys, Trp) 1:4
hidrobromuro. El policatión más preferido es cloruro de
poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100).
El agente separador de glóbulos rojos de la
presente invención se puede usar en cualquier cantidad adecuada que
sirva para separar los glóbulos rojos del resto de la muestra.
Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos puede estar
presente en una concentración de desde aproximadamente 0,04% a
aproximadamente 1,3% (peso por volumen), siendo más preferido desde
aproximadamente 0,13% a aproximadamente 0,33% (peso por volumen), y
aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,33% (peso por
volumen).
Una carga positiva en el agente separador de
glóbulos rojos tiene tendencia a agregar cualquier agente con carga
negativa presente en la tira. Por ejemplo, una sustancia marcada o
conjugado unido al soporte de cromatografía también puede ser
agregada por el agente separador de glóbulos rojos que interfiere
con la unión del analito al conjugado o, en un ensayo competitivo,
la unión de la sustancia marcada y el analito de interés a la
sustancia de atrapamiento al lugar de detección o un conjugado. En
último término, la sensibilidad y exactitud del sistema de
inmunoensayo puede estar en peligro.
Por consiguiente, cuando el agente separador de
glóbulos rojos es un material de carga positiva, la presente
invención emplea preferiblemente un agente de neutralización. El
agente de neutralización es capaz de neutralizar la carga positiva
del agente separador de glóbulos rojos, eliminando por ello o al
menos minimizando toda la interferencia al sistema de ensayo
producido por el agente separador de glóbulos rojos.
Preferiblemente, el agente de neutralización está unido de forma
difusiva al soporte cromatográfico. El agente neutralizante puede
estar unido de forma difusiva en cualquier posición en el soporte
cromatográfico donde funcionará para neutralizar un agente separador
de glóbulos rojos, pero está situado preferiblemente hacia abajo del
agente separador de glóbulos rojos y hacia arriba del lugar de
detección, y más preferiblemente está situado en el mismo lugar en
la cromatografía como la sustancia marcada de forma difusiva.
El agente neutralizante puede ser cualquier
polianión capaz de neutralizar la carga positiva del agente
separador de glóbulos rojos. Los polianiones preferidos incluyen
poli(ácido acrílico), poli(ácido acrílico, sal Na), poli(ácido metil
metacrílico), poli(sulfonato de
Na-4-estireno), poli(ácido vinil
sulfónico), ácido poli-L-aspártico,
y carboximetil celulosa, siendo el más preferido sulfato de
dextrano.
El agente de neutralización puede estar presente
en cualquier cantidad que sirva para neutralizar la carga positiva
del agente separador de glóbulos rojos. En general, la concentración
del agente de neutralización depende de la concentración del agente
separador de glóbulos rojos que se use. Preferiblemente, el agente
neutralizante está presente en una concentración de desde
aproximadamente 0,33% a aproximadamente 20% (peso por volumen),
siendo más preferido de aproximadamente 0,34% a aproximadamente 10%
(peso por volumen) y siendo más preferido de 0,34% a 10% (peso por
volumen).
La figura 1 ilustra una realización de un
dispositivo de ensayo inmunocromatográfico según la presente
invención. El dispositivo 10 incluye un soporte de cromatografía 20.
En el soporte de cromatografía 20 hay un lugar de aplicación 30 para
la muestra de sangre. En esta realización preferida, el agente
separador de glóbulos rojos, es decir, Merquat® 100, está situado en
el lugar de aplicación 30. Junto al lugar de aplicación 30 hay una
compresa de conjugado 40 conteniendo el conjugado, es decir
sustancia de unión marcada con selenio y un agente neutralizante, es
decir, sulfato de dextrano. más hacia abajo está el lugar de
detección 50 que, después de realizar el ensayo, exhibirá una barra
de control 60 y si la sustancia a analizar está presente, una barra
de prueba 70.
En otra realización de la presente invención, se
puede poner una solución tampón en contacto con el lugar de
aplicación, preferiblemente después de haber puesto el lugar de
aplicación en contacto con la muestra. La solución tampón contribuye
a mantener una tasa aceptable de flujo de fluido a lo largo del
recorrido de flujo en el soporte cromatográfico. La solución tampón
puede ser cualquier sustancia que sea capaz de fluir por acción
capilar a lo largo del recorrido de flujo de fluido incluyendo,
aunque sin limitación, solución tampón de fosfato, solución tampón
salina de fosfato, solución tampón de tris-HCl,
solución tampón de carbonato, solución tampón de citrato, solución
tampón HEPES (ácido
2-hidroxipiperacina-N'-2-etanosulfónico),
solución tampón MOPS (ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico), solución
tampón MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico), y
análogos. Aunque la concentración y el pH pueden ser cualquier
concentración y pH que funcionen en el dispositivo de ensayo
deseado, preferiblemente la molaridad está en un rango de desde
aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM y el pH es desde
aproximadamente 5-9 y más preferiblemente desde
aproximadamente 6-8. Muy preferiblemente, la
solución tampón empleada es 50 mM solución tampón de fosfato, pH
7,4.
El volumen de fluido empleado en la presente
invención depende del tamaño del dispositivo. Deseablemente, se
utiliza suficiente volumen de fluido para permitir el flujo de
fluido a través del dispositivo al lugar de detección.
Preferiblemente, el volumen de fluido está en un rango de
aproximadamente 25 \mul a aproximadamente 100 \mul, y más
preferiblemente desde aproximadamente 40 \mul a aproximadamente 60
\mul. Por consiguiente, la solución tampón, cuando sea necesario,
se puede añadir en un rango de volumen de desde aproximadamente 10
\mul a aproximadamente 40 \mul, y más preferiblemente desde
aproximadamente 20 \mul a aproximadamente 30 \mul.
La presente invención también se refiere a un
método para detectar la presencia de un analito en una muestra de
sangre. Preferiblemente, el método emplea el dispositivo de
inmunoensayo de cromatografía de la presente invención.
Específicamente, el método incluye (1) disponer un soporte de
cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido capaz de
soportar flujo capilar, a lo largo del que hay un lugar de
aplicación para la muestra de sangre que está en contacto de fluido
con el soporte de cromatografía, un lugar de detección en el soporte
de cromatografía separado del lugar de aplicación, una sustancia
marcada de forma difusiva (o un conjugado) que se une a o compite
con el analito para unión en el lugar de detección, un agente
separador de glóbulos rojos unido de forma difusiva para separar
plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba del lugar de
detección, y un conjugado unido al soporte de cromatografía; (2)
contactar el lugar de aplicación con la muestra de sangre de tal
manera que el agente separador de glóbulos rojos separe los glóbulos
rojos del plasma o suero de la muestra de sangre, y el agente
neutralizante neutralice la carga positiva del agente separador; y
(3) detectar la presencia de analito en la muestra de sangre.
Preferiblemente, el agente separador de glóbulos
rojos es un material de carga positiva y el recorrido de flujo de
fluido contiene un agente neutralizante unido de forma difusiva, que
es capaz preferiblemente de unión con dicho agente separador de
glóbulos rojos y está situado hacia abajo de dicho agente separador
de glóbulos rojos y hacia arriba de dicho lugar de detección por lo
que la carga positiva de dicho agente separador es neutralizada.
Así, en la realización preferida de la figura 1,
se aplica una muestra de sangre al lugar de aplicación 30 y el
agente separador de glóbulos rojos separa los glóbulos rojos
agregándolos y permitiendo que el plasma o suero baje por acción
capilar por el soporte cromatográfico 20. El agente neutralizante en
la compresa de conjugado 40 neutraliza los efectos del agente
separador de glóbulos rojos en el dispositivo 10 y el conjugado y el
analito se une al conjugado presente en la compresa de conjugado 40.
El analito unido al conjugado sigue moviéndose hacia abajo al lugar
de detección 50. Si el analito de interés está presente, aparecerá
la barra de prueba 70. Para indicar que la prueba está funcionando
adecuadamente, la barra de control 60 aparecerá tanto si el analito
de interés está presente como si no.
La presente invención puede incluir
preferiblemente una cubierta o recinto no reactivo alrededor del
dispositivo. Preferiblemente, la cubierta encierra al menos el
soporte de cromatografía para evitar el contacto y la contaminación
de los lugares de captura. La cubierta también puede incluir una
zona elevada adyacente al lugar de aplicación para facilitar la
recepción y/o la contención de un cierto volumen de la muestra.
Además, la cubierta puede incluir una zona o zonas cortada(s)
en forma de una letra, número, icono, o símbolo, o cualquier
combinación de los mismos. En esta realización, la zona o zonas
cortadas forman el diseño para lugar(es) de detección
particular(es) cuando la tira se cierra completamente. Se
prefiere que una porción suficiente de la tira esté encerrada para
evitar que la muestra aplicada contacte los lugares de detección sin
pasar primero a través de una porción de la tira.
El dispositivo y método de la presente invención
se pueden usar en cualquier sistema de ensayo en el que una muestra
de sangre contenga un analito de interés. Los ejemplos de sistemas
preferidos incluyen, aunque sin limitación, virus de la hepatitis C
("HCV"), virus de la hepatitis A ("HAV"), virus de la
inmunodeficiencia humana ("VIH"), anticuerpo de superficie de
hepatitis B ("HBsAb"), antígeno de superficie de hepatitis B
("HBsAg"), anticuerpo de núcleo de hepatitis B ("HBcAb"),
antígeno de núcleo de hepatitis B ("HBcAg"), antígeno
carcinoembriónico ("CEA"), alfa-fetoproten
("AFP"), un marcador de cáncer pancreático
("CA19-9"), sífilis, tuberculosis, malaria,
Leishmania, y fiebre Dengue.
Los ejemplos siguientes ilustran mejor la
presente invención, pero no se deberán interpretar, de ninguna
forma, como limitativos de su alcance.
A los efectos de la presente invención, se desea
la agregación de glóbulos rojos (RBC) en sangre entera mientras que
no se desea la agregación del conjugado de selenio. Se comprobaron
varios policationes para ver cuál originaría suficiente agregación
de RBC aunque agregando sólo únicamente el conjugado de selenio.
Se preparó conjugado de selenio de proteína
recombinante VIH-1 de la siguiente manera: En primer
lugar, se preparó selenio coloidal reaccionando 32 mM óxido de
selenio con 91 mM ácido L-ascórbico en una solución
acuosa durante 72 horas a 42ºC. Este selenio coloidal se diluyó a
una densidad óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm y después
reaccionó con 40 \mul/ml de proteína envolvente de
VIH-1 recombinante en 30 mM solución tampón Tris, pH
7,4 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este conjugado de
proteína de VIH-1 marcado con selenio coloidal se
diluyó posteriormente a una densidad óptica de 30 a una longitud de
onda de 550 nm en 10 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo
0,1% caseína, e incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La
solución conjugada se centrifugó posteriormente a 1970 x g durante
20 minutos a 4ºC, se quitó el supernadante y se desechó el pelet.
Posteriormente se añadió al supernadante un volumen de 30 mM
solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 2% caseína, equivalente a
una décima parte del volumen del supernadante. Finalmente, esta
solución conjugada se diluyó a una densidad óptica de 10 a una
longitud de onda de 550 nm en 50 mM solución tampón Tris, pH 7,4
conteniendo 1% caseína, 2% sacarosa y 2% lactosa.
Se prepararon soluciones acuosas de los
policationes siguientes a 0,25% (p/v): hidrobromuro de
Poli-L-Lisina, peso molecular (p.m.)
37000; hidrocloruro de
Poli-L-Arginina, p.m. 12100, 42400 y
92000; Poli-L-Histidina, p.m. 18400;
bromuro de hexadimetrina, Poli-Lisina, Alanina) 3:1
hidrobromuro, p.m. 35000; Poli (Lisina, Alanina) 2:1 hidrobromuro,
p.m. 49300; Poli (Lisina, Alanina) 1:1 hidrobromuro, p.m. 41600,
Poli (Lisina, triptófano) 1:4 hidrobromuro, p.m. 38000 (Todos los
policationes anteriores se adquirieron de Sigma, St. Louis, MO);
Poli(cloruro de dialildimetilamonio), p.m. 10^{5} a
10^{6} (Merquat®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).
La capacidad de estos policationes de agregar RBC
en sangre entera o el conjugado de selenio se observaron en
reacciones separadas añadiendo 350 \mul de 0,25% de las varias
soluciones de policationes a un volumen igual de sangre entera o el
conjugado de selenio. Las soluciones se mezclaron y almacenaron a
temperatura ambiente durante 10 minutos, posteriormente se evaluó
visualmente la agregación. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Más (+) indica agregado débil, 2+ indica agregado moderado, y 3+ y
4+ indican agregado intenso.
Agregación | |||
Policatión | Peso | Glóbulos | Conjugado |
molecular | rojos | de Se | |
Poli-L-Lys HBr | 37000 | 2+ | 2+ |
Merquat®-100 | 10^{5} a 10^{6} | 2+ | 2+ |
Poli-L-Arg HCl | 12100 | 2+ | 2+ |
Poli-L-Arg HCl | 42400 | 2+ | 2+ |
Poli-L-Arg HCl | 92000 | 2+ | 2+ |
Poli-L-His | 18400 | + | 4+ |
Hexadimetrina Br | + | + | |
Poli (Lys, Ala) 3:1 HBr | 35000 | 2+ | 2+ |
Poli (Lys, Ala) 2:1 HBr | 49300 | + | 2+ |
Poli (Lys, Ala) 1:1 HBr | 41600 | + | 2+ |
Poli (Lys, Trp) 1:4 HBr | 38000 | 3+ | 3+ |
Un policatión que produzca agregación de RBC (2+
o más) produciendo al mismo tiempo mínima agregación de conjugado de
selenio (2+ o menos) sería una buena opción. Los policationes con 2+
en ambas categorías encajan en estos criterios.
Poli-L-Lisina HBr y Merquat®-100 se
eligieron para trabajo adicional, siendo Merquat®-100 el de costo
más razonable.
Usando
Poli-L-Lisina como el reactivo de
agregación de RBC por policatión, se comprobaron varias
concentraciones del polianión sulfato de dextrano para ver si la
carga positiva del policatión podría ser neutralizada por el sulfato
de dextrano, evitando así la agregación del conjugado de selenio
producida por el policatión. El sulfato de dextrano se añadió
después de que el policatión ya había hecho que se produjese
agregación de los RBC, pero antes de la interacción del policatión
con el conjugado de selenio. El experimento siguiente evaluó el
efecto del policatión y sulfato de dextrano en la agregación del
conjugado de selenio y su posterior capacidad de fluir a lo largo de
la tira de inmunocromatografía.
Se montó una tira de inmunocromatografía,
compuesta de una compresa de muestra, una compresa de
neutralización, una compresa de conjugado, y una tira de detección.
La compresa de muestra se preparó impregnando un filtro de fibra de
vidrio de 4 mm de ancho por 20 mm de largo (Lypore 9524, Lydall,
Rochester, NH) en una solución acuosa de 0,33% hidrobromuro de
Poli-L-Lisina, p.m. 37000 (Sigma,
St. Louis, MO), secándola posteriormente bajo vacío.
Se prepararon compresas de neutralización,
conteniendo diferentes concentraciones de sulfato de dextrano,
impregnando filtros de 4 mm de ancho por 13 mm de largo hechos de
pasta de madera y poliéster (Sontara 8801, Dupont, Wilmington,
Delaware) en soluciones acuosas conteniendo 0%, 1,1%, 3,3% o 10%
sulfato de dextrano, p.m. 5000 (Sigma, St. Louis, MO). Las compresas
se secaron bajo vacío después de la impregnación.
La compresa de conjugado se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo
(Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en conjugado de proteína
recombinante de VIH-1 marcado con selenio coloidal
preparado y diluido como en el Ejemplo 1. La compresa de conjugado
se secó bajo vacío después de la impregnación.
La tira de detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo (catálogo
#H9643G1, Millipore, Bedford, MA). Se añadió antígeno de envuelta de
VIH-1 a una concentración de 5 mg/ml en 100 mM
solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 1% sacarosa a la membrana
de nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una
posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La
región recubierta se reforzó con laminado de poliéster (código #
7733, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA). Se dejó secar
suficientemente para fijar el antígeno a la nitrocelulosa.
Se montaron tiras de inmunocromatografía, de 4 mm
de ancho, usando los componentes anteriores colocándolos extremo con
extremo longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm entre cada
sección, con la compresa de muestra de 20 mm de largo en un extremo,
junto a la que se colocó una de las compresas de neutralización de
13 mm de largo, seguido de una compresa de conjugado de 4,3 mm de
largo, y finalmente una tira de detección de 40 mm de largo. La tira
montada se cubrió posteriormente con laminado de poliéster (código
#8648, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA) desde la parte
superior de la tira de detección a 10 mm de la parte inferior de la
tira, dejando expuestos aproximadamente 10 mm de la compresa de
muestra. A continuación se aplicaron 80 \mul de plasma a las
compresas de muestra de cada una de las tiras de inmunocromatografía
conteniendo compresas de neutralización con 0%, 1,1%, 3,3% o 10%
sulfato de dextrano. La agregación del conjugado de selenio rojo y
la capacidad del conjugado de fluir a lo largo de la tira se
observaron visualmente.
Los resultados, expuestos en la Tabla 2
siguiente, indicaron que, sin la presencia de sulfato de dextrano
para neutralizar la carga de la solución de policationes, el
conjugado de selenio se agregaba y no era capaz de fluir a lo largo
de la tira. Había una relación inversa entre agregación de conjugado
y flujo, siendo suficientes las concentraciones de sulfato de
dextrano de 3,3% o más para evitar la agregación de conjugado y
permitir el flujo del conjugado a lo largo de la tira.
Concentración de | Agregación de | Flujo de conjugado |
sulfato de dextrano | conjugado | |
0% | ++ | - |
1,1% | + | +/- |
3,3% | - | + |
10% | - | + |
Para evaluar el efecto del sulfato de dextrano en
la agregación de RBC, se repitió el experimento anterior usando
sangre entera como la muestra con 10% sulfato de dextrano en una
compresa de neutralización de 4,3 mm de largo por 4 mm de ancho.
Después de montar la tira de inmunocromatografía como antes, usando
esta compresa de neutralización, se aplicaron 80 \mul de sangre
entera a la compresa de muestra. Quince minutos más tarde, el
resultado de la agregación de RBC se observó visualmente y se midió
la capacidad del plasma resultante de fluir a lo largo de la tira.
Los RBC se agregaron, reteniéndose en la compresa de muestra, y no
fluyeron por la tira, mientras que el plasma fluyó 33 mm a lo largo
de la tira en 15 minutos. Esto indicó que el policatión en la
compresa de muestra todavía era capaz de producir agregado de los
RBC en toda la muestra de sangre, y que la presencia del polianión,
sulfato de dextrano, en la compresa de neutralización no interfería
con esta agregación de RBC.
Se comprobaron otros polianiones para evaluar su
capacidad de evitar la agregación del conjugado de selenio como en
el Ejemplo 2.A. Se impregnó una compresa de muestra de 15,5 mm de
largo por 4 mm de ancho en una solución acuosa conteniendo 0,26%
Merquat®-100, secándose después a 55ºC. No se utilizaron compresas
de neutralización, y en cambio el conjugado de selenio se diluyó en
10 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 1% caseína, 2%
sacarosa, 2% lactosa y 0%, 1,1% o 3,3% del polianión sulfato de
dextrano, p.m. 5000 (Sigma, St. Louis, MO), o 0%, 0,5%, 1% o 2% de
uno de los polianiones siguientes (todos de Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, WI): Poli (ácido acrílico), p.m. 5000; Poli
(4-estireno-sulfonato de sodio),
p.m. 70.000; Poli (ácido vinil sulfónico, sal de sodio); Poli
(metilo ácido metacrílico), p.m. 9500; Poli (ácido acrílico, sal de
sodio), p.m. 2100. Se impregnaron compresas de conjugado en las
varias soluciones de conjugado de selenio y secaron bajo vacío. La
tira de detección se preparó como en el Ejemplo 2.A., y se montaron
tiras de inmunocromatografía. Posteriormente se aplicó 50 \mul de
plasma a las compresas de muestra de cada una de las tiras de
inmunocromatografía conteniendo compresa de conjugados con los
varios polianiones. La agregación del conjugado de selenio rojo se
observó visualmente. La Tabla 3 muestra la cantidad relativa de
agregado de conjugado visto con las varias concentraciones de
polianiones comprobadas.
Agregación de conjugado de selenio | |||||
Concentración de polianión | |||||
Polianión | 0% | 0,5% | 1-1,1% | 2% | 3,3% |
Sulfato de dextrano | ++ | Nt | + | Nt | - |
Poli(ácido acrílico) | ++ | - | - | - | Nt |
Poli(sulfonato de Na-4-estireno) | ++ | ++ | ++ | + | Nt |
Poli (ácido vinil sulfónico) | ++ | +/- | - | - | Nt |
Poli(ácido metil metacrílico) | ++ | - | - | - | Nt |
Poli(ácido acrílico, sal Na) | ++ | + | +/- | - | Nt |
Nt = no comprobado |
Como antes, el conjugado de selenio se agregó si
no había un polianión presente para neutralizar la carga positiva
del policatión de la compresa de muestra (que es necesario para
agregación de RBC al verificar sangre entera). Todos los polianiones
utilizados en la compresa de conjugado evitaron que tuviese lugar la
agregación de conjugado a al menos una de las concentraciones
comprobadas. Este experimento también mostró que el polianión no se
tenía que aplicar a una compresa separada, sino que se podría
combinar con el conjugado de selenio en la compresa de
conjugado.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía como
en el Ejemplo 2.A., con o sin una compresa de neutralización de
filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo
(Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH). Cuando se utilizó, la compresa
de neutralización se impregnó en una solución acuosa conteniendo
3,3% sulfato de dextrano, secándose posteriormente bajo vacío. En
tiras sin una compresa de neutralización, el conjugado de selenio se
diluyó en 10 mM solución tampón Tris, pH 7,4, conteniendo 1%
caseína, 2% sacarosa, 2% lactosa y 3,3% sulfato de dextrano, y la
compresa de conjugado se impregnó en esta solución secada después
bajo vacío. La compresa de muestra usada era como en el Ejemplo
2.A., a excepción de que se impregnó en una solución acuosa de 0,2%
Merquat®-100.
Se diluyó suero humano conteniendo anticuerpos
VIH-1 a 1:2048 en sangre entera humana VIH negativa
(en base al volumen de plasma) con un valor de hematocrito de 50% o
en plasma humano VIH negativo. Se hicieron otras tres diluciones
serie 1:2, usando de nuevo sangre entera o plasma como el diluyente.
Se añadieron 80 \mul de sangre entera negativo o muestras de la
dilución serie de sangre entera VIH-1 positiva a la
compresa de muestra de tiras de inmunocromatografía preparadas con
sulfato de dextrano en una compresa de neutralización separada o
sulfato de dextrano en la solución de conjugado de selenio en la
compresa de conjugado. Se comprobaron 80 \mul de plasma negativo o
muestras de la dilución serie de plasma VIH-1
positivo solamente en tiras de inmunocromatografía con sulfato de
dextrano en la compresa de conjugado. Los resultados se leyeron 15
minutos después de la aplicación de la muestra (Tabla 4). Un
resultado positivo mostró un color rojo en la tira de detección
donde el complejo de conjugado de antígeno VIH-1 de
selenio rojo-anticuerpo VIH-1 se
unió al antígeno VIH-1 en la región recubierta de la
tira. Un resultado negativo no mostró color en esta región en la
tira de detección.
Sulfato de dextrano en | Sulfato de dextrano en | ||
compresa de neutralización | compresa de conjugado | ||
Dilución de muestra | Sangre entera | Sangre entera | Plasma |
1:2048 | + | + | + |
1:4096 | + | + | + |
1:8192 | - | + | + |
1:16384 | Nt | - | - |
control negativo | - | - | - |
Nt = no comprobado |
Los resultados de la Tabla 4 indican que se puede
detectar anticuerpos VIH-1 a partir de sangre entera
en un ensayo con tira de inmunocromatografía usando el policatión
Merquat®-100 para agregar RBC y permitir que la muestra fluya a lo
largo de la tira, y el polianión sulfato de dextrano como un agente
neutralizante, evitando la agregación del conjugado de selenio por
el policatión y permitiendo que el conjugado se una y forme un
complejo con una muestra positiva y fluya a lo largo de la tira a la
zona de detección. Se demostró que el polianión es efectivo cuando
se utiliza en una compresa de neutralización separada o combinada
con el conjugado de selenio en la compresa de conjugado. En este
ensayo, la sensibilidad para detectar anticuerpos
VIH-1 mostró una mejora doble cuando el polianión
sulfato de dextrano) se utilizó en la compresa de conjugado en vez
de en una compresa de neutralización separada.
Además, los resultados de la Tabla 4 indican que
el policatión agrega efectivamente los RBC en la sangre entera como
muestra la igual sensibilidad de detección de anticuerpos
VIH-1 tanto en sangre entera, donde los RBC deben
ser agregados para que la muestra fluya, como en plasma, donde no
hay RBC para evitar el flujo de la muestra. Esto también muestra que
la presencia del polianión, en una compresa de neutralización
separada o en la compresa de conjugado, no interfiere con la
capacidad del policatión de producir efectivamente agregación de RBC
en sangre entera.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección de antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) en
muestras de sangre entera. Se utilizó Merquat®-100 como el
policatión para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y se
evaluaron varios polianiones en la compresa de conjugado como
reactivos de neutralización de policatión para evitar la agregación
del conjugado de selenio.
Se montaron tiras de inmunocromatografía,
compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y
una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo
en una solución acuosa de 0,26% Merquat®-100, secándola después a
55ºC.
El conjugado de selenio se preparó usando selenio
coloidal, como en el Ejemplo 1, y 12 \mug/ml anticuerpo monoclonal
de ratón a HBsAg (antiHBs). Este conjugado antiHBs marcado con
selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de
2,6 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris
conteniendo uno de los polianiones siguientes: 0,5% Poli (ácido
acrílico), p.m. 2000 (PAA-2000); 0,5% Poli (ácido
acrílico), p.m. 240.000 (PAA-240.000); 0,5% sulfato
de dextrano, p.m. 5000; 0,8% Ácido
poli-L-aspártico, p.m. 36.300; 0,5%
carboximetil celulosa, p.m. 90.000 (CMC). El Sulfato de dextrano y
Ácido poli-L-aspártico eran de
Sigma, St. Louis, MO, y los polianiones restantes eran de Aldrich
Chemical Co., Milwaukee, WI.
La compresa de conjugado se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en
conjugado antiHBs marcado con selenio coloidal preparado y diluido
con uno de los polianiones anteriores. La compresa de conjugado se
secó bajo vacío después de la impregnación.
La tira de detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado como en
el Ejemplo 2 usando antiHBs anticlonales de ratón a una
concentración de 3 mg/ml y se añadió a la membrana de nitrocelulosa
para formar una línea a lo ancho de la tira en una posición a
aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La región
recubierta se reforzó con laminado de poliéster. Se dejó secar
suficientemente para fijar el anticuerpo a la nitrocelulosa.
Se montaron tiras de inmunocromatografía usando
los componentes anteriores colocándolos extremo con extremo
longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm, con la compresa de
muestra en un extremo, junto a la que se colocó una compresa de
conjugado, y finalmente una tira de detección. La tira montada se
cubrió posteriormente con laminado de poliéster, dejando expuestos
aproximadamente 10 mm de la compresa de muestra.
Se añadió HBsAg recombinante a sangre entera
humana HBsAg negativa con un valor de hematocrito de 50% a una
concentración de 12,5 ng/ml. Se hicieron otras tres diluciones serie
1:2 en sangre entera. Se añadieron 50 \mul de sangre entera
negativa o muestras de la dilución serie de sangre entera HBsAg
positiva a la compresa de muestra de tiras de inmunocromatografía
preparadas con varios polianiones en la compresa de conjugado. Los
resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la
muestra (Tabla 5). Un resultado positivo mostró un color rojo en la
tira de detección donde el complejo de conjugado antiHBs de selenio
rojo-HBsAg se unió al antiHBs en la región
recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color en esta
región en la tira de detección. La agregación del conjugado de
selenio rojo a la entrada a la tira de detección se observó
visualmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Concentración de HBsAg (ng/ml) | ||||||
Polianión | 12,5 | 6,25 | 3,13 | 1,56 | 0 | Agregación de |
conjugado | ||||||
PAA-2000 | + | + | + | - | - | - |
PAA-240.000 | + | + | - | - | - | + |
Sulfato de dextrano | + | + | + | - | - | - |
Poli-L-Asp | + | + | + | - | - | - |
CMC | + | - | - | - | - | + |
Aunque todos los polianiones dejaron que se
produjese detección de HBsAg, los polianiones que evitaron la
agregación de conjugado, PAA-2000, Sulfato de
dextrano y Ácido poli-L-aspártico,
exhibían una detección de 2 a 4 veces más sensible de HBsAg en
muestras de sangre entera.
Se repitió el experimento anterior, usando el
conjugado marcado con selenio coloidal diluido en solución tampón
Tris conteniendo PAA-2000 como el polianión, a
excepción de que se añadió 25 de 50 mM solución tampón de fosfato,
pH 7,4, a la compresa de muestra un minuto después de la adición de
las muestras de sangre entera de HBsAg. Los resultados obtenidos
usando este procedimiento, con la adición de la solución tampón
después de la aplicación de la muestra, eran idénticos a los
resultados sin este paso. Así, estos ensayos se pueden hacer con o
sin adición de solución tampón después de la aplicación de la
muestra.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección de anticuerpo a Mycobacterium tuberculosis
(antiMtb) en muestras de sangre entera. Se utilizó Merquat®-100 como
el policatión para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y
se evaluaron varias concentraciones del polianión sulfato de
dextrano en la compresa de conjugado como el reactivo de
neutralización por policatión para evitar la agregación del
conjugado de selenio.
Se montaron tiras de inmunocromatografía,
compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y
una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo
en una solución acuosa de 0,26% Merquat®-100, secándola
posteriormente en vacío.
El conjugado de selenio se preparó usando selenio
coloidal, como en el Ejemplo 1, y 3,5 \mug/ml de antígeno Mtb
recombinante de E. Coli. Este conjugado Mtb marcado con
selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de
2,5 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris
conteniendo 0%, 0,34%, 1,1% o 3,3% sulfato de dextrano.
La compresa de conjugado se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en
conjugado Mtb marcado con selenio coloidal, preparado y diluido con
una de las concentraciones de sulfato de dextrano anteriores. La
compresa de conjugado se secó bajo vacío después de la
impregnación.
La tira de detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, se preparó como
en el Ejemplo 2 usando antígeno Mtb recombinante a una concentración
de 0,15 mg/ml y se añadió a la membrana de nitrocelulosa para formar
una línea a lo ancho de la tira en una posición a aproximadamente 1
cm del extremo de la membrana. La región recubierta se reforzó con
laminado de poliéster. Se dejó secar suficientemente para fijar el
antígeno a la nitrocelulosa.
Se montaron tiras de inmunocromatografía usando
los componentes anteriores colocándolos extremo con extremo
longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm, con la compresa de
muestra en un extremo, junto a la que se colocó una compresa de
conjugado, y finalmente una tira de detección. La tira montada se
cubrió posteriormente con laminado de poliéster, dejando expuestos
aproximadamente 10 mm de la compresa de muestra.
Se diluyó suero AntiMtb positivo 1:100 en sangre
entera humana negativa con un valor de hematocrito de 50%. Se
hicieron otras dos diluciones serie 1:2 en sangre entera. Se
añadieron 50 \mul de sangre entera negativa o muestras de la
dilución serie de sangre entera antiMtb positiva a la compresa de
muestra de tiras de inmunocromatografía preparadas con varias
concentraciones de sulfato de dextrano en la compresa de conjugado.
Los resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la
muestra (Tabla 6). Un resultado positivo mostró un color rojo en la
tira de detección donde el complejo de conjugado de selenio
rojo-anti-Mtb se unió al Mtb en la
región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color
en esta región en la tira de detección. La agregación del conjugado
de selenio rojo a la entrada a la tira de detección se observó
visualmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Sulfato de | Dilución anti-Mtb | ||||
dextrano | |||||
(%) | 1:100 | 1:200 | 1:400 | Control | Agregación de |
negativo | conjugado | ||||
0 | - | - | - | - | ++ |
0,34 | - | - | - | - | ++ |
1,1 | + | - | - | - | + |
3,3 | + | + | - | - | - |
Los datos en la Tabla 6 muestran que el ensayo no
funciona sin la presencia de un polianión, en este caso Sulfato de
dextrano, para evitar la agregación del conjugado. Hay una relación
inversa entre agregado de conjugado y sensibilidad del ensayo. A una
concentración de sulfato de dextrano de 3,3%, no se produce
agregación de conjugado y el ensayo muestra la detección más
sensible de antiMtb.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección de anticuerpo a Treponema pallidum (antiTP) en
muestras de sangre entera o plasma. Comparando la sensibilidad de
detección en sangre entera a plasma, se podría determinar si RBC en
sangre entera se agregaba efectivamente por el policatión de modo
que no interfiera y por lo tanto disminuya la sensibilidad de
detección del ensayo. Se utilizó Merquat®-100 como el policatión
para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y el polianión
Sulfato de dextrano se utilizó en la compresa de conjugado como el
reactivo de neutralización de policatión para evitar la agregación
del conjugado de selenio.
Se montaron tiras de inmunocromatografía,
compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y
una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo
en una solución acuosa de 0,2% Merquat®-100, secándola
posteriormente a 55ºC.
El conjugado de selenio se preparó usando selenio
coloidal, como en el Ejemplo 1, y 7,5 \mug/ml de lisato de
Treponema pallidum (TP). Este conjugado de TP marcado con
selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de
2,8 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris
conteniendo 3,3% sulfato de dextrano.
La compresa de conjugado se preparó impregnando
un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en
el conjugado de TP marcado con selenio coloidal preparado
anteriormente. La compresa de conjugado se secó bajo vacío después
de la impregnación.
La tira de detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado como en
el Ejemplo 2 usando lisato de Treponema pallidum a una
concentración de 44 \mug/ml y añadido a la membrana de
nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una
posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La
región recubierta se reforzó con laminado de poliéster. Se dejó
secar suficientemente para fijar el lisato de TP a la
nitrocelulosa.
Se montaron tiras de inmunocromatografía usando
los componentes anteriores colocándolos extremo con extremo
longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm, con la compresa de
muestra en un extremo, junto a la que se colocó una compresa de
conjugado, y finalmente una tira de detección. La tira montada se
cubrió posteriormente con laminado de poliéster, dejando expuestos
aproximadamente 10 mm de la compresa de muestra.
Se diluyó suero humano AntiTP positivo 1:10,8 a
sangre entera humana negativa con un valor de hematocrito de 50% o a
plasma humano negativo. Se hicieron otras cuatro diluciones serie
1:2, usando de nuevo sangre entera o plasma como el diluyente. Se
añadieron 60 \mul de sangre entera negativa o plasma, o muestras
de la dilución serie de sangre entera antiTP positiva o de plasma a
la compresa de muestra de las tiras de inmunocromatografía. Los
resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la
muestra (Tabla 7). Un resultado positivo mostró un color rojo en la
tira de detección donde el complejo de conjugado TP de selenio
rojo-anti-TP se unió al lisato de TP
en la región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró
color en esta región en la tira de detección.
La Tabla 7 muestra que la sensibilidad para la
detección de antiTP era la misma en sangre entera y plasma,
indicando que el policatión, Merquat®-100, agregaba efectivamente
los RBC en la sangre entera.
Dilución de muestra anti-TP | Sangre entera | Plasma |
1:10,8 | + | + |
1:21,6 | + | + |
1:43,2 | + | + |
1:86,4 | + | + |
1:172,8 | - | - |
Control negativo | - | - |
Claims (14)
1. Un dispositivo de ensayo de cromatografía para
detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre
incluyendo:
un soporte de cromatografía que define un
recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar,
un lugar de aplicación para dicha muestra de
sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de
cromatografía,
un lugar de detección en dicho soporte de
cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está
unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento,
una sustancia marcada unida de forma difusiva
situada en dicho lugar de aplicación,
un policatión unido de forma difusiva para
separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba de
dicho lugar de detección, y
un polianión unido de forma difusiva para
neutralizar el policatión hacia abajo de dicho policatión unido y
hacia arriba de dicho lugar de detección.
2. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho dispositivo es un dispositivo de
inmunoensayo.
3. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho policatión está unido en dicho
lugar para aplicación de dicha muestra de sangre.
4. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho policatión se selecciona a partir
del grupo que consta de hidrobromuro de
poli-L-lisina, hidrocloruro de
poli-L-arginina,
poli-L-histidina, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 3:1, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 2:1, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 1:1, hidrobromuro de
poli(lisina, triptófano) 1:4, y poli(cloruro de
dialildimetilamonio).
5. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho policatión es poli(cloruro
de dialildimetilamonio).
6. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho polianión se selecciona a partir
del grupo que consta de sulfato de dextrano, poli(ácido acrílico),
poli(4-estireno-sulfonato de
sodio), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico),
ácido poli-L-aspártico y
carboximetil celulosa.
7. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho polianión es sulfato de
dextrano.
8. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicho polianión está unido de forma
difusiva al soporte de cromatografía en la misma posición que dicha
sustancia marcada.
9. El dispositivo de ensayo de cromatografía de
la reivindicación 1, donde dicha sustancia marcada es una sustancia
marcada con selenio.
10. Un método para detectar la presencia de un
analito en una muestra de sangre incluyendo los pasos de:
disponer un soporte de cromatografía que define
un recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar, a lo
largo del que hay (a) un lugar de aplicación para dicha muestra de
sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de
cromatografía, (b) un lugar de detección en dicho soporte de
cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está
unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento, (c) una
sustancia marcada situada en dicho lugar de aplicación, (d) un
policatión unido de forma difusiva para separar plasma o suero de
dicha muestra de sangre hacia arriba de dicho lugar de detección, y
(e) un polianión unido de forma difusiva para neutralizar el
policatión situado hacia abajo de dicho policatión unido y hacia
arriba de dicho lugar de detección;
poner dicho lugar de aplicación en contacto con
dicha muestra de sangre; y
detectar la presencia de analito en dicha muestra
de sangre.
11. El método de la reivindicación 10, donde
dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.
12. El método de la reivindicación 10, donde
dicho polianión está unido de forma difusiva al soporte de
cromatografía en la misma posición que dicha sustancia marcada.
13. El método de la reivindicación 10, donde
dicho policatión se selecciona a partir del grupo que consta de
hidrobromuro de poli-L-lisina,
hidrocloruro de poli-L-arginina,
poli-L-histidina, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 3:1, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 2:1, hidrobromuro de
poli(lisina, alanina) 1:1, hidrobromuro de
poli(lisina, triptófano) 1:4, y poli (cloruro de
dialildimetilamonio).
14. El método de la reivindicación 10, donde el
polianión se selecciona a partir del grupo que consta de sulfato de
dextrano, poli(ácido acrílico),
poli(4-estireno-sulfonato de
sodio), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico),
ácido poli-L-aspártico y
carboximetil celulosa.
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US09/007,651 US6673629B2 (en) | 1998-01-15 | 1998-01-15 | Neutralization of polycations in a chromatographic device for whole blood use |
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