JP2000514196A

JP2000514196A - グリコヘモグロビン（％）の定量

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Publication number: JP2000514196A
Application number: JP10539868A
Authority: JP
Inventors: エベリンモクリー; デビッドエイ．ウェスターバーグ; ハイオウエイチ．ヤオ; ジャニナアダムクズィク; メリッサエイ．クリステンセン
Original assignee: アボットラボラトリーズ
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2000-10-24
Anticipated expiration: 2018-03-13
Also published as: DE69817794T2; US6162645A; WO1998040750A1; DE69817794D1; ATE249049T1; CA2282586A1; ES2206900T3; JP3356785B2; EP0974060A1; EP0974060B1

Abstract

(57)【要約】グリコヘモグロビンアッセイは、全血サンプル中のDCCT標準化%GHb定量のための単純な方法を用いている。まず全血溶解サンプルを、ボロン酸または類似のボロネート化合物が当技術分野では周知の共有結合化学により結合している固相と共に、インキュベートする。次にヒトヘモグロビンに対する標識抗体を加えると、得られるシグナルはサンプル中の%GHbに正比例する。1回の定量を用いて%GHbを測定する利点には、精密度が高いこと、およびアッセイが容易に自動化できるため処理量が高いことが挙げられる。自動化により、本アッセイは1台の分析器上で他の検査と統合することもできる。従って、本発明の様々な態様による方法を用いることにより、2回測定する、すなわち1回はGHb、およびもう1回は総ヘモグロビン（THb）を測定する必要がなくなる。

Description

【発明の詳細な説明】グリコヘモグロビン（%）の定量発明の分野本発明は、血液サンプル中のグリコヘモグロビン（GHb）の検出法、または定量法、特にグリコヘモグロビンの割合評価のために改善された、精度の高い1回読み取り法、即ち総ヘモグロビン（THb）測定の必要がない方法に関する。発明の背景グリコヘモグロビン（GHb）は、ヘモグロビン分子に様々な糖類（最も一般的にはグルコース）が結合して生成する一連の少量のヘモグロビン成分を意味する。ヒト赤血球は、グルコースを自由に浸透させる。各赤血球内で、GHbは周囲のグルコース濃度に正比例した速度で生成する。グルコースとヘモグロビンとの反応は、非酵素的で不可逆的、かつゆっくりと進むため、赤血球の寿命（120日）の間に総ヘモグロビンの一部分しか糖化しない。その結果、GHbを測定することにより、長期血糖値のモニタリングに用いることができる、血糖値の重みつき「移動」平均が得られ、過去2〜3ヶ月間の平均血糖値の正確な指標となる。糖尿病患者における血糖管理の評価が、この最も重要な臨床応用である。ヘモグロビンA1c（HbA1c）はある特有の型のグリコヘモグロビンで、糖尿病に関する最も重要なヘモグロビン種である。HbA1cの総ヘモグロビン量は、非糖尿病患者では約3〜6%で、管理をあまり行っていない糖尿病患者では20％以上である（Goldstein DEら、Clin Chem 32:B64-B70(1986)）。HbA1cでは、グルコースがヘモグロビンAの一方または両方のβ鎖のアミノ末端バリン残基に結合している。HbA1c（ならびに他のグリコヘモグロビンA1種）は、電荷の差で分子を分離する方法により、非糖化ヘモグロビンから分離することができる。ヘモグロビンの糖化はヘモグロビン分子の他の部位でも起こるが、これらの種は非糖化ヘモグロビンから電荷の差により分離することはできないため、これらのヘモグロビン種はすべてHbA0と呼ばれる。グリコヘモグロビンのすべての型を測定する方法は、総GHbを測定することであると言われている。ある部位の糖化は、他のいかなる部位の糖化とも比例していると考えられるため、GHbとHbA1cとの間には直線的相関がある。糖尿病管理および合併症試験研究班（Diabetes Control and Compl ications Trial（DCCT）Research Group）は、GHbにおける1%の変化（%HbA1c）が過去120 日間の血糖値における300mg/Lの平均変化を表していると報告した。尿および血糖値を含む、糖尿病の血糖管理を評価する従来法は変動する可能性があり、糖濃度の経時情報を示さず、また、食事により劇的な影響を受けるため限られた価値しかない。しかしGHbの測定は、対象者の過去2〜3ヶ月間の平均血糖値の正確な指標となり、糖尿病患者は血糖値管理に対する長期的目標達成のあらましを把握できる。GHb値は患者の経時的血糖管理のモニタリングに用いることができるため、高度の長期アッセイ精度および異なる方法間の標準化が必須である。これらの臨床的な要求に応えて、米国臨床化学協会（American Associati on of Clinical Chemistry）(AACC)は、1993年にGHb標準化に関する小委員会を結成した。GHb標準化小委員会（GHb Standardization Subcommittee）は、検査室内におけるすべてのGHbアッセイに対し、測定間のCVを5%以下に維持すべきで、新しいサンプルについての標準化は、DCCTへの相関に基づいて行うべきと勧告した。作成されたアッセイ法はすべて、認可を受けるためにはこれらの要求に合致しなければならない。臨床アッセイ法は、電荷の差または構造上の特徴のいずれかに基づいてGHbを総ヘモグロビンから分離する。電荷の差に基づく方法には、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が含まれ、HbA0から、HbA1またはHbA1cをそれらの電荷の差に基づいて分離する。イオン交換クロマトグラフィーは、大型カラム、小型カラム、もしくは超小型カラムで、または高圧液体クロマトグラフィー（HP LC）により、実施することができる。大型カラムによる方法は臨床検査室における常用には非実用的であるが、単純化された小型または超小型カラムが利用可能である。しかし、これらの方法は再現性が低く、温度、pH、およびイオン強度の変動に非常に敏感である。電気泳動は、温度、pHまたはイオン強度にそれほど敏感ではないが、イオン交換法にも見られる他の欠点、すなわち不安定なGHb中間体による干渉があり、この中間体はGHb検査前に除去しておかなければならず、また、血色素病がある場合の諸問題、サンプルの保存状態に対する感受性、ならびにアスピリン治療、エタノール濃度、および尿毒症などの外来性臨床因子からの干渉がある。また、HPLCおよび電気泳動には特別な装置が必要である。構造上の特徴に基づく方法には、アフィニティー結合またはクロマトグラフィー、およびイムノアッセイが含まれる。これらの方法は、温度、pH、またはイオン強度の小さな変動に対する感受性がより低く、一般に前述の不安定なGHb中間体、血色素病、もしくはサンプルの保存状態、または外来性臨床因子による影響を受けない。しかし、これらの方法は、非糖化成分からのGHbの分離を含むか、または%GHbを計算するために別々の2回の定量−1回は総ヘモグロビンの定量、2 回目はGHbまたはHbA1cの定量−が必要である。ボロネートはGHbに対する親和性があるため、固相基質に結合させたボロネート配位子をアフィニティー結合アッセイに用いることができる。次いで結合（糖化）ヘモグロビンの、非結合（非糖化）ヘモグロビンに対する比を定量することができる。イムノアッセイは、HbA1 c特異抗体を用いてHbA1cを測定するが、%GHbを計算するために別々の2回の定量、すなわち1回は総ヘモグロビン、もう1回はHbA1cの定量が必要である。または、イムノアッセイは受動的吸着により全ヘモグロビン種を結合し、次いで特異的抗体抱合体によりHbA1cを検出することもできる。しかし、この方法はヘモグロビンの変種により不都合な影響を受けることがある。従って、当技術分野で必要とされるのは、総ヘモグロビン含有量をも定量する必要がない、改善された精度の高い、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの検出法または定量法である。発明の概要本明細書に記載の、独特で新規なアプローチは、全血サンプル中の%GHbを測定し、わずか1回の測定後に%GHbの結果を示すものである。本法は、%GHbを例えばG Hb/THb×100の比として計算するために、総ヘモグロビンおよびGHbの別々の測定を必要とする、前述の当技術分野で現在利用可能な方法とは異なっている。本明細書に記載のGHbアッセイは、全血サンプル中のDCCT標準化%GHb定量のための単純な方法を用いている。まず、全血溶解サンプルを、ボロン酸（boronic）、フェニルボロン酸（phenylboronic）もしくはホウ酸、または関係するボロネート（boronate）化合物が、当技術分野では周知の共有結合化学により結合している固相と共にインキュベートする。この固相は、サンプル中の%GHbに正比例してGH bを特異的に捕獲するため、新規である。次に、ヒトヘモグロビンを認識する標識成分を加えると、得られるシグナルはサンプル中の%GHbに正比例する。1回の定量を用いて%GHbを測定する利点には、精密度が高いこと（CV約5%未満）、およびアッセイが容易に自動化できるため処理量が高いこと（100〜200検査／時）が挙げられる。自動化により、本アッセイは1台の分析器上で他の検査と統合することもできる。図面の簡単な説明図1は、本発明の一つの態様による、CMA/Merquatコートした粒子およびポリアニオン試薬（Polyanion Reagent）とあらかじめ混合したサンプルを用いて、%GH b値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図2は、本発明の一つの態様による、CMA/Merquatコートした粒子をポリアニオン試薬と共に用いて、%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図3は、本発明の一つの態様による、CMA-APBAコートした粒子を用いて、%GHb 値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図4は、本発明の一つの態様による、CMC-APBAコートした粒子を用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図5は、本発明の一つの態様による、PAA-APBAコートした粒子を用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図6は、本発明の一つの態様による、TREN-CMA-APBAコートした粒子を用いて%G Hb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図7は、本発明の一つの態様による、TREN-CMC-APBAコートした粒子を用いて%G Hb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図8は、本発明の一つの態様による、APBAコートした粒子を用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図8Aは、本発明の一つの態様による、EDA-CMA-APBAコートした粒子を用いて%G Hb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図9は、Biorad Diamat HPLCおよび本発明の好ましい態様を用いて測定した%GH b値間の相関を示すグラフである。図10は、Abbott IMx（登録商標）GHbアッセイおよび本発明の好ましい態様を用いて測定した%GHb値間の相関を示すグラフである。図11は、本発明の好ましい態様を用いて%GHb値を測定した場合の、測定間の相関を示すグラフである。図12は、本発明の一つの態様による、1ステップ（同時）フォーマットを用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図13は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム標識したCortexポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビンを用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図14は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム標識したBiosPacificモノクローナル抗ヒトヘモグロビンを用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図15は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム標識したBiosPacificポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビンを用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。図16は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム標識したDakoポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグロビンを用いて%GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフである。好ましい態様の詳細な説明ヘモグロビンを遊離させるために全血中の赤血球を溶血し、その後サンプルを希釈して、グリコヘモグロビンが結合するボロネート反応基を有する固相とインキュベートした後、グリコヘモグロビンの割合（%GHb）を測定する。次いで、または同時に、サンプル混合液を、標識した抗ヘモグロビン抗体（Ab）と反応させる。得られるシグナルを検出すると、このシグナルはサンプル中の%GHbに正比例する。従って、本発明の様々な態様による方法を用いることにより、2回測定すること、すなわち1回はGHb、およびもう1回は総ヘモグロビンを測定して、その比で%GHbを求める必要がなくなる。一つの特定の理論に制限されることなく、グリコヘモグロビンは固相に結合されたボロネート親和性複合体に結合すると考えられる。固相への結合に際し、総ヘモグロビンがグリコヘモグロビンと直接競合し、それにより1回の測定でグリコヘモグロビンの割合が正確に求められると考えられる。全血サンプルを水中で希釈するか、またはより好ましくはTRITON（登録商標） X-100のような非イオン性界面活性剤などの物質を用いるかのいずれかによる、様々な方法で全血を溶血することができる。溶血により、分析に用いるヘモグロビンおよびその誘導体が赤血球から遊離する。本発明に係るGHbアッセイは、ボロン酸、フェニルボロン酸、ホウ酸、およびボロネートなど（以下「ボロネート」とする）の化合物またはその一部分の、グリコヘモグロビンに対する親和性に基づく。ボロネートは、ヘモグロビンに結合しているグルコースのシス−ジオール部分を介してサンプル中のGHbと反応し、5 員環構造を形成する。ボロネート基は、共有結合、様々な化学的結合、または静電気的結合により固相に結合させることができ、その方法は、例えば米国特許第 5,459,080号など当技術分野において記載されており、この開示は本明細書中で参照として組み込まれる。固相自体は、表面官能基を有するようさらに誘導体化することのできるポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストラン、ラテックス、シリカ、ガラスなどで作られたビーズ、微粒子、磁気微粒子、微量定量プレート、チューブなどを含む様々な物質から選ぶことができるが、このような物質に制限されない。これらの表面官能基には、当業者には周知の標準的結合法に従ってボロネートまたはボロネート支持体に共有結合することが可能な、アルデヒド、脂肪族アミン、芳香族アミン、アミド、カルボン酸、スルフヒドリル、クロロメチル、エポキシ、ヒドラジド、ヒドロキシルなどが含まれるが、これらに制限されることはない。好ましい固相には、アミノ官能基を有する磁気ラテックス粒子が含まれ、特に好ましくは、ジアミンおよび標準的結合法を用いてアミノ粒子に誘導したカルボキシル化磁気ラテックス粒子が含まれる。ジアミンには、エチレンジアミン、1,6-ヘキサンジアミン、1,4-トランス-シクロヘキサンジアミンが含まれ、エチレンジアミンが好ましいが、これらに制限されることはない。ボロネート化合物を結合するための好ましい表面官能基部分は、カルボキシメチルアミロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアクリル酸、タンパク、アルブミン、抗体などを含む様々な物質から選ぶことができるが、このような物質に制限されることはなく、周知の方法により固相に結合することができる。好ましい表面官能基部分はカルボキシメチルセルロースで、カルボキシメチルアミロースが特に好ましい。本発明の方法に用いるためのボロネート化合物には、ギャロップ（Gallop）の来国特許第4,496,722号に記載の化合物が含まれ、この開示は本明細書中で参照として組み込まれる。好ましい化合物には、4-カルボキシフェニルボロン酸、3- ニトロ-5-カルボキシフェニルボロン酸およびm-アミノフェニルボロン酸（APBA ）が含まれる。特に好ましいのは、m-アミノフェニルボロン酸（APBA）である。ボロネート結合基により固相に結合されたGHbは、次いでヘモグロビン分子の一部を認識する抗体を用いて検出することができ、このような抗体は、検出可能な部分に結合または抱合されている。標識成分は抗体でもよく、望ましくはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体（Ab）、または抗原結合部位を含むAb断片、あるいは、F(ab')₂もしくはFab断片などの相補性決定領域（CDR）でもよい。検出可能部分または標識は、放射性、蛍光もしくは化学発光物質、または酵素でもよい。または、第一のAbの種特異的Fc断片を認識する、標識した第二のAbも用いることができる。また、標識成分として単純に標識を有することも可能である。いずれの場合にもシグナルが生じ、用いた標識物質の型に応じて検出することになる。別法として、標識を付加する代わりに、結合したヘモグロビン自体がそのペルオキシダーゼ様の性質により検出可能なシグナルを発することも可能である。これは別の基質（例えばイソルミノール）の添加の有無に関わらず、過酸化水素の添加により達成される。好ましくは、当技術分野で周知の方法を用いて全血サンプルを溶解し、希釈する。血球を、技術者が入手できる薬剤を用いて溶解する。これらのうち、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば0.5%TRITON（登録商標）X- 100非イオン性界面活性剤を用いる、1:80の希釈が標準的である。アゾ吉草酸を加えられたカルボキシル化磁気微粒子（azo-valeric initiated，carboxylatedm agnetic microparticles）を、アミン、好ましくはエチレンジアミン（EDA）でコートし、このアミンにポリマー、好ましくはアニオン重合体、特にカルボン酸のアニオン重合体およびボロネート化合物を結合させる。特に好ましいのは、表面官能基部分として1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDAC）を用いた、カルボキシメチルアミロース（CMA）およびm-アミノフェニルボロン酸（APBA）である。誘導体化した微粒子を、次いで溶解したサンプルと共にインキュベートする。洗浄後、アクリジニウム標識したモノクローナル抗ヘモグロビンAbを添加する。インキュベーションおよび洗浄に続き、トリガー試薬（Trigger Reagent）を加え、得られる化学発光シグナルを相対光単位（R elative Light Units）（RLU）として測定する。標識成分により生じたシグナルを読み取る、別の方法も本発明の範囲内である。アッセイと同時に測定する較正物質または標準物質により、測定した化学発光シグナルを用いてサンプル中の%G Hbを求める較正（または標準）曲線を作成する。測定した化学発光シグナルは、サンプル中の%GHbに正比例する。実施例以下の実施例は、本発明の様々な態様を提示するためのものである。これらは例示のために示したにすぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。簡単に言うと、ヘモグロビンを遊離させるために全血中の赤血球を溶血し、その後サンプルを希釈して、グリコヘモグロビンが結合するボロネート反応基を有する固相とインキュベートした後、%GHbを測定した。次いでまたは同時に、サンプル混合液を標識した抗ヘモグロビンAbと反応させた。洗浄後、得られるシグナルを検出したところ、このシグナルはサンプル中の%GHbに正比例した。以下の実施例により、溶血および希釈の異なる方法、ボロネート基を磁気微粒子に結合するための異なる手段、ならびに異なる抗ヘモグロビン抗体の使用を示す。すべての方法は、本明細書中に参照として組み入れられる米国特許第5,468, 646および米国特許第5,543,524に記載のとおり、Abを化学発光標識するために、スルホプロピルアクリジニウムエステル（10-（3-スルホプロピル）-N-トシル-N -（2-カルボキシプロピル）-9-アクリジニウムカルボキサミド）を用い、検出されたAbの定量、従って%GHbを求めるために、相対光単位（RLU）の検出を用いた。実施例1--磁気微粒子へのボロネートの結合 A．CMA/MERQUAT （登録商標）コートしたアミノ微粒子固体含量5%のアミノ磁気微粒子（#AM 40-500、Spherotech、Libertyville、IL）2mlを、50mM 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸、pH6.2（MESバッファー）10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで240mgのカルボキシメチルアミロース（CMA；#C4947、Si gma、St．Louis、MO）および96mgの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDAC）を含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、2%Merquat溶液10ml中に再懸濁した。以下の実施例4.A.および4.B.に記載のとおり、CMA/Merquatコートした微粒子をIMx（登録商標）GHb Polyanion Reagent（Abbott Laboratories、Abbott Park 、IL）と共に用いた。このポリアニオン試薬は、ポリアクリル酸に結合したフェニルボロン酸で構成されている。 B．CMA-APBA コートしたアミノ微粒子固体含量5%のアミノ磁気微粒子（#AM40 -500、Spherotech、Libertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで240mgのCMAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10m lで1回洗浄し、次いで46.5mgのm-アミノフェニルボロン酸（半硫酸塩）（APBA）および96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。 C．CMC-APBA コートしたアミノ微粒子固体含量5%のアミノ磁気微粒子（#AM40 -500、Spherotech、Libertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで240mgのカルボキシメチルセルロース（CMC）（分子量250,000；#41931-1、Aldrich、Milwaukee、WI）および96mgのEDACを含むMES バッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで1回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバッファー 10ml中に再懸濁した。 D．PAA-APBA コートしたアミノ微粒子固体含量5%のアミノ磁気微粒子（#AM40 -500、Spherotech、Libertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を次いで、209mgの35%ポリアクリル酸（PAA）（分子量250,0 00；#41600-2、Aldrich、Milwaukee、WI）および96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10m lで1回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml 中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバッファー10ml 中に再懸濁した。 E．TREN-CMA-APBA コートしたカルボキシル微粒子固体含量5%のカルボキシル磁気微粒子（SP1267、Polymer Labs、Shropshire、UK）2mlを、MESバッファー10 mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで73mgのトリス（2-アミノエチル）アミン（TREN）および96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで3回洗浄し、次いで120m gのCMAおよび48mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。2回目のインキュベーション後、微粒子をMESバッファー10mlで1回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温でさらに60分間、回転装置上でインキュベートした。この最後のインキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。 F．TREN-CMC-APBA コートしたカルボキシル微粒子固体含量5%のカルボキシル磁気微粒子（SP1267、Polymer Labs、Shropshire、UK）2mlを、MESバッファー10 mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで73mgのトリス（2-アミノエチル）アミン（TREN）および96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで3回洗浄し、次いで120m gのC MC（分子量700,000；#41933-8、Aldrich、Milwaukee、WI)および48mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。２回目のインキュベーション後、微粒子をMESバッファー10mlで1回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温でさらに6 0分間、回転装置上でインキュベートした。この最後のインキュベーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバツファー10ml中に再懸濁した。 G．APBA コートしたカルボキシル微粒子固体含量5%のカルボキシル磁気微粒子（SP1340、Polymer Labs、Shropshire、UK）2mlを、MESバツファー10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで43.2mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMES バッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を50mMタウリンバッファー、pH9.0、10mlで2回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。 H．EDA-CMA-APBA コートしたカルボキシル微粒子固体含量5%の、アゾ吉草酸を加えられたカルボキシル化磁気微粒子（azo-valeric initiated carboxylated magnetic microparticles）(AB007C、Polymer Labs、Shropshire、 UK）2mlを、MESバッファー10mlで3回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで15μｌのエチレンジアミン（EDA）および10mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで3回洗浄し、次いで12 0mgのCMAおよび19.6mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートした。2回目のインキュベーション後、微粒子をMESバッファー10mlで1回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温でさらに60分間、回転装置上でインキュベートした。この最後のインキュベーション後、微粒子を50mMタウリンバッファー、pH9.0で3回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。実施例2--抗体のアクリジニウムとの抱合抱合させる抗体を、まずリン酸緩衝食塩水（PBS）を3回変えて、1回の透析交換に4〜6時間かけて透析した。次いで抗体を1mg/mlの濃度に希釈した。lmg/mlの抗体溶液を混合しながら、10%3-[(3- コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸塩（CHAPS）および5μｇ/mlのスルホプロピルアクリジニウムエステルを加えた。これを室温で10 分間混和し、次いで吸着床容積120ml（1.6×60cm）のファルマシアセファクリル（Pharmacia Sephacryl）S-200カラムにのせた。カラムに用いたバッファーは2. 28mM一塩基リン酸ナトリウム、7.68mM二塩基リン酸ナトリウム、145mM NaC1、0. 1%CHAPS、pH6.3であった。1mlを一分画として採取し、280nmの吸光度が0.1以上の分画を集めた。アクリジニウム標識した抗体を、抱合希釈液（Conjugate Dilu ent）（2%ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5%TRITON（登録商標）X-100を含む10mM MES、150mM NaCl、pH6.3）中で、最終濃度40ng/mlに希釈した。実施例3--GHbアッセイのプロトコル微粒子を、100mMタウリンバッファー、pH9 .0で洗浄し、別に記載のない場合は、同じバッファー中に固体含量0.1%で再懸濁した。全血サンプルを溶解および希釈し、次いで50μｌのサンプルを50μｌの微粒子と混合し、37℃で18分間インキュベートした。次いで粒子を磁石に引きつけ、コモンバッファー（Common Buffer）（0.05%Brijおよび0.1%NaN₃を含む4mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.5）1mlで4回洗浄した。実施例2に記載のとおりに調製した、ヒトヘモグロビンに対するアクリジニウム標識した抗体50μｌを、洗浄した微粒子に加えた。標識抗体を微粒子と共に37 ℃で4分間インキュベートし、次いで粒子を磁石に引きつけて、コモンバッファー1mlで4回洗浄した。 0.053%HNO₃、1.2%H₂O₂および0.9%ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DPTA）のトリガー試薬と、続いて0.35N NaOHおよび2%TRIT0N（登録商標）X-100とを加えることにより、化学発光シグナルが生じた。化学発光シグナルを相対光単位（RL U）で測定した。実施例4--GHbアッセイにおけるボロネート磁気微粒子の使用 IMx（登録商標）GHbアッセイ（Abbott Laboratories、Abbott Park、IL）における%GHb値に基づき、%GHb値の臨床範囲をカバーする6から8個の全血サンプルを、検査のために選択した。 A．CMA/Merquat コートした粒子：サンプル＋ポリアニオン試薬全血サンプルを、蒸留水中で1：5に希釈することにより溶解した。次いで溶血物をPBS中の0.5 %TETRONIC（登録商標）1307（BASF#550193、Mount Olive、NJ）中で1：16にさらに希釈した。実施例1.A.で調製した微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し、次いで同じタウリンバッファー中に固体含量0.1%で再懸濁した。希釈した全血サンプルを、同量のIMx（登録商標）GHb Polyanion Reagent（Abbott Lab oratories、Abbott Park、IL）と混合し、37℃で7分間インキュベートしてサンプル中のGHbをポリアニオン試薬のボロネート基に結合させた。インキュベーション後、この混合物50μｌを微粒子50μｌと混合し、実施例3に記載のとおりにインキュベートおよび洗浄した。実施例2に記載のとおりにアクリジニウムで標識しDEAE精製した、ヒトヘモグロビンに対するマウスモノクローナル抗体（IgG₁）（クローンMIH9505、Medix B iotech，Inc.、San Carlos、CA）を、洗浄した微粒子に加え、実施例3に記載のとおりに実験を完了した。図1により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の %GHbに正比例（R＝0.956）していたことが明らかである。 B．CMA/Merquat コートした粒子＋ポリアニオン試薬実施例1.A.から得た、CMA/Merquatコートした微粒子を、100mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し、ポリアニオン試薬に固体含量0.1%で再懸濁することにより、IMx（登録商標）GHb Polyanion Reagent（Abbott Laboratories、Abbott Pa rk、IL）で上塗りコートした。次いで微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0 で洗浄して、過剰のポリアニオン試薬を除去し、タウリンバッファー中に固体含量0.1%で再懸濁した。実施例4.A.に記載のとおりに調製したサンプル溶血物50μｌを、次いで微粒子 50μｌと混合し、実施例4.A.と同じ抗体を用いて実施例3に記載のとおりにGHbアッセイを実施した。図2により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.984）していたことが明らかである。 C．CMA-APBA コートした粒子全血サンプルを実施例4.A.に記載のとおりに選択し、蒸留水中の0.5%TRITON（登録商標）X-100中に1：80に希釈することにより溶血した。次いでGHbアッセイを、実施例1.B.から得た微粒子および実施例4.A. と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図3により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.981）していたことが明らかである。 D．CMC-APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.C.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図4により、化学発光シグナル（RLU ）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.961）していたことが明らかである。 E．PAA-APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.D.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図5により、化学発光シグナル（RLU ）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.928）していたことが明らかである。 F．TREN-CMA-APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.E.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図6により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.978）していたことが明らかである。 G．TREN-CMC-APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.F.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図7により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.994）していたことが明らかである。 H．APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.G.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。図8により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.991）していたことが明らかである。 I．EDA-CMA-APBA コートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.H.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例3に記載のとおりに実施した。（本フォーマット中の手順は、I PLS GHbアッセイと呼ばれる。）図8Aにより、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.985）していたことが明らかである。実施例5--IPLSGHbアッセイとBiorad Diamat HPLCおよびAbbott IMx（登録商標） GHbとの相関以前に%HbA1c値を求めるためにBiorad Diamat HPLC法を用いてGHb についての検査を行っている病院検査室から、110の全血サンプルを得た。ここで記述しているアッセイで用いるようなボロネートアフィニティー結合法は、 HbA1cを含むすべてのGHb種を検出する。GHbとHbA1cとの間には直線的相関があるため、GHbおよびHbA1c測定検査間の比較をすることができる。 IPLSGHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調製した110のサンプルを用い、実施例4.I.に記載のとおりに実施した。結果はBiorad Diamat HPLC（Brea、 CA）およびIMx（登録商標）GHb（Abbott Laboratories、Abbott Park、IL）アッセイと相関していた（それぞれ図９および10）。 IPLS GHbおよびBiorad Diamat HPLCアッセイ間の相関（図9）は91%であった。 IPLS GHbおよびIMx（登録商標）GHbアッセイ間の相関（図10）は93%であった。さらに、同じ110のサンプルについてIPLS GHbアッセイを用いて2回測定を行い、測定間の相関を調べた。図11に示している結果より、2回の測定（測定1および測定2）間には良好な一致（98%）が認められた。実施例6--1ステップフォーマット溶血サンプルを、実施例4.C.に記載のとおりに調製した。実施例1.H.で調製した微粒子を50mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し、同じバッファー中に固体含量0.1%で再懸濁した。標識した抗体は、実施例4.A.に記載の抗体と同じであった。溶血産物50μｌ、微粒子50μｌおよびアクリジニウム標識した抗体50μｌを37℃で25分間インキュベートすることにより、アッセイを実施した。次いで粒子を磁石に引きつけて、コモンバッファー1mlで4 回洗浄した。トリガー試薬を加えることにより、化学発光シグナルを生じさせた。図12により、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例（R＝0.97 3）していたことが明らかである。従って、本アッセイにより1ステップおよび2 ステップのフォーマットで%GHbが正確に検出される。実施例7--異なる抗体の使用前述の実施例はすべてMedix Biotech製の、DEAE精製した、ヒトヘモグロビンに対するマウスモノクローナル抗体（IgG₁）を用いている。異なる種由来のポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体を含む他の抗体も用いることができる。 GHbアッセイを、実施例4.A.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.A. から得た微粒子、および実施例2に記載のとおりにアクリジニウムで標識したヒトへモグロビンに対する下記の抗休を用いて、インキュベーションをいずれも37 ℃で 10分間行った以外は実施例3に記載のとおりに実施した。前記抗体はすなわち、（1）ポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビン（#CR8000 GAP、Cortex Biochem、 San Leandro、CA）、（2）モノクローナル抗ヒトヘモグロビン（#A36380、BiosP acific、Emeryville、CA）、（3）ポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビン（#G3 2100、BiosPacific、Emeryville、CA）、および（4）ポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグロビン（#A118、Dako Corp.、Carpinteria、CA）である。図13から16に示した結果から、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の%GHbに正比例していたことが明らかである。各Abを用いたアッセイに対する相関係数（R値）はそれぞれ0.982、0.975、0.946および0.869であった。従って、ヒトヘモグロビンに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、本アッセイフォーマットにおける正確な%GHb検出にとって有用である。本発明は、その様々な態様のそれぞれにおいて記載されているが、本明細書および付随の請求の範囲に示されている、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、当業者によりそれらに一定の改変が加えられることが予想される。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１０月２６日（１９９９．１０．２６）【補正内容】請求の範囲１．a）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離させるために血液サンプルを溶解する段階、 b）該溶解血液サンプルをボロネート部分が結合している固相とインキュベートする段階、 c）該サンプルにヘモグロビン特異的な標識成分を加える段階、 d）得られるシグナルを測定する段階、および e）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。２．固相が、ビーズ、微粒子、磁気微粒子、微量定量プレート、およびチューブからなる群より選択される、請求項１記載の方法。３．ボロネート部分が、ホウ酸、ボロネート化合物、およびフェニルボロン酸からなる群より選択される、請求項１記載の方法。４．フェニルボロン酸が、4-カルボキシフェニルボロン酸、3-ニトロ-5-カルボキシフェニルボロン酸、およびm-アミノフェニルボロン酸（APBA）からなる群より選択される、請求項３記載の方法。５．標識成分が、標識されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにヘモグロビンに親和性を有するその他の標識分子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。６．標識成分が、標識されたモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項５記載の方法。７．標識成分が標識である、請求項１記載の方法。８．標識成分の標識が、放射性、蛍光もしくは化学発光物質、または酵素からなる群より選択される、請求項１記載の方法。９．総ヘモグロビンを測定しないという条件が付いた、請求項１記載の方法。１０．a）溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合している固相とインキュべートする段階、 b）該サンプルに、ヘモグロビン特異的な標識成分を加える段階、 c）該標識成分から得られるシグナルを測定する段階、および d）該サンプル中のグリコヘモグロビン（GHb）の割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。１１．総ヘモグロビンを測定しないという条件が付いた、請求項１０記載の方法。１２．a）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離させるために血液サンプルを溶解する段階、 b）該溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合している固相とインキュベートする段階、 c）得られるシグナルを測定する段階、および d）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヤオハイオウエイチ. アメリカ合衆国イリノイ州リバティービルダブリュー．ゴルフロード 233 (72)発明者アダムクズィクジャニナアメリカ合衆国イリノイ州ガーニーカイルヘイブンコート 174 (72)発明者クリステンセンメリッサエイ. アメリカ合衆国イリノイ州パラティングリッソムドライブ 1023

Claims

【特許請求の範囲】１．a）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離させるために血液サンプルを溶解する段階、 b）該溶解血液サンプルをボロネート部分が結合している固相とインキュベートする段階、 c）該サンプルにヘモグロビン特異的な標識成分を加える段階、 d）得られるシグナルを測定する段階、および e）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。２．固相が、ビーズ、微粒子、磁気微粒子、微量定量プレート、およびチューブからなる群より選択される、請求項１記載の方法。３．ボロネート部分が、ホウ酸、ボロネート化合物、およびフェニルボロン酸からなる群より選択される、請求項１記載の方法。４．フェニルボロン酸が、4-カルボキシフェニルボロン酸、3-ニトロ-5-カルボキシフェニルボロン酸、およびm-アミノフェニルボロン酸（APBA）からなる群より選択される、請求項３記載の方法。５．標識成分が、標識されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにヘモグロビンに親和性を有するその他の標識分子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。６．標識成分が、標識されたモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項５記載の方法。７．標識成分が標識である、請求項１記載の方法。８．標識成分の標識が、放射性、蛍光もしくは化学発光物質、または酵素からなる群より選択すされる、請求項１記載の方法。９．総ヘモグロビンを測定しないという条件が付いた、請求項１記載の方法。１０．a）溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合している固相とインキュベートする段階、 b）該サンプルに、ヘモグロビン特異的な標識成分を加える段階、 c）該標識成分から得られるシグナルを測定する段階、および d）該サンプル中のグリコヘモグロビン（GHb）の割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。１１．総ヘモグロビンを測定しないという条件が付いた、請求項１０記載の方法。１２．a）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離させるために血液サンプルを溶解する段階、 b）該溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合している固相とインキュベートする段階、 c）得られるシグナルを測定する段階、および d）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める段階を含む、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合を求める1回読み取り法。