KR20120051133A - 미세유동장치 및 이를 이용한 헤모글로빈의 측정방법 - Google Patents

미세유동장치 및 이를 이용한 헤모글로빈의 측정방법 Download PDF

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Abstract

미세유동장치 및 이를 이용한 생체물질의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학발광반응의 촉매 역할을 하는 전이금속 Fe을 포함하는 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 화학발광검출법을 통해 검출할 수 있는 미세유동장치 및 이를 이용한 당화 헤모글로빈　측정방법을 제공한다.

Description

미세유동장치 및 이를 이용한 헤모글로빈의 측정방법{Microfluidic Device and Hemoglobin Measuring Method thereof}
미세유동장치 및 이를 이용한 생체물질의 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학발광법을 이용하여 헤모글로빈을 측정하는 미세유동장치 및 이를 이용한 헤모글로빈의 측정방법에 관한 것이다.
미세유동장치는 소량의 유체를 조작하여 생물학적 또는 화학적인 반응을 수행하는데 사용되는 장치이다.
일반적으로 미세유동장치에서 하나의 독립적인 기능을 수행하는 미세유동구조물은 유체를 가두어 둘 수 있는 챔버와, 유체가 흐를 수 있는 채널 및 유체의 흐름을 조절할 수 있는 밸브를 포함하고, 이들의 다양한 조합에 의해 만들어질 수 있다. 소형의 칩(chip) 상에서 생물학적 또는 화학적인 반응을 포함한 시험을 수행할 수 있도록 칩 형태의 기판에 이러한 미세유동구조물을 배치하고 여러 단계의 처리 및 조작을 수행할 수 있도록 제작된 장치를 랩온어칩(lab-on-a chip)이라 한다. 미세유동구조물 내에서 유체를 이송하기 위해서는 구동 압력이 필요한데, 구동 압력으로서 모세관압이 이용되기도 하고, 별도의 펌프에 의한 압력이 이용되기도 한다. 최근에는 디스크 형상의 플랫폼에 미세유동구조물을 배치하고 원심력을 이용하여 유체를 이동시키며 일련의 작업을 수행하는 디스크형 미세유동장치들이 제안되고 있다.
당화 헤모글로빈(glycated hemoglobin; Hemoglobin A1c(이하에서 'HbA1c'라고 기술하는 경우도 있다))는 최근 당뇨의 선별 및 진단에서의 역할이 중요한 것으로 인식되고 있어 새로운 환자에 대한 외래전 검사 및 응급검사로서 그 필요성이 증대되고 있다.
외래전 검사 및 응급검사는 검사 시작에서 보고까지 30분 이내에 이루어져야 하고, 그 결과에 따라 다음 단계의 지침이 결정되므로 신속한 검사속도와 정확한 결과보고가 필수적이다.
현재 당화 헤모글로빈을 측정하는 기술들은 그 측정시간이 오래 걸리거나 핸들링이 용이하지 않은 문제가 있다. 따라서, 이와 같은 기술적 제한을 해소할 수 있는 보다 신속하고 정확한 새로운 측정법을 제시할 필요성이 있다.
본 발명의 일 측면은 화학발광반응의 촉매 역할을 하는 전이금속 Fe을 포함하고 있는 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 화학발광검출법을 통해 검출할 수 있는 미세유동장치 및 이를 이용한 당화 헤모글로빈 측정방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 미세유동구조물은 혈액을 수용하는 시료챔버; 발광반응물질을 포함하는 시약챔버; 양전하를 띠는 제1물질을 포함하는 제1검출챔버; 상기 제1검출챔버에 연결되고, 보로네이트 모이어티를 가지는 제2물질을 포함하는 제2검출챔버 및 상기 챔버들을 연결하는 채널을 포함하는 것을 특징으로 한다.
발광반응물질은 발광물질과 산화제를 포함할 수 있다.
발광물질은 luminol, ucigenin, DTMC(7-(4,6-Dichloro-1,3,5-triazinylamino)-4-methylcoumarin), pyrene, perylene, p-quaterphenyl, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene, 1,3-Cyclohexanedione, 1,4-bis(5-phenyloxazol)benzene, bis(2,4-dimethylpentadienyl)ruthenium, 1-Ethylnaphthalene, 1-Pyrenedodecanoic acid, 2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde, 2-Aminoacridone, 3-Phenylumbelliferone, 3,3′-Diethylthiadicarbocyanine iodide, 4-Hydroxybenzhydrazide, 6-Aminofluorescein 및 7-Ethoxy-4-methylcoumarin 7-Methoxycoumarin로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
제1검출챔버 내의 제1물질은 아민기 또는 폴리아민기를 포함할 수 있다.
제1검출챔버는 상기 제1물질이 고정배치될 수 있는 고정영역을 포함할 수 있다.
보로네이트 모이어티는 붕산(boric acid), 보로네이트 화합물 및 페닐보론산(phenylboronic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
제2검출챔버는 상기 보로네이트 모이어티를 포함하는 제2물질이 고정배치될 수 있는 고정영역을 포함할 수 있다.
검출챔버 내의 고정영역은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다.
검출챔버 내의 고정영역은 금, 은, 백금, 알루미늄 또는 구리를 포함할 수 있다.
챔버 사이의 유체 이송이 밸브에 의해 조절될 수 있다.
밸브는 상전이 물질과 발열유체의 혼합물로 이루어질 수 있다.
상전이 물질은 왁스, 겔 및 열가소성 수지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
발열유체는 캐리어 오일과 상기 캐리어 오일에 분산된 다수의 미세 발열입자를 포함하고, 상기 미세발열입자는 미세 금속 산화물입자일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의한 미세유동장치는 플랫폼, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 미세유동구조물, 검출유닛 및 상기 밸브에 에너지를 공급하기 위한 외부에너지원을 포함하고, 상기 플랫폼의 회전에 따른 원심력을 이용하여 미세유동구조물 내의 유체를 이송하는 것을 특징으로 한다.
외부 에너지원은 레이저 광원일 수 있다.
검출유닛은 상기 발광반응물질의 화학발광반응을 통해 발생하는 광을 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의한 헤모글로빈 측정방법은 혈액을 시료챔버에 주입하여 상기 혈액을 제1검출챔버로 이송하고; 상기 혈액이 상기 제1검출챔버로 이송되면, 상기 제1검출챔버 내에 고정배치된 제1물질을 상기 혈액 내의 헤모글로빈과 결합시키고; 상기 제1검출챔버를 거친 혈액이 제2검출챔버로 이송되면, 상기 제2검출챔버 내에 고정배치된 보로네이트 모이어티를 포함하는 제2물질을 상기 혈액 내의 당화 헤모글로빈과 결합시키고; 시약챔버 내에 수용된 발광반응물질을 상기 제1검출챔버와 제2검출챔버로 이송하여 화학발광반응을 일으키고; 검출유닛에서 상기 제1검출챔버와 제2검출챔버에서 화학발광반응에 의해 발생한 광을 검출하여 헤모글로빈을 측정하는 것을 특징으로 한다.
화학발광반응에 의해 발생한 광을 검출하여 헤모글로빈을 측정하는 것은, 상기 제1검출챔버의 광을 측정하여 상기 혈액 내의 헤모글로빈을 측정하고, 상기 제2검출챔버의 광을 측정하여 상기 혈액 내의 당화 헤모글로빈을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 당화 헤모글로빈의 선택적인 검출을 위해 생체물질인 항체와 같이 다루기 어려운 물질을 사용하지 않고 Cis-diol 분자와 보로네이트 모이어티의 결합을 통해 당화 헤모글로빈을 선택적으로 검출할 수 있다.
또한 화학발광반응을 통해 헤모글로빈을 검출하여, 헤모글로빈을 검출하기 위한 추가 표지과정을 생략함으로써, 측정장치의 소형화가 가능하고 저렴한 비용으로 제작할 수 있다.
또한 하나의 미세유동구조물 내에서 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 동시에 검출할 수 있고, 이를 통해 전체 헤모글로빈 내의 당화 헤모글로빈의 함량비율을 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치에서 헤모글로빈을 검출하는 원리를 대략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치에서 당화 헤모글로빈을 검출하는 원리를 대략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치를 이용하여 헤모글로빈을 검출하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치를 이용하여 측정한 화학발광의 세기를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 당화 헤모글로빈의 농도와 그에 따른 화학발광세기를 나타낸 표준곡선이다.
이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 바람직한 예시적 구체예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 하지만, 본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예들은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 예시적 구체예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.
도면에서 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 나타낸다. 도시된 챔버 및 채널 등의 구조물은 그 형상이 단순화되고, 그 크기의 비가 실제와 달리 확대되거나 축소된 것일 수 있다. 미세유동장치(microfluidic device), 미세 입자(micro-particle) 등의 표현에서 '마이크로(micro-)'는 매크로(macro-)에 대비되는 의미로 사용된 것일 뿐 크기 단위로서 한정적으로 해석되어서는 안 될 것이다.
　
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치(200)는 플랫폼(platform)(180), 플랫폼(180) 상에 배치된 다수의 챔버, 챔버를 연결하는 채널 및 채널의 개폐를 위한 밸브를 포함하는 하나 이상의 미세유동구조물(170) 및 검출유닛(미도시)을 포함할 수 있다.
플랫폼(180)은 원형의 디스크 형상의 플랫폼(180)을 포함할 수 있다. 그러나 플랫폼(180)은 디스크 형상을 가지는 것으로 한정되는 것은 아니다. 플랫폼(180)은 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴 등의 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다. 즉, 플랫폼(180)은 플라스틱, PMMA(Polymethylmethacrylate), 유리, 운모, 실리카, 실리콘 웨이퍼의 재료, 플라스틱 등의 다양한 재료로부터 선택될 수 있다. 경제성, 가공의 용이성 때문에 플라스틱을 사용할 수 있다. 사용 가능한 플라스틱 재료의 예로서, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트 등을 들 수 있다.
또한 플랫폼(180)은 여러 층의 판으로 이루어질 수 있다. 판과 판이 서로 마주보는 면에 챔버나 채널 등에 해당하는 음각 구조물을 만들고 이들을 접합함으로써 플랫폼(180) 내부에 공간과 채널을 제공할 수 있다. 판과 판의 접합은 접착제나 양면 접착 테이프를 이용한 접착이나 초음파 융착 등 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
플랫폼(180)에는 하나 또는 다수의 미세유동구조물(170)이 마련될 수 있다. 예를 들면, 플랫폼(180)을 수 개의 영역으로 나누고 각 영역마다 서로 독립적으로 작동되는 미세유동구조물(170)이 마련될 수 있다.
'미세유동구조물'이란, 특정한 형태의 구조물을 지칭하는 것이 아니라, 다수의 챔버와 채널 그리고 밸브로 이루어져 유체 유동을 수반하는 구조물을 포괄적으로 지칭한다. 따라서, '미세유동구조물'은 챔버와 채널 및 밸브의 배치상의 특징 및 그 내부에 수용되어 있는 물질의 종류에 따라 각기 다른 기능을 수행하는 유닛을 구성할 수 있다.
원심력을 유체의 이송을 위한 구동압력으로 할 경우, 플랫폼(180)은 회전 가능한 디스크형일 수 있다. 그러나 플랫폼(180)은 디스크 형상으로 한정되는 것은 아니다. 그 자체로서 회전 가능한 온전한 원판 형상뿐만 아니라 회전 가능한 프레임(frame)에 안착되어 회전할 수 있는 부채꼴 등의 형상일 수도 있다.　플랫폼(180)의 회전을 위해 회전구동부를 포함하여 이를 통해 고속 회전할 수 있다.
챔버는 시료챔버(110), 시약챔버(120), 제1검출챔버(130) 및 제2검출챔버(140)를 포함한다.
시료챔버(110)는 혈액 등의 유체 상태의 시료를 수용하기 위한 공간을 제공한다.
시료챔버(110)는 시료를 주입하기 위한 시료 주입구와 시료가 수용되는 수용부를 구비한다. 수용부에는 제1검출챔버(130)와 연결되는 배출구가 마련될 수 있고 배출구에는 유체시료의 흐름을 통제하기 위한 밸브가 설치될 수 있다. 밸브는 채널을 통한 시료의 흐름을 제어한다. 밸브는 다양한 형태의 미세유동밸브가 채용될 수 있다. 예로서, 밸브는 외부로부터 동력을 전달받아 개방되기 전에는 유체가 흐를 수 없도록 채널을 폐쇄하고 있는, 소위 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다. 시료 주입구와 수용부 사이에는 시료 주입구를 통하여 주입되는 시료의 주입압력에 의하여 수용부로 시료가 흘러가도록 하는 한편, 수용부에 도달된 시료가 다시 시료 주입구 쪽으로 역류하지 않도록 하기 위하여 모세관 압력을 형성할 수 있는 구조물, 즉 소정 크기 이상의 압력이 작용하는 경우에만 시료를 통과시키는 모세관 밸브의 역할을 하는 구조물이 설치될 수 있다.
시약챔버(120)는 화학발광반응을 일으키는 반응물질을 수용한다.
화학발광반응은 반응물 A와 B가 반응하여 들뜬 상태의 중간체를 형성하고, 그 중간체가 바닥상태가 되면서 빛을 방출하는 반응이다. 그 간략한 반응식은 다음과 같다.　
[반응식 1]
[A] + [B] → [Intermediate] → [Product] + light
　
본 발명의 일 실시예에 따르면 반응물질은 발광물질과 산화제를 포함할 수 있다. 발광물질은　luminol, ucigenin, DTMC(7-(4,6-Dichloro-1,3,5-triazinylamino)-4-methylcoumarin), pyrene, perylene, p-quaterphenyl, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene, 1,3-Cyclohexanedione, 1,4-bis(5-phenyloxazol)benzene, bis(2,4-dimethylpentadienyl)ruthenium, 1-Ethylnaphthalene, 1-Pyrenedodecanoic acid, 2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde, 2-Aminoacridone, 3-Phenylumbelliferone, 3,3′-Diethylthiadicarbocyanine iodide, 4-Hydroxybenzhydrazide, 6-Aminofluorescein 및 7-Ethoxy-4-methylcoumarin 7-Methoxycoumarin로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
전술한 발광물질들이 화학발광반응을 일으키면서 방출하는 빛의 파장은 ucigenin 364 nm, 7-(4,6-Dichloro-1,3,5-triazinylamino)-4-methylcoumarin (DTMC) 450 nm, pyrene 472 nm, perylene 490 nm, p-quaterphenyl 294 nm, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene 428 nm, 1,3-Cyclohexanedione 458 nm, 1,4-bis(5-phenyloxazol)benzene 358nm, bis(2,4-dimethylpentadienyl)ruthenium 620 nm, 1-Ethylnaphthalene 337nm, 1-Pyrenedodecanoic acid 377 nm, 2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde 480 nm, 2-Aminoacridone 538 nm, 3-Phenylumbelliferone 472 nm, 3,3′-Diethylthiadicarbocyanine iodide 700 nm, 4-Hydroxybenzhydrazide 425 nm, 6-Aminofluorescein 520 nm, 7-Ethoxy-4-methylcoumarin 377 nm, 7-Methoxycoumarin 385 nm 이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 산화제는 H2O2를 포함할 수 있다.
Luminol을 발광물질의 일 예로 하고, H2O2를 산화제의 일 예로 하여 화학발광반응을 이하 설명한다.
　
[화학식 1]
Figure pat00001
　
[화학식 1]은 발광물질인 luminol과 산화제인 H2O2의 화학발광반응을 나타낸다. Luminol은 H2O2와 반응하면 들뜬 상태의 3-aminophthalate(3-APA)가 된다. 이 들뜬 상태의 3-APA가 바닥 상태로 떨어지면서 425 nm 파장의 빛을 낸다. Luminol 화학 발광 반응에서는 금속 이온이나 금속 착물 그리고 효소 등이 촉매로 작용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예는 헤모글로빈의 검출 방법으로 헤모글로빈이 포함하고 있는 전이금속 Fe의 luminol 촉매반응을 이용한 화학발광 방법을 제안한다.
시약챔버(120)는 제1검출챔버(130)와 채널을 통해 연결되고 시약의 흐름을 통제하기 위해 채널에 밸브가 설치될 수 있다. 밸브는 채널을 통한 시료의 흐름을 제어한다. 밸브는 다양한 형태의 미세유동밸브가 채용될 수 있다. 예로서, 밸브는 전술한 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다.
검출챔버는 비드(bead), 마이크로스피어(microphere), 나노파티클(nanoparticle), 젤(gel), 멤브레인(membrane), 필름(film), 중공 매트릭스(porous matrix) 또는 마이크로채널(microchannel)의 형태일 수 있다.
제1검출챔버(130)는 헤모글로빈(c)과 비특이적으로 결합하는 제1물질(b)을 포함하고, 제1물질(b)은 양전하를 띠는 물질로 아민기 또는 폴리아민기를 포함할 수 있다(도2 참조).
제2검출챔버(140)는 당화 헤모글로빈(e)과 특이적으로 결합하는 제2물질(d)을 포함하고, 제2물질(d)은 당화 헤모글로빈(e)의 Cis-diol의 수산기와 결합할 수 있는 물질이다. 따라서 당화 헤모글로빈(e)의 Cis-diol의 수산기와 결합할 수 있는 제2물질(d)은 보로네이트 모이어티를 가지며, 보로네이트 모이어티는 붕산(boric acid), 보로네이트 화합물 및 페닐보론산(phenylboronic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다(도 3참조).
예로서, 보로네이트 모이어티를 가지는 제2물질(d)에는 4-카르복시페닐보론산(4-carboxyphenylboronic acid), 3-니트로-5-카르복시페닐보론산(3-nitro-5-carboxy phenylboronic acid), m-아미노페닐보론산(m-aminophenylboronic acid), 4-메트랍토페닐브론산(4-mercaptophenylboronic acid), 싸이오펜-3-보론산(thiophene-3-boronic acid), 페닐보론산 터미네이티드 알켄 티올(phenylboronic acid terminated alkane thiol)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.　
전술한 보로네이트 모이어티(HO-B-OH)가 당화 헤모글로빈(e)의 Cis-diol과 결합하여, 제2검출챔버(140)에 당화 헤모글로빈(e)을 고정시킬 수 있다.　
당화 헤모글로빈은 과거 2~3개월 동안의 사람의 평균 혈당치를 나타내는 정확한 지표로서, 당뇨병 환자의 혈액 내의 포도당 수준을 제어함에 있어 매우 중요한 생체분자이다.
이러한 혈액 내의 당화 헤모글로빈을　측정하기 위한 다양한 측정법이 개발되었다. 현재 상업적으로 응용되고 있는 방법으로는 이온교환크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 전기영동법, 복합 착색법 등이 있으나, 이들 방법은 사용방법이 어려우며 복잡하고 숙련된 기술이 요구된다. 또한, 당화 헤모글로빈의　N-말단 펩타이드 잔기를 인식할 수 있는 항체를 이용하여 당화 헤모글로빈을　정량하는 면역학적 방법도 개발되었으나, 이는 항체가 당화 헤모글로빈의　당화된 특정부위를 고감도로 인식해야 하며, 또한 항체가 인식할 수 있도록 당화 헤모글로빈이　변형되어야 하는 제한이 있다. 또한, 항원-항체 복합체 형성이 어려워 여러 개의 항원 결정기로 이루어진 폴리합텐(polyhapten)을 반응시켜 이를 측정하는 혼탁도 검사도 함께 이루어져야 하는 단점이 있다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 당화 헤모글로빈을　변형시키지 않고 또한 개발에 상당한 노력이 요구되는 당화 헤모글로빈에　특이한 항체를 이용하지 않고, 당화 헤모글로빈 자체 내에 존재하는 Cis-diol의 수산기와 보로네이트 모이어티를 결합시켜 용이하게 당화 헤모글로빈을　검출할 수 있게 된다. 당화 헤모글로빈(glycated hemoglobin)은 β 체인의 발린(valine) 말단 아민에 글루코오즈(glucose)가 공유결합된 형태인 HbA1c 형태로 두 개의 β 체인에 각각 Cis-diol를 가진다. 즉, 당화 헤모글로빈의 Cis-diol이 제2물질(d)의 보로네이트 모이어티와 결합하여 당화 헤모글로빈이 제2검출챔버(140) 내에 고정된다.
제1검출챔버(130)와 제2검출챔버(140)는 제1물질(b)과 제2물질(d)이 각각 고정배치될 수 있는 고정영역(a)을 포함할 수 있다. 고정영역(a)은 검출챔버의 내부표면일 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다. 고정영역(a)은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있다. 또는 고정영역(a)은 금, 은, 백금, 알루미늄 또는 구리로 이루어질 수 있다. 또는 고정영역(a)은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영 또는 플라스틱으로 이루어진 후, 그 상부에 금, 은, 백금, 알루미늄 또는 구리로 코팅될 수 있다.
제1물질(b) 및 제2물질(d)은 물리적 또는 전기화학적 방법 등과 같은 통상적인 방법으로 전술한 고정영역(a)에 고정될 수 있다. 예로서, 진공여과법, 자기조립법, 랭뮤어-블로제트법, 용액캐스팅법, 바코팅법, 침지코팅법, 스핀코팅법, 분사코팅법 또는 롤투롤법으로 각 검출챔버의 고정영역에 제1물질(b) 및 제2물질(d)을 고정배치할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 　
제1검출챔버(130)는 채널을 통해 시료챔버(110)와 시약챔버(120)에 연결될 수 있고 유체의 흐름을 통제하기 위해 채널에 밸브가 설치될 수 있다. 밸브는 다양한 형태의 미세유동밸브가 채용될 수 있다. 예로서, 밸브는 전술한 소위 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다. 제2검출챔버(140)는 채널을 통해 제1검출챔버(130)에 연결될 수 있다.
챔버는 전술한 시료챔버(110), 시약챔버(120), 제1, 2검출챔버 외에 제1, 2 검출챔버에서의 반응 후의 잔류물을 세척하기 위한 세척액(washing buffer)이 수용되는 세척액챔버(150)와 세척액챔버(150)의 세척액에 의해 세척된 후의 잔류물, 폐기되는 불순물을 수용하는 웨이스트챔버(160)를 더 포함할 수 있다.
세척액챔버(150)는 제1검출챔버(130) 또는 제2검출챔버(140)와 채널을 통해 연결되고, 유체의 흐름을 통제하기 위해 채널에 밸브가 설치될 수 있다. 밸브는 전술한 폐쇄된 밸브일 수 있다.
웨이스트챔버(160)는 제1, 2 검출챔버와 채널을 통해 연결되고, 유체의 흐름을 통제하기 위해 채널에 밸브가 설치될 수 있다. 밸브는 외부로부터 동력을 전달받아 개방되기 전에는 유체가 흐를 수 없도록 채널을 폐쇄하고 있는 소위 폐쇄된 밸브와 동력을 전달받아 채널을 폐쇄하기 전에는 유체가 흐를 수 있도록 채널을 개방하고 있는 소위 개방된 밸브가 제1, 2 검출챔버의 출구 쪽 채널에 순차적으로 설치되어 유체의 흐름을 보다 정밀하게 제어할 수 있다.
채널에 설치되어 유체의 흐름을 조절하는 밸브는　구체적으로 상전이 물질(phase transition material)과 발열 유체를 혼합하여 제조될 수 있다. 상전이 물질은 왁스(wax), 겔(gel), 또는 열가소성 수지일 수 있다. 왁스로는 예컨대, 파라핀 왁스(paraffin wax)가 채용될 수 있고, 겔로는 예컨대, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylates), 또는 폴리비닐아미드(polyvinylamides) 등이 채용될 수 있으며, 열가소성 수지로는 예컨대, COC(cyclic olefin copolymer), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PFA(perfluoralkoxy), PVC(polyvinylchloride), PP(polypropylene), PET(polyethylene terephthalate), PEEK(polyetheretherketone), PA(polyamide), PSU(polysulfone), 또는 PVDF(polyvinylidene fluoride) 등이 채용될 수 있다. 발열 유체는 소수성(疏水性) 캐리어 오일과, 캐리어 오일에 분산된 다수의 미세 발열입자를 포함한다. 미세 발열입자는 수십 내지 수백 나노미터(nm)의 직경을 가질 수 있다. 미세 발열입자는 예컨대, 레이저빔 조사 등과 같은 방법으로 에너지가 공급되면 그 에너지에 의해 온도가 급격히 상승하여 발열하는 성질을 갖는다. 미세 발열입자는 강자성(强磁性)의 미세한 금속 산화물 입자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치(200)는 밸브에 에너지를 공급하는 외부 에너지원을 더 포함할 수 있고 이는 레이저 광원일 수 있다. 레이저 광원은 레이저 다이오드(LD; laser diode)를 구비하여, 응고된 밸브를 향해 레이저빔을 조사할 수 있도록 마련된다. 레이저 광원이 응고된 밸브를 향해 레이저빔을 조사하면, 레이저빔을 통해 공급된 외부 에너지에 의해 밸브가 유동 가능하게 용융되며 급격히 팽창하여 채널의 개폐를 조절한다.
검출유닛(미도시)은 미세유동구조물(170)의 외부에 배치될 수 있고, 검출챔버 내에서 화학발광반응을 통해 발생하는 빛의 세기를 측정할 수 있다. 검출유닛은 검출챔버 내에서 화학발광반응을 통해 발생하는 빛을 수신하는 수광부와 수광부에서 수신한 빛의 세기를 통해 분석대상물질의 농도를 산출하는 분석부를 포함할 수 있다.
수광부는 입사광의 세기에 따른 전기적 신호를 발생시키는 것으로서, 예를 들면, 공핍층 포토 다이오드(depletionlayer photo diode)나 애벌런치 포토 다이오드(avalanche photo diode, APD) 또는 광전자증배관(photomultiplier tubes, PMT)등을 포함할 수 있다.
분석부는 수광부에서 수신된 빛의 세기와 미리 저장된 표준곡선을 이용하여 검출챔버 내의 분석대상물질의 농도를 산출할 수 있다.
　
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상술한 미세유동장치를 이용하여 헤모글로빈을 검출하는 방법을 나타내는 순서도이다.
일 예로서, 피검자로부터 채취한 전혈(whole blood)을 시료챔버(110)에 주입하고(10), 시료챔버(110)와 제1검출챔버(130)를 연결하는 채널의 폐쇄된 밸브를 개방시켜 플랫폼(180)의 회전에 의해 발생한 원심력을 구동압력으로 하여 혈액을 제1검출챔버(130)로 이송시킨다(20).
시료챔버(110)로부터 제1검출챔버(130)로 혈액이 유입되면 제1검출챔버(130)에 고정된 제1물질(b)이 혈액 내의 헤모글로빈(c)과 결합한다(30). 제1물질(b)은 양성콜로이드인 헤모글로빈(c)과 결합할 수 있는 물질로 양전하를 띠는 물질을 가지며, 양전하를 띠는 물질은 아민기 또는 폴리 아민기를 포함할 수 있다. 제1물질(b)은 제1검출챔버(130) 내부의 고정영역(a)에 고정되는데 이때 특별한 정렬없이 고정영역(a)에 부착되어도 무관하다. 제1물질(b)은 제1검출챔버(130) 내부의 고정영역(a)에 화학적, 물리적 또는 물리화학적 방법 등과 같은 통상적인 방법으로 고정될 수 있다. 예로서, 진공여과법, 자기조립법, 랭뮤어-블로제트법, 용액캐스팅법, 바코팅법, 침지코팅법, 스핀코팅법, 분사코팅법 또는 롤투롤법으로 제1물질(b)을 제1검출챔버(130) 내부에 고정화시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
전술한 제1물질(b)의 아민기 또는 폴리 아민기가 헤모글로빈(c)과 결합하여, 제1검출챔버(130)에 헤모글로빈(c)을 고정시킬 수 있다. 이 과정에서 제1물질(b)이　헤모글로빈(c)과 잘 결합할 수 있도록 플랫폼(180)을 좌우로 수회 흔들어 주는 것이 가능하다.
제1검출챔버(130)를 거친 혈액이 원심력을 구동압력으로 하여 제2검출챔버(140)로 이송되면(40), 제2검출챔버(140)에 고정된 제2물질(d)이 혈액 내의 당화 헤모글로빈(e)과 특이적으로 결합한다(50). 제2물질(d)은 당화 헤모글로빈(e)의 Cis-diol의 수산기와 결합할 수 있는 물질로, 보로네이트 모이어티를 가지며, 보로네이트 모이어티는 붕산(boric acid), 보로네이트 화합물 및 페닐보론산(phenylboronic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.　예로서, 보로네이트 모이어티를 가지는 제2물질(d)에는 4-카르복시페닐보론산(4-carboxyphenylboronic acid), 3-니트로-5-카르복시페닐보론산(3-nitro-5-carboxy phenylboronic acid), m-아미노페닐보론산(m-aminophenylboronic acid), 4-메트랍토페닐브론산(4-mercaptophenylboronic acid), 싸이오펜-3-보론산(thiophene-3-boronic acid), 페닐보론산 터미네이티드 알켄 티올(phenylboronic acid terminated alkane thiol)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.　제2물질(d)은 제2검출챔버(140) 내부의 고정영역(a)에 고정되는데 이때 특별한 정렬없이 고정영역(a)에 부착되어도 무관하다. 제2물질(d) 또한 전술한 제1물질(b)과 마찬가지로 제2검출챔버(140)의 내부의 고정영역(a)에 화학적, 물리적 또는 물리 화학적 방법 등과 같은 통상적인 방법으로 고정될 수 있다.
전술한 제2물질(d)의 보로네이트 모이어티(HO-B-OH)가 당화 헤모글로빈(e)의 Cis-diol과 결합하여, 제2검출챔버(140)에 당화 헤모글로빈(e)을 고정시킬 수 있다. 이 과정에서 제2물질(d)이　당화 헤모글로빈(e)과 잘 결합할 수 있도록 플랫폼(180)을 좌우로 수회 흔들어 주는 것이 가능하다.
제1, 2 검출챔버에서 헤모글로빈(c)과 당화 헤모글로빈(e)이 각각 제1물질(b) 및 제2물질(d)과 결합하여 각 챔버의 고정영역(a)에 고정되면, 세척액챔버(150)와 제1검출챔버(130)를 연결하는 채널의 폐쇄된 밸브를 개방하고 원심력을 구동압력으로 하여 세척액을 제1검출챔버(130)와 제2검출챔버(140)로 유입시킨다(60).
세척액이 제1, 2검출챔버에 유입되면, 제1, 2검출챔버와 웨이스트챔버(160)를 연결하는 채널의 폐쇄된 밸브를 개방하여 세척액을 통해 검출챔버 내의 미결합 잔여물을 웨이스트챔버(160)로 이송하여 제거한다(70). 미결합 잔여물을 웨이스트챔버(160)로 이송하여 제거하면, 개방된 밸브를 폐쇄하여 제1, 2검출챔버로 유입되는 화학발광반응물질이 웨이스트챔버(160)로 빠져나가는 것을 방지한다.
검출챔버 내의 미결합 잔여물이 제거되면, 시약챔버(120)와 제1검출챔버(130)를 연결하는 채널의 폐쇄된 밸브를 개방하고, 원심력을 구동압력으로 하여 화학발광반응물질을 제1검출챔버(130)와 제2검출챔버(140)로 이송한다(80). 화학발광반응물질은 전술한 발광물질과 산화제를 포함하고, 그 예로서 발광물질로 luminol을 이용하고 산화제로 H2O2를 이용한다.
Luminol과 H2O2는 헤모글로빈에 포함된 전이금속인 Fe를 촉매로 하여 화학발광반응을 일으킨다(90).
검출유닛은 제1검출챔버(130)와 제2검출챔버(140)의 화학발광반응으로 발생한 빛의 세기를 측정하여 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 농도를 검출한다. 검출유닛의 수광부는 검출챔버의 화학발광반응으로 발생한 빛의 세기를 측정하고, 분석부는 미리 저장된 당화 헤모글로빈의 농도에 따른 화학발광세기를 나타내는 표준곡선을 이용하여 수광부가 측정한 빛의 세기로부터 당화 헤모글로빈의 농도를 검출한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치를 이용하여 측정한 화학발광의 세기를 도시한 그래프이다.
도 5를 참조하면, 5%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액 내의 총 헤모글로빈의 화학발광세기(그래프의 왼쪽 6개의 피크 중, 세 개의 높은 피크)와 당화 헤모글로빈의 화학발광세기(그래프의 왼쪽 6개의 피크 중, 세 개의 낮은 피크)를 각각 세 차례에 걸쳐 측정하였고, 10%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액의 총 헤모글로빈의 화학발광세기(그래프의 오른쪽 6개의 피크 중, 세 개의 높은 피크)와 당화 헤모글로빈의 화학발광세기(그래프의 오른쪽 6개의 피크 중, 세 개의 낮은 피크)를 각각 세 차례에 걸쳐 측정하였다.
각 측정값을 이하 표 1에 나타내었다.
　
　
총 헤모글로빈의
화학발광강도(cps)
　
당화 헤모글로빈의 화학발광강도
(cps)
당화 헤모글로빈의 비율(%)
총 헤모글로빈의
화학발광강도
(cps)
당화 헤모글로빈의 화학발광강도
(cps)
당화 헤모글로빈의 비율(%)
　
5.41454×106
　
298662
5.51593
5.85759×106
515508
8.80068
　
5.32151×106
　
279228
5.24716
5.2923×106
510786
9.65149
　
5.46848×106
　
282428
5.16465
5.56381×106
538286
9.67477
표 1의 왼쪽 세 개의 열은 5%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액으로 측정한 결과를, 오른쪽 세 개의 열은 10%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액으로 측정한 결과를 나타낸다.
표 1의 왼쪽 세 개의 열을 참조하면, 5%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액의 총 헤모글로빈의 화학발광세기(첫 번째 열)에 대한 당화 헤모글로빈의 화학발광세기(두 번째 열)의 비율(세 번째 열)이 실제 당화 헤모글로빈의 농도(5%)에 매우 근접함을 알 수 있다.
표 1의 오른쪽 세 개의 열을 참조하면, 10%의 당화 헤모글로빈을 포함하는 혈액의 총 헤모글로빈의 화학발광세기(네 번째 열)에 대한 당화 헤모글로빈의 화학발광세기(다섯 번째 열)의 비율(여섯 번째 열)이 실제 당화 헤모글로빈의 농도(10%)에 매우 근접함을 알 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 당화 헤모글로빈의 농도와 그에 따른 화학발광세기를 나타낸 표준곡선이다.　
이와 같은 표준곡선은 당화 헤모글로빈의 농도를 달리하여 각 농도에 따른 화학발광세기를 플롯팅하여 미리 얻을 수 있다. 예로서, 당화 헤모글로빈의 농도를 0%, 2.5%, 5%, 10% 및 17%로 달리하여 그에 따른 화학발광세기를 플롯팅함으로써 도 6의 표준곡선을 얻을 수 있다. 검출유닛의 수광부가 검출챔버 내의 화학발광반응을 통해 발생한 빛의 세기를 측정하면 분석부는 도 6과 같은 표준곡선을 이용하여, 측정한 빛의 강도를 통해 당화 헤모글로빈의 농도를 산출해낼 수 있다.
제1검출챔버(130) 내의 화학발광반응을 통해 발생하는 빛의 세기를 측정함으로써, 총 헤모글로빈의 농도를 검출할 수 있고, 이어서 제2검출챔버(140) 내의 화학발광반응을 통해 발생하는 빛의 세기를 측정함으로써, 당화 헤모글로빈의 농도를 검출할 수 있다. 하나의 미세유동구조물(170)에서 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 농도를 한 번에 검출할 수 있고, 이를 통해 총 헤모글로빈에 대한 당화 헤모글로빈의 퍼센트 농도 또한 산출할 수 있다.
　
첨부된 도면에 도시되어 설명된 특정의 실시 예들은 단지 본 발명의 예로서 이해되어 지고, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 본 발명에 기술된 기술적 사상의 범위에서도 다양한 다른 변경이 발생될 수 있으므로, 본 발명은 보여지거나 기술된 특정의 구성 및 배열로 제한되지 않는 것은 자명하다.
110 : 시료챔버 　　　　　　　　　　　　　　　　　120 : 시약챔버
130 : 제1검출챔버 　　　　　　　　　　　　　　140 : 제2검출챔버
150 : 세척액챔버 　　　　　　　　　　　　　　　160 : 웨이스트챔버
170 : 미세유동구조물 　　　　　　　　　　　180 : 플랫폼
200 : 미세유동장치

Claims (18)

  1. 혈액을 수용하는 시료챔버;
    발광반응물질을 포함하는 시약챔버;
    양전하를 띠는 제1물질을 포함하는 제1검출챔버;
    상기 제1검출챔버에 연결되고, 보로네이트 모이어티를 가지는 제2물질을 포함하는 제2검출챔버 및
    상기 챔버들을 연결하는 채널을 포함하는 미세유동구조물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발광반응물질은 발광물질과 산화제를 포함하는 미세유동구조물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 발광물질은 luminol, ucigenin, DTMC(7-(4,6-Dichloro-1,3,5-triazinylamino)-4-methylcoumarin), pyrene, perylene, p-quaterphenyl, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene, 1,3-Cyclohexanedione, 1,4-bis(5-phenyloxazol)benzene, bis(2,4-dimethylpentadienyl)ruthenium, 1-Ethylnaphthalene, 1-Pyrenedodecanoic acid, 2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde, 2-Aminoacridone, 3-Phenylumbelliferone, 3,3′-Diethylthiadicarbocyanine iodide, 4-Hydroxybenzhydrazide, 6-Aminofluorescein 및 7-Ethoxy-4-methylcoumarin 7-Methoxycoumarin로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 미세유동구조물(170)
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1검출챔버 내의 제1물질은 아민기 또는 폴리아민기를 포함하는 미세유동구조물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1검출챔버는 상기 제1물질이 고정배치될 수 있는 고정영역을 포함하는 미세유동구조물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 보로네이트 모이어티는 붕산(boric acid), 보로네이트 화합물 및 페닐보론산(phenylboronic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 미세유동구조물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2검출챔버는 상기 보로네이트 모이어티를 포함하는 제2물질이 고정배치될 수 있는 고정영역을 포함하는 미세유동구조물.
  8. 제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출챔버 내의 고정영역은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱으로 형성되는 미세유동구조물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출챔버 내의 고정영역은 금, 은, 백금, 알루미늄 또는 구리를 포함하는 미세유동구조물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 챔버 사이의 유체 이송이 밸브에 의해 조절되는 미세유동구조물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 밸브는 상전이 물질과 발열유체의 혼합물로 이루어진 미세유동구조물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 상전이 물질은 왁스, 겔 및 열가소성 수지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 미세유동구조물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 발열유체는 캐리어 오일과 상기 캐리어 오일에 분산된 다수의 미세 발열입자를 포함하고, 상기 미세발열입자는 미세 금속 산화물입자인 미세유동구조물.
  14. 플랫폼, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 미세유동구조물, 검출유닛 및 상기 밸브에 에너지를 공급하기 위한 외부에너지원을 포함하고, 상기 플랫폼의 회전에 따른 원심력을 이용하여 미세유동구조물 내의 유체를 이송하는 원심력 기반의 미세유동장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 외부 에너지원은 레이저 광원인 원심력 기반의 미세유동장치.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 검출유닛은 상기 발광반응물질의 화학발광반응을 통해 발생하는 광을 검출하는 원심력 기반의 미세유동장치.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 미세유동장치를 이용한 헤모글로빈의 측정방법으로서,
    혈액을 시료챔버에 주입하여 상기 혈액을 제1검출챔버로 이송하고;
    상기 혈액이 상기 제1검출챔버로 이송되면, 상기 제1검출챔버 내에 고정배치된 제1물질을 상기 혈액 내의 헤모글로빈과 결합시키고;
    상기 제1검출챔버를 거친 혈액이 제2검출챔버로 이송되면, 상기 제2검출챔버 내에 고정배치된 보로네이트 모이어티를 포함하는 제2물질을 상기 혈액 내의 당화 헤모글로빈과 결합시키고;
    시약챔버 내에 수용된 발광반응물질을 상기 제1검출챔버와 제2검출챔버로 이송하여 화학발광반응을 일으키고;
    검출유닛에서 상기 제1검출챔버와 제2검출챔버에서 화학발광반응에 의해 발생한 광을 검출하여 헤모글로빈을 측정하는 헤모글로빈 측정방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 화학발광반응에 의해 발생한 광을 검출하여 헤모글로빈을 측정하는 것은,
    상기 제1검출챔버의 광을 측정하여 상기 혈액 내의 헤모글로빈을 측정하고, 상기 제2검출챔버의 광을 측정하여 상기 혈액 내의 당화 헤모글로빈을 측정하는 헤모글로빈의 측정방법.
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