KR101431769B1

KR101431769B1 - 당화 혈색소 측정용 원심력 기반의 미세유동 구조물, 당화 혈색소 측정용 원심력 기반 미세유동 장치 및 당화 혈색소의 측정방법

Info

Publication number: KR101431769B1
Application number: KR1020090122227A
Authority: KR
Inventors: 김인욱; 김나희
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2014-08-20
Also published as: US20110143364A1; EP2510362A4; EP2510362B1; CA2782612A1; KR20110065641A; JP2013513794A; CN102652264A; WO2011071256A2; US8481301B2; WO2011071256A3; EP2510362A2

Abstract

본 발명은 당화 혈색소 측정용 원심력 기반의 미세유동 구조물, 당화 혈색소 측정용 원심력 기반 미세유동 장치 및 당화 혈색소의 측정방법에 관한 것으로서, 당화 혈색소 측정을 위한 여러 방법 중 면역혈청학적 검사법과 친화성 크로마토그래피 측정법을 하나의 디바이스에서 동시에 구현함으로서 혈색소 변이체나 간섭물질을 탐지하고 이를 측정결과 해석에 반영하여 당화 혈색소 측정오차를 배제하거나 교정함으로서 보다 정확한 측정을 달성할 수 있다.

Description

당화 혈색소 측정용 원심력 기반의 미세유동 구조물, 당화 혈색소 측정용 원심력 기반 미세유동 장치 및 당화 혈색소의 측정방법{Centrifugal Microfluidic structure for measuring the glycated hemoglobin, centrifugal microfluidic device for measuring the glycated hemoglobin and method for measuring the glycated hemoglobin}

본 발명은 당화 혈색소 측정용 원심력 기반의 미세유동 구조물, 당화 혈색소 측정용 원심력 기반 미세유동 장치 및 당화 혈색소의 측정방법에 관한 것으로서, 더 상세하게 당화 혈색소 측정을 위한 여러 방법 중 면역혈청학적 검사법과 친화성 크로마토그래피 측정법을 하나의 디바이스에서 동시에 구현함으로서 혈색소 변이체나 간섭물질을 탐지하고 이를 측정결과 해석에 반영하여 당화 혈색소 측정오차를 배제하거나 교정함으로서 보다 정확한 측정을 달성할 수 있는 혈색소 측정용 원심력 기반의 미세유동 구조물, 당화 혈색소 측정용 원심력 기반 미세유동 장치 및 당화 혈색소의 측정방법에 관한 것이다.

일반적으로 미세유동 장치를 구성하는 미세유동 구조물 내에서 유체를 이송하기 위해서는 구동 압력이 필요한데, 구동 압력으로서 모세관압이 이용되기도 하 고, 별도의 펌프에 의한 압력이 이용되기도 한다. 최근에는 이러한 유체 내 소량의 표적 물질 검출을 저렴하고 누구나 손쉽게 다룰 수 있도록 설계된 임상 진단 분석 장치로서, 원형의 디스크 형상의 회전체 플랫폼에 미세유동 구조물을 배치하여 원심력을 이용하는 미세유동 장치, 즉 랩온어디스크 (lab-on-a disk) 혹은 랩씨디 (Lab CD)가 제안되고 있다.

'디스크 (disc) 위의 실험실' 이란 의미의 랩온어디스크 (Lab-on-a-Disc)는 생물 분자의 분석에 필요한 실험실의 각종 장비를 CD 모양의 장치에 집적시킨 장치이다. 디스크 상에 마련된 미세유동 구조물에 혈액 등 생체 시료를 주입하면, 유체를 이송하기 위해서 구동 압력 등 별도의 구동시스템 없이 원심력만을 이용해 시료, 시약 등의 유체를 이동시킬 수 있는 장점이 있다.

당화 혈색소(glycated hemoglobin; Hemoglobin A1c(이하에서 'HbA1c'라고 기술하는 경우도 있다))는 최근 당뇨의 선별 및 진단에서의 역할이 중요한 것으로 인식되고 있어 새로운 환자에 대한 외래전 검사 및 응급검사로서 그 필요성이 증대되고 있다.

외래전 검사 및 응급검사는 검사 시작에서 보고까지 30분 이내에 이루어져야 하고, 그 결과에 따라 다음 단계의 지침이 결정되므로 신속한 검사속도와 정확한 결과보고가 필수적이다.

현재 당화 혈색소 측정을 위한 여러 종류의 가정용 및 현장진단 검사기기가 보급되어 사용 중에 있으나 지금까지 개발된 방법은 보로네이트 친화성(boronate affinity) 측정법 또는 면역응집법 기술에 기초한 측정법 중 한가지 방법만을 사용 하는 방법으로 구성되어 있다. 보로네이트 친화성 측정법은 보로닉산(boronic acid)가 당의 Cis-diol과 결합하는 원리를 이용하여 당화 헤모글로빈과 비당화 헤모글로빈을 분리하는 원리를 이용하고 있다. 또한, 면역응집법 기술에 기초한 측정법은 당화 혈색소에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 복합체에 의한 응집반응을 이용하고 있다.

그러나 두 방법 모두는 각각 측정법 자체의 내재적 특성에 근거하는 오차를 배제할 수 없는 단점이 있다. 즉, 보로네이트 친화성(boronate affinity) 측정법의 경우 혈중에 존재하는 cis-diol을 수용하는 다른 물질들과 교차반응을 일으킬 수 있어 거짓 감소를 보일 수 있으며 면역응집법의 경우 헤모글로빈 변이체(HbF, HbS, HbC)를 측정할 수 없기 때문에 측정결과치의 거짓 감소를 유발할 수 있다.

따라서 혈색소 변이의 종류나 측정법의 종류에 따라 HbA1c 측정 결과가 임상적인 양상과 맞지 않는 경우가 발생할 수 있다. 따라서, 보다 정확한 측정을 위해서는 두 가지 측정법을 모두 사용하는 것이 필요하나 서로 상이한 측정 원리에 의해 하나의 디바이스에서 구현할 수 없는 기술적 난점이 있다. 따라서, 이와 같은 기술적 제한을 해소할 수 있는 새로운 측정법을 제시할 필요성이 있다.

본 발명의 실시예들에 개시된 내용은 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하고자 한다. 구체적으로 당화 혈색소 측정을 위한 여러 방법 중 혈색소 분자의 구조적인 차이에 근거한 측정방법인 면역혈청학적 검사법과 친화성 크로마토그래피 측정법을 하나의 디바이스에서 동시에 구현함으로서 혈색소 변이체나 간섭물질을 탐지하고 이를 측정결과 해석에 반영하여 당화 혈색소 측정오차를 배제하거나 교정함으로서 보다 정확한 측정을 달성할 수 있는 미세유동 구조물을 제공한다. 또한, 회전체와 상기 미세유동 구조물을 포함하는 원심력 기반의 미세유동 장치를 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 다수의 챔버, 상기 챔버들을 연결하는 통로, 및 상기 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하는 원심력 기반의 미세유동 구조물로서, 상기 미세유동 구조물 내에 2종 이상의 당화 혈색소 친화성 입자를 각각 수용하는 챔버 및 대조 챔버를 포함하는 미세유동 구조물를 제공한다.

당화 혈색소 친화성 입자 중 하나는 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자이며, 다른 하나는 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자일 수 있다.

또한, 당화 혈색소 친화성 입자는 원심력 하에서 당화 혈색소 입자를 혼합하거나 침강시킬 수 있는 비중을 가지는 고체상과 결합된 상태일 수 있다.

또한, 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다.

또한, 미세유동 구조물은 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 각 챔버에 연결되는 침강 챔버를 더 포함하며, 상기 침강 챔버는 원심력에 의해 침강된 상기 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한 당화 혈색소를 수용할 수 있다.

또한, 미세유동 구조물은 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 각 챔버 및 대조 챔버에 연결되는 검출 챔버를 더 포함할 수 있다.

또한, 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 각 챔버 및 대조 챔버는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치할 수 있다.

또한, 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 각 챔버 및 대조 챔버에 연결되는 검출 챔버는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 회전체, 하나 이상의 미세유동 구조물 및 검출 유닛을 포함하고, 상기 미세유동 구조물은 다수의 챔버, 챔버들을 연결하는 통로, 및 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하고, 미세유동 구조물 내에 2종 이상의 당화 혈색소 친화성 입자를 각각 수용하는 챔버 및 대조 챔버를 포함하며, 회전체의 회전에 따른 원심력을 이용하여 상기 미세유동 구조물 내의 유체를 이송하는, 원심력 기반의 미세유동 장치를 제공한다.

또한, 검출 유닛은 단색광을 방출하는 광학계를 포함하며, 상기 광학계는 400~600㎚의 광을 이용하여 상기 제1 내지 제3 검출 챔버의 흡광도를 측정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 원심력 기반의 미세유동 장치를 이용한 당화 혈색소 측정방법으로서, 당화 혈색소 친화성 입자로서, 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자를 수용하는 제1 수용 챔버 및 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자를 수용하는 제2 수용 챔버를 준비하는 것; 주입한 혈액 샘플을 용혈시키는 것; 상기 용혈된 혈액 샘플을 제1 및 제2 수용 챔버 및 대조 챔버로 계량된 부피로 분주하는 것; 상기 용혈된 혈액 샘플과 상기 제1 내지 제2 수용 챔버에 각각 수용된 상기 입자와 각각 결합시키는 것; 원심력에 의해 상기 입자와 결합한 당화 혈색소를 침강시키는 것; 상기 제1 내지 제2 수용 챔버 및 상기 대조 챔버의 상청액의 흡광도를 측정하는 것; 하기 제1 식을 이용하여 항체를 기준으로 한 제1 흡광도 비율을 산출하여 항체를 기준으로 한 표준 검량 곡선으로부터 제1 %HbA1c를 구하는 것; 하기 제2 식을 이용하여 보로네이트 친화성을 기준으로 한 제2 흡광도 비율을 산출하여 보로네이트 친화성을 기준으로 한 표준 검량 곡선으로부터 제2 %HbA1c를 구하는 것; 및 상기 제1 %HbA1c 및 제2 %HbA1c를 비교하는 것을 포함한다:

제1 식: 제1 흡광도 비율={(대조 챔버 상청액의 흡광도-제1 수용챔버 상청액의 흡광도)/대조 챔버 상청액의 흡광도}

제2 식: 제2 흡광도 비율={(대조 챔버 상청액의 흡광도-제2 수용챔버 상청액의 흡광도)/대조 챔버 상청액의 흡광도}

또한, 방법은 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 작은 경우 혈액샘플 내에 혈색소 변이체가 존재한다는 정보를 제공하는 것;을 더 포함할 수 있다.

또한, 방법은 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 큰 경우 혈액샘플 내에 시스-디올기를 포함하는 간섭물질이 존재한다는 정보를 제공하는 것;을 더 포함할 수 있다.

이때 당화 혈색소를 침강시키는 것은 상기 제1 및 제2 수용 챔버에 각각 연결된 침강 챔버에서 이루어질 수 있다.

또한, 흡광도를 측정하는 것은 제1 내지 제2 수용 챔버 및 대조 챔버에 연결된 각 검출 챔버로 이송한 후에 이루어질 수 있다.

또한, 흡광도를 측정하는 것은 400~600㎚의 광을 이용할 수 있다.

이때, 상기 방법에 있어서, 상기 과정들 사이에는, 반응하지 않았거나 반응하지 못하는 물질을 제거하기 위하여는 세척단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 바람직한 예시적 구체예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 하지만, 본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예들은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 예시적 구체예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.

당화 혈색소 측정용 미세유동 구조물 및 이를 포함하는 원심력 기반 미세유 동 장치는 혈색소 분자의 구조적인 차이에 근거한 측정방법인 면역혈청학적 검사법과 친화성 크로마토그래피 측정법을 하나의 디바이스에서 동시에 구현함으로서 당화 혈색소를 측정하고 또한, 혈색소 변이체를 탐지할 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 미세유동 구조물은 다수의 챔버, 상기 챔버들을 연결하는 통로, 및 상기 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하는 원심력 기반의 미세유동 구조물로서, 상기 미세유동 구조물 내에 2종 이상의 당화 혈색소 친화성 입자를 각각 수용하는 챔버 및 대조 챔버를 포함한다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 미세유동 장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.

도 1은 분석에 필요한 각종 버퍼액을 저장하는 챔버(120), 다양한 생물학적, 화학적 반응을 수행하기 위한 챔버들, 혈액 샘플을 수용하는 시료 챔버(110), 처리된 유체 및 버퍼액 등을 이동시키기 위한 유체 통로, 이들 통로의 개폐를 제어하기 위한 밸브 장치들이 포함된 본 발명의 미세유동 장치의 일 예시적 구체예에 대한 구성도다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 구체예에서 사용된 회전체는 원형의 디스크 형상의 플랫폼 (platform)일 수 있다. 그러나 플랫폼은 디스크 형상으로 가지는 것으로 한정되는 것은 아니다. 플랫폼은 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴 등의 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다.

플랫폼에는 하나 또는 다수의 미세유동 구조물이 마련될 수 있다. 예를 들면, 플랫폼을 수 개의 영역으로 나누고 각 영역마다 서로 독립적으로 작동되는 미세유동 구조물이 마련될 수 있다.

상기 회전체는 바람직하게는, 플라스틱, PMMA(Polymethylmethacrylate), 유리, 운모, 실리카, 실리콘 웨이퍼의 재료 등의 다양한 재료로부터 선택될 수 있다. 특히, 플라스틱이 경제적 이유, 가공의 용이성 때문에 선호된다. 사용 가능한 플라스틱 재료로는 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 플리에틸렌, 플리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트 등을 들 수 있다.

상기 회전체가 회전되어 원심력에 의해 혈액샘플, 혈액샘플 혼합물, 버퍼액, 반응액 등이 각 챔버로 이동될 수 있다.

상기 회전체에는 시료 챔버(110); 혈액샘플을 용혈하기 위한 버퍼를 수용하는 버퍼 챔버(120); 버퍼 챔버에서 용혈된 혈액샘플이 계량된 부피로 분주되는 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150); 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)에 각각 연결되며, 원심력에 의해 침강된 용혈된 혈액 샘플의 일부를 수용하는 제1 내지 제3 침강 챔버(160, 170, 180); 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)에 각각 연결되며, 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)의 상층액을 수용하는 제1 내지 제3 검출 챔버(190, 200, 210); 챔버들을 연결하는 통로; 및 통로의 개폐를 위한 밸브 등으로 구성된 미세유동 구조물(100)이 배치될 수 있다.

시료 챔버(110)와 버퍼 챔버(120) 사이에는 밸브(220)가 배치될 수 있다. 밸브(220)는 시료 챔버(110)와 버퍼 챔버(120) 사이의 채널에서의 혈액 샘플의 흐름을 제어한다. 밸브(220)로서 다양한 형태의 미세유동 밸브가 채용될 수 있다. 예로서 밸브(220)는 외부로부터 동력을 전달받아 개방되기 전에는 유체가 흐를 수 없도록 채널을 폐쇄하고 있는, 소위 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다.

버퍼 챔버(120)에는 시료 챔버(110)에 수용된 혈액 샘플을 용혈시키기 위한 적혈구 용혈 버퍼(red blood cell lysis buffer)가 수용되어 있다. 적혈구 용혈 버퍼는 일반적으로 사용되는 적혈구 용혈제를 포함할 수 있고, 예로서 계면활성제가 들어 있는 버퍼용액인 20mM 헤퍼스 완충용액(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid; HEPES; pH 8.1); 1M Tris pH 7.6 10㎖, MgCl2 5㎖, 1M NaCl 10㎖, 3차 증류수 975㎖로 제조한 적혈구 용해 완충용액 등을 들 수 있다. 용혈된 혈액샘플에는 혈색소(hemoglobin), 당화 혈색소(glycated hemoglobin) 외에 백혈구, 혈소판 등의 다른 혈구 성분 및 혈장 성분이 포함되어 있다.

버퍼 챔버(120)에서 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)로 계량된 부피의 용혈된 혈액 샘플이 분주된다.

계량된 부피로 용혈된 혈액 샘플을 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)로 분주하기 위해서, 버퍼 챔버(120)와 각 수용 챔버(130~150) 사이에서의 용혈된 혈액 샘플의 이동거리 등의 매개변수를 제어하여, 등가속원운동으로 하는 회전체에서 동일 시간에 동일한 부피가 각 수용 챔버(130~150)로 분주될 수 있도록 할 수 있다.

또는 미세유동 구조물의 다른 변형례를 도시하는 도 2와 같이, 동일한 부피로 분주하기 위해서, 계량 챔버(300, 301, 320)가 버퍼 챔버(120)와 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150) 사이에 각각 존재할 수 있다. 계량 챔버(300~320)는 측정에 필용한 양의 용혈된 혈액 샘플을 수용할 수 있는 용적을 갖는다. 이 경우, 계량 챔버(300~320)의 출구에는 용혈된 혈액 샘플의 흐름을 제어하기 위한 밸브가 각각 형성되며, 이 밸브들은 상술한 밸브(220)와 동일한 폐쇄된 밸브이다. 계량 챔버(300~320)는 채널을 통해 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)와 연결된다.

제1 수용 챔버(120)는 제1 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하고, 제2 수용 챔버(130)는 제2 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하여, 이들 당화 혈색소 친화성 입자는 용혈된 혈액 샘플 중 당화 혈색소와 각각 결합한다.

제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 원심력 하에서 당화 혈색소 입자를 혼합하거나 침강시킬 수 있는 비중을 가지는 고체상과 결합된 상태일 수 있다.

고체상은 비드, 마이크로파티클, 자성 마이크로파티클, 튜브 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 고체상은 아가로오즈(agarose), 셀룰로오즈(cellulose), 세파로즈(sepharose), 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetacrylate; PMMA), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene), 폴리아크릴아미드, 라텍스, 실리카, 유리 등으로 형성될 수 있고, 당화 혈색소 입자를 혼합하거나 침강시킬 수 있는 비중을 가진 것이라면, 이에 한정되지 않는다.

또한, 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 친수성 표면 특성을 가질 수 있다. 이는 버퍼 챔버(120)에서 제1 및 제2 수용 챔버(130, 140)로 이송된 용혈된 혈액 샘플과 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자와의 결합을 용이하게 하기 위함이다. 일례로서 당화 혈색소 친화성 입자와 결합되는 고체상을 알데히드(aldehyde), 지방성 아민(aliphatic amine), 방향성 아민(aromatic amine), 아미드(amide), 카르복시산(carboxylic acid), 술퍼하이드릴(sulfurhydryl), 클로로메틸(chloromethyl), 에폭시(epoxy), 히이드라지드(hydrazide), 하이드록시(hydroxy) 등의 친수성 작용기를 가지는 물질 중에서 선택할 수도 있고, 고체상의 표면을 친수성으로 표면 처리할 수도 있다.

또한, 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 제1 및 제2 수용 챔버에서 액상 또는 건조상으로 존재할 수 있다. 액상으로 존재할 때 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자의 농도는 0.01~10wt%일 수 있다.

당화 혈색소 친화성 입자의 크기는 통로의 지름의 1/10이하일 수 있다. 일반적으로 챔버들을 연결하는 통로의 지름은 50~500㎛이므로, 당화 혈색소 친화성 입자의 지름은 5~50㎛일 수 있다.

더 상세하게, 제1 당화 혈색소 친화성 입자는 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자일 수 있다.

항체는 단일클론항체 또는 다클론항체, 또는 항원 결합 위치(antigen binding site) 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)를 포함하는 항체 단편일 수 있다.

또한, 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하 는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자일 수 있다. 그 예로서, 4-카르복시페닐보론산(4-carboxyphenylboronic acid), 3-니트로-5-카르복시페닐보론산(3-nitro-5-carboxy phenylboronic acid), m-아미노페닐보론산(m-aminophenylboronic acid), 4-메트랍토페닐브론산(4-mercaptophenylboronic acid), 싸이오펜-3-보론산(thiophene-3-boronic acid), 페닐보론산 터미네이티드 알켄 티올(phenylboronic acid terminated alkane thiol)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

당화 혈색소(glycated hemoglobin)는 β 체인의 발린(valine) 말단 아민에 글루코오즈(glucose)가 공유결합된 형태인 HbA1c 형태로 두 개의 β 체인에 각각 Cis-diol를 가진다. 이 Cis-diol기에 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 결합하게 된다.

일정한 시간 동안 제1 및 제2 수용 챔버 내에 수용된 제1 내지 제2 당화 혈색소 친화성 입자와 버퍼 챔버(120)에서 이송된 용혈된 혈액 샘플을 결합시킨다.

당화 혈색소 친화성 입자와 용혈된 혈액 샘플의 결합이 완료되면, 미세유동 구조물을 회전시켜 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140)에서 각각 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한 당화 혈색소를 제1 및 제2 침강 챔버(160, 170)로 각각 침강시킨다. 이때, 제1 내지 제2 수용 챔버의 제1 출구에 마련된 밸브(240, 250) 개방 후 미세유동장치를 회전시킨다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140)로부터 제1 내지 제2 침강 챔버(160, 170)로 당화 혈색소가 침강되는 동안, 대조 챔 버(150)에서는 용혈된 혈액 샘플 내에 존재할 수 있는 백혈구 등 다른 혈액 구성 성분 중 혈색소보다 비중이 큰 성분을 제3 침강 챔버(180)로 침강시킬 수 있다. 이는 용혈된 혈액의 구성성분 중 일부를 제거하여, 총 혈색소의 흡광도를 더 정확하게 측정하기 위함이다.

이때 제1 내지 제3 침강 챔버(160~18)는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치할 수 있다.

제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140)에서 제1 및 제2 침강 챔버(160, 170)로 각각 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한 당화 혈색소의 침강을 완료하면 밸브(240, 250) 또는 필요에 따라 밸브(260)를 닫고 미세유동 구조물의 회전을 정지시킨다. 밸브(240~260)은 상술한 밸브(220)와 동일한 폐쇄된 밸브이다.

그러고 나서, 원심력에 의해 분리된, 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)의 상청액의 상층부를 제1 내지 제3 검출 챔버(190, 200, 210)로 이송하여 혈색소의 농도를 측정할 수 있다. 상세히, 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)의 제2 출구에 마련된 밸브(270, 280, 290)를 열고 미세유동 구조물을 회전시키거나, 또는 동시에 또는 미세유동 구조물을 회전시킨 후 밸브(270~290)를 개방할 수도 있다. 또한, 상기 제1 내지 제3 검출 챔버(190~210)는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치할 수 있다.

제1 내지 제3 검출 챔버(190, 200, 210)에서는 이동된 상청액의 흡광도를 측정한다.

도 3에 혈색소에 대한 몰흡광계수와 파장의 관계를 나타낸 그래프가 도시되 어 있다. 도 3에서 보는 바와 같이, 혈색소에 민감한 400~600㎚의 광을 이용하여 흡광도를 측정할 수 있다.

더 상세히, 제1 검출 챔버(190)에서는 항체를 기준으로 당화 혈색소의 침강으로 인한 혈색소의 농도 감소를 측정할 수 있고, 제2 검출 챔버(200)에서는 보로네이트 모이어티 친화성을 기준으로 당화 혈색소의 침강으로 인한 혈색소의 농도 감소를 측정할 수 있으며, 제3 검출 챔버(210)에서는 총 혈색소의 농도를 측정할 수 있다.

제1 검출 챔버(190)에서는 항체에 대한 친화성을 기준으로 한 혈색소의 농도 감소를 나타내는 흡광도(A1)를 얻을 수 있고, 제2 검출 챔버(200)에서는 보로네이트 모이어티에 대한 친화성을 기준으로 한 혈색소의 농도 감소를 나타내는 흡광도(A2)를 얻을 수 있다. 또한, 제3 검출 챔버(210)에서는 총 혈색소의 흡광도(At)를 얻을 수 있다.

후술할 것처럼, 제3 검출 챔버(210)의 흡광도(At)에 대한 제3 검출 챔버(210)의 흡광도(At)와 상기 제1 검출 챔버(190)에서 측정된 흡광도(A1)의 차의 비율 또는 제3 검출 챔버(210)의 흡광도(At)와 제2 검출 챔버(200)에서 측정된 흡광도(A2)의 차이의 비율을 표준 검량 곡선(도 4 및 도 5)에 대입하여 당화 혈색소의 퍼센트를 측정할 수 있다.

한편, 상기 미세유동 구조물을 구성하는 챔버들의 회전체 내 배치는, 원심력을 이용한 유체의 이송 경로를 감안할 때, 시료를 수용하는 챔버들이 회전체 중심 축으로부터 가장 가까운 곳에 위치하고, 검출 챔버가 회전체 중심축으로부터 가장 멀리 떨어진 곳에 위치하고, 이들 사이에 수용 챔버 순으로 위치할 수 있다.

이하에서, 상기 미세유동장치를 이용한 당화 혈색소를 측정하는 방법을 설명한다.

<시료의 주입>

본 실시예의 미세유동장치는 검사를 위한 버퍼들과 세척액이 미리 주입되어 있다. 즉, 버퍼 챔버(120)에는 혈액 샘플을 용혈시키기 위한 적혈구 용혈 버퍼(red blood cell lysis buffer)가 수용되어 있다. 도시하지 않은 세척액 챔버에는 세척액이 수용되어 있다. 또한, 제1 수용 챔버(130)에는 제1 당화 혈색소 친화성 입자인, 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자가 수용되어 있으며, 제2 수용 챔버(140)에는 제2 당화 혈색소 친화성 입자인, 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자가 각각 수용되어 있다. 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자가 액상으로 존재할 때, 당화 혈색소 친화성 입자는 0.01~10wt%의 농도로 수용되어 있다.

당화 혈색소를 측정하기 위하여 미세유동장치의 시료 챔버(110)에 피검자로부터 채취한 전혈(whole blood)을 5~20ul 주입한다.

<혈액 용혈>

미세유동장치를 회전시켜, 혈액 샘플을 시료 챔버(110)로부터 버퍼 챔버(120)로 이송시킨다. 혈액 샘플이 버퍼 챔버(120) 내에 수용되어 있는 적혈구 용혈 버퍼 용액에 의해 용혈된다. 이때 혈액 샘플과 적혈구 용혈 버퍼를 혼합하기 위해 미세유동장치를 회전시키거나 상하로 흔들 수도 있다.

<수용 챔버 및 대조챔버로의 이송>

미세유동장치를 회전시키면, 버퍼 챔버(120)에서 용혈된 혈액 샘플이 제1 내지 대조 챔버(130, 140, 150)로 이동된다.

이때 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150)로 용혈된 혈액 샘플이 계량된 부피로 분주되어야 한다. 그러기 위해서는 상술한 바와 같이 버퍼 챔버(110)와 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150) 사이의 통로의 지름, 통로의 길이 등의 제어 파라미터를 조정하여 동일한 양으로 분주하거나, 도 2에 도시한 것처럼 버퍼 챔버(110)와 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150) 사이의 각 통로 중간에 설치된 계량 챔버(300, 310, 320)를 통해 계량된 양으로 분주할 수 있다.

<결합 반응 수행>

버퍼 챔버(110)에서 제1 및 제2 수용 챔버(130, 140)로 이송된 용혈된 혈액 샘플은 각 수용 챔버(130, 140)에 수용되어 있는 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한다.

당화 혈색소 친화성 입자와 용혈된 혈액 샘플을 혼합하기 위해 미세유동장치가 회전할 수 있다. 제1 수용 챔버(130)에서는 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자와 당화 혈색소와 결합이 일어나며, 제2 수용 챔버(140)에서는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자와 당화 혈색소의 결합이 일어난다.

<침강 단계>

제1 및 제2 수용 챔버(130, 140) 내에서 각각 당화 혈색소 친화성 입자와 당화 혈색소가 결합이 완료되면, 밸브(240, 250)를 개방한다. 미세유동장치가 회전하면 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 내의 당화 혈색소 친화성 입자와 당화 혈색소의 결합체가 제1 및 제2 침강 챔버(160, 170)로 침강된다. 상술한 바와 같이 각 당화 혈색소 친화성 입자는 원심력 하에서 당화 혈색소 입자를 혼합하거나 침강시킬 수 있는 비중을 가지는 고체상과 결합된 상태이므로, 미세유동장치의 회전에 의해 상기 결합체가 제1 및 제2 침강 챔버(160, 170)로 신속하게 침강될 수 있다.

또한, 밸브(240, 250)의 개방과 동시에, 밸브(260)를 개방할 수 있다. 대조 챔버(150)에 제1 및 제2 수용 챔버(130, 140)와 동일한 원심력이 적용되어, 대조 챔버(150) 내의 용혈된 혈액 샘플에 존재할 수 있는 백혈구 등의 혈색소보다 비중이 큰 다른 물질을 제3 침강 챔버(180)로 침강시킬 수 있다. 이 경우, 후술하는 총 혈색소의 흡광도 측정시 정확도를 높일 수 있다.

<검출 단계>

침강 단계가 완료되면, 밸브(270~290)를 개방하고, 미세유동장치를 회전시킨다. 그러면 제1 내지 제2 수용 챔버(130, 140) 및 대조 챔버(150) 내의 침강하지 않고 남아 있는 상청액이 제1 내지 제3 검출 챔버(190, 200, 210)로 이동된다. 검출기를 이용하여 제1 내지 제3 검출 챔버(190~210) 내의 혈색소의 흡광도를 측정한다. 검출 유닛은 일반적으로 기술분야에서 흡광도를 측정하는 것으로 알려진 광학계를 이용할 수 있다. 일례로서, 단색광을 방출하는 포토다이오드와 LED로 구성된 광학계를 이용할 수 있다. 이때 혈색소에 특이적으로 흡광을 나타내는 파장인 400~600㎚의 광을 이용하여 흡광도를 측정할 수 있다. 도 3에 빛의 파장과 몰 흡광 계수를 나타낸 그래프가 도시되어 있다.

도 6은 당화 혈색소를 측정하는 방법의 일부를 설명하는 순서도이다.

제1 및 제2 검출 챔버(190, 200)에서는 침강 단계에서의 당화 혈색소 친화성 입자와 당화 혈색소의 결합체의 침강으로 인해 일어나는 혈색소 농도의 감소를 광학적으로 측정한다.

따라서, 제1 검출 챔버(190)에서는 항체에 대한 친화성을 기준으로 한 혈색소의 농도 감소를 나타내는 흡광도(A1)를 얻을 수 있고, 제2 검출 챔버(200)에서는 보로네이트 모이어티에 대한 친화성을 기준으로 한 혈색소의 농도 감소를 나타내는 흡광도(A2)를 얻을 수 있다. 또한, 제3 검출 챔버(210)에서는 총 혈색소의 흡광도(At)를 얻을 수 있다(S101).

제3 검출 챔버(210)의 흡광도(At)에 대한 감소된 상기 제1 검출 챔버(190)의 감소된 혈색소의 흡광도(At-A1)의 비율 및 제3 검출 챔버(210)의 흡광도(At)에 대한 감소된 상기 제2 검출 챔버(200)의 감소된 혈색소의 흡광도(At-A2)의 비율에서 표준 검량 곡선을 이용하여 당화 혈색소의 퍼센트를 측정할 수 있다.

도 4는 항체를 기준으로 한 표준 검량 곡선(calibration curve)으로, x축은 [총 혈색소의 흡광도(At)-항체를 기준으로 한 혈색소 농도 감소의 흡광도(A1)]/총 혈색소의 흡광도(At)의 비율이며, y축은 %HbA1c이다. 도 5는 보로네이트 친화성을 기준으로 한 표준 검량 곡선(calibration curve)으로, x축은 [총 형색소의 흡광도(At)-보로네이트 모이어티를 기준으로 한 혈색소 농도 감소의 흡광도(A2)]/총 혈색소의 흡광도(At)의 비율이며, y축은 %HbA1c이다.

도 4 및 도 5에 도시한 것과 같은 표준 검량 곡선(calibration curve)에 (At-A1)/At 비율 및 (At-A2)/At 비율을 대입하여 당화 혈색소의 퍼센트를 산출할 수 있다.

도 4의 표준 검량 곡선을 작성하고 작성된 표준 검량 곡선을 이용하여 %HbA1c를 구하는 예를 설명한다.

당화 혈색소의 퍼센트를 알고 있는 여러 개의 혈액샘플을 시료챔버(110)에 주입한 후 상술한 방법에 따라 항체를 기준으로 하는 제1 검출 챔버(190) 및 제3 검출챔버(210)의 흡광도를 측정한다. 본 실시예에서는 4개의 혈액샘플에서 제1 검출 챔버(190) 및 제3 검출챔버(210)의 흡광도를 측정한다.

하기 표 1에서 볼 수 있는 것처럼 (At-A1)/At의 값을 측정할 수 있다.

[표 1]

	%HbA1c	At	A1	At-A1/At	결과 %HbA1c	회수율
1	19.1	2.529	1.753	0.307	19.1	100%
2	10.4	2.414	1.840	0.238	10.4	100%
3	6.0	3.093	2.141	0.220	6.0	100%
4	3.3	3.117	2.464	0.210	3.3	100%
5	unknown	2.776	2.154	0.224	7.2

상기 표 1의 1 내지 4의 결과를 이용하여 도 4와 같은 표준 검량 곡선을 작성할 수 있다.

이와 같이 작성된 표준 검량 곡선을 이용하여 %HbA1c를 모르는 혈액샘플을 상기와 같이 시료챔버(110)에 주입한 후 상술한 방법에 따라 제1 검출 챔버(190)의 흡광도(A1) 및 제3 검출챔버(210)의 흡광도(At)를 측정하고, (At-A1)/At를 구한 후, 검량 곡선에 대입하여 %HbA1c를 구한다. 본 실시예에서는 (At-A1)/At 값이 0.224로서 도 4의 검량 곡선에 대입하면 7.0의 %HbA1c를 얻을 수 있다.

동일한 방법으로, 제2 검출 챔버(200) 및 제3 검출 챔버(210)의 흡광도를 측정하여, 보로네이트 모이어티를 기준으로 하는 제2 %HbA1c를 도 5의 표준 검량 곡선을 구한다.

항체를 기준으로 구한 제1 %HbA1c와 보로네이트 모이어티를 기준으로 구한 제2 %HbA1c를 비교한다.

혈액 샘플 내에 Cis-diol기를 수용하는 물질이 존재하는 경우, 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c에 비해 크며, 혈색소 변이체가 존재하는 경우에는 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 작다.

[표 2]

	제1 %HbA1c > 제2 %HbA1c	제1 %HbA1c = 제2 %HbA1c	제1 %HbA1c < 제2 %HbA1c
변이체 존재 여부	혈액 샘플 내에 Cis-diol기 수용하는 간섭물질 존재	정상	혈색소 변이체 존재

표 2에서 보는 바와 같이, 혈액 샘플 내에 Cis-diol기를 수용하는 물질이 존재하는 경우, 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c에 비해 크며, 혈색소 변이체가 존재하는 경우에는 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 작다.

제1 %HbA1c 및 제2 %HbA1c를 비교한 결과, 혈액 샘플 내에 Cis-diol기를 수용하는 간섭물질이 존재하는지 여부 및/또는 혈색소 변이체가 존재하는지 여부도 검출할 수 있다.

제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 큰 경우(S103의 예), 혈액샘플 내에 당화 혈색소 외의 당류 등 간섭물질이 있다고 판단한다(S104). 또한, 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c보다 작은 경우(S105의 예), 혈액샘플 내에 혈색소 변이체가 존재한다고 판단할 수 있다(S106). 이와 같은 판단결과를 검사자에게 제공하여 필요한 조치를 취하게 할 수 있다.

또한, 제1 %HbA1c가 제2 %HbA1c와 같거나 측정치의 차가 유의하지 않은 경 우(S105의 아니오), 혈액 샘플 내에 혈색소 변이체가 없다고 판단할 수 있다(S107). 상기 측정치 차이의 유의성 판단 기준은 인종, 지역 등 특정 집단의 고유한 특성을 반영하여 임상실험을 통해 통계적으로 결정할 수 있다.

따라서, 상기 방법에 의하면, 항체를 기준으로 한 %HbA1c, 보로네이트 친화성을 기준으로 한 %HbA1c뿐만 아니라, 혈액샘플에 혈색소의 변이체가 존재하는지 여부 및 당류 등의 간섭물질이 존재하는지 여부에 대한 정보도 함께 제공된다. 혈색소 변이체 또는 간섭물질이 존재하는 경우, 검사자는 이를 기초로 HLPC 등의 추가 정밀분석을 통해 정확한 당화 혈색소 퍼센트를 측정할 수 있다. 그러나, 혈색소 또는 간섭물질이 존재하지 않는다는 결과가 나온 경우, 상기 방법에 의해 측정한 %HbA1c를 당화 혈색소 퍼센트로 규정할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동 장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세유동 장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.

도 3은 혈색소에 대한 몰흡광계수와 파장의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 4는 항체를 기준으로 한 표준 검량 곡선(calibration curve)으로, x축은 항체를 기준으로 한 [총 혈색소의 흡광도(At)-혈색소 농도 감소의 흡광도(A1)]/총 혈색소의 흡광도(At)의 비율이며, y축은 %HbA1c이다.

도 5는 보로네이트 친화성을 기준으로 한 표준 검량 곡선(calibration curve)으로, x축은 보로네이트 모이어티를 기준으로 한 혈색소 농도 감소의 [총 형색소의 흡광도(At)-혈색소 농도 감소의 흡광도(A2)]/총 혈색소의 흡광도(At)의 비율이며, y축은 %HbA1c이다.

도 6은 당화 혈색소의 퍼센트를 측정하는 방법의 일부를 설명하는 순서도이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

O: 회전 중심

110: 시료 챔버

120: 버퍼 챔버

130, 140, 150: 제1, 제2, 대조 챔버

160, 170, 180: 제1, 제2, 제3 침강 챔버

190, 200, 210: 제1, 제2, 제3 검출 챔버

300, 310, 320: 계량 챔버

Claims

복수의 챔버, 상기 챔버들을 연결하는 통로, 및 상기 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하는 원심력 기반의 미세유동 구조물로서,

상기 복수의 챔버는,

제1 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 제1 수용 챔버;

상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자와는 다른 친화성을 가지는 제2 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 제2 수용 챔버;

총 혈색소의 농도를 측정할 수 있도록 상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자와 상기 제2 당화 혈색소 친화성 입자를 포함하지 않는 대조 챔버;를 포함하고,

상기 복수의 챔버는, 상기 제1 수용 챔버, 제2 수용 챔버와 대조 챔버 중 한 챔버를 통과하는 샘플이 상기 제1 수용 챔버, 제2 수용 챔버와 대조 챔버 중 다른 챔버들을 통과하지 않도록 연결되는 미세유동 구조물.
제1항에 있어서,

상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자는 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자이며, 상기 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자인, 원심력 기반의 미세유동 구조물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 제1 및 제2 당화 혈색소 친화성 입자는 원심력 하에서 상기 당화 혈색소 입자를 혼합하거나 침강시킬 수 있는 비중을 가지는 고체상과 결합된 상태인, 미세유동 구조물.
제3항에 있어서,

상기 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인, 미세유동 구조물.
제1항에 있어서,

상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한 혈색소를 수용하도록 상기 제1 수용 챔버에 연결되는 제1 침강 챔버;와

상기 제2 당화 혈색소 친화성 입자와 결합한 혈색소를 수용하도록 상기 제2 수용 챔버에 연결되는 제2 침강 챔버를 더 포함하는 미세유동 구조물.
제1항에 있어서,

상기 제1 수용 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 제1 수용 챔버의 상층액을 수용하는 제1 검출 챔버;

상기 제2 수용 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 제2 수용 챔버의 상층액을 수용하는 제2 검출 챔버;와

상기 대조 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 대조 챔버의 상층액을 수용하는 제3 검출 챔버;를 더 포함하는 미세유동 구조물.
제1항에 있어서,

상기 제1 수용 챔버, 상기 제2 수용 챔버 및 상기 대조 챔버는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치하는, 미세유동 구조물.
제6항에 있어서,

상기 제1 검출 챔버, 상기 제2 검출 챔버 및 상기 제3 검출 챔버는 회전 중심으로부터 반경방향으로 동일한 거리에 위치하는, 미세유동 구조물.
회전체, 하나 이상의 미세유동 구조물 및 검출 유닛을 포함하고,

상기 미세유동 구조물은 복수의 챔버, 상기 챔버들을 연결하는 통로, 및 상기 통로의 개폐를 위한 밸브를 포함하고,

상기 복수의 챔버는,

제1 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 제1 수용 챔버;

상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자와는 다른 친화성을 가지는 제2 당화 혈색소 친화성 입자를 수용하는 제2 수용 챔버;

총 혈색소의 농도를 측정할 수 있도록 상기 제1 당화 혈색소 친화성 입자와 상기 제2 당화 혈색소 친화성 입자를 포함하지 않는 대조 챔버;

상기 제1 수용 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 제1 수용 챔버의 상층액을 수용하는 제1 검출 챔버;

상기 제2 수용 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 제2 수용 챔버의 상층액을 수용하는 제2 검출 챔버;

상기 대조 챔버에 연결되어 원심력에 의해 상기 대조 챔버의 상층액을 수용하는 제3 검출 챔버;를 포함하고,

상기 복수의 챔버는, 상기 제1 수용 챔버, 제2 수용 챔버와 대조 챔버 중 한 챔버를 통과하는 샘플이 상기 제1 수용 챔버, 제2 수용 챔버와 대조 챔버 중 다른 챔버들을 통과하지 않도록 연결되는 원심력 기반의 미세유동 장치.
제9항에 있어서,

상기 검출 유닛은 단색광을 방출하는 광학계를 포함하며,

상기 광학계는 400~600㎚의 광을 이용하여 상기 제1 내지 제3 검출 챔버의 흡광도를 측정하는, 원심력 기반의 미세유동 장치.
원심력 기반의 미세유동 장치를 이용한 당화 혈색소 측정방법으로서,

당화 혈색소 친화성 입자로서, 표면에 당화 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체가 고정된 입자를 수용하는 제1 수용 챔버 및 당화 혈색소의 시스-디올기와 결합하는 보로닉산, 보로네이트 또는 보로네이트 유도체가 고정된 입자를 수용하는 제2 수용 챔버를 준비하는 것;

주입한 혈액 샘플을 용혈시키는 것;

상기 용혈된 혈액 샘플을 제1 및 제2 수용 챔버 및 대조 챔버로 계량된 부피로 분주하는 것;

상기 용혈된 혈액 샘플과 상기 제1 내지 제2 수용 챔버에 각각 수용된 상기 입자와 각각 결합시키는 것;

원심력에 의해 상기 입자와 결합한 당화 혈색소를 침강시키는 것;

상기 제1 내지 제2 수용 챔버 및 상기 대조 챔버의 상청액의 흡광도를 측정하는 것;

하기 제1 식을 이용하여 항체를 기준으로 한 제1 흡광도 비율을 산출하여 항체를 기준으로 한 표준 검량 곡선으로부터 제1 %HbA1c를 구하는 것;

하기 제2 식을 이용하여 보로네이트 친화성을 기준으로 한 제2 흡광도 비율을 산출하여 보로네이트 친화성을 기준으로 한 표준 검량 곡선으로부터 제2 %HbA1c를 구하는 것; 및

상기 제1 %HbA1c 및 제2 %HbA1c를 비교하는 것;을 포함하는 당화 혈색소를 측정하는 방법:

제1 식: 제1 흡광도 비율={(대조 챔버 상청액의 흡광도-제1 수용챔버 상청액의 흡광도)/대조 챔버 상청액의 흡광도}

제2 식: 제2 흡광도 비율={(대조 챔버 상청액의 흡광도-제2 수용챔버 상청액의 흡광도)/대조 챔버 상청액의 흡광도}
제11항에 있어서,

상기 제1 %HbA1c가 상기 제2 %HbA1c보다 작은 경우 혈액샘플 내에 혈색소 변이체가 존재한다는 정보를 제공하는 것을 더 포함하는, 당화 혈색소를 측정하는 방 법.
제11항에 있어서,

상기 제1 %HbA1c가 상기 제2 %HbA1c보다 큰 경우 혈액샘플 내에 시스-디올기를 포함하는 간섭물질이 존재한다는 정보를 제공하는 것을 더 포함하는, 당화 혈색소를 측정하는 방법.
제11항에 있어서,

상기 당화 혈색소를 침강시키는 것은 상기 제1 및 제2 수용 챔버에 각각 연결된 침강 챔버에서 이루어지는, 당화 혈색소를 측정하는 방법.
제11항에 있어서,

상기 흡광도를 측정하는 것은 상기 제1 내지 제2 수용 챔버 및 상기 대조 챔버에 연결된 각 검출 챔버로 이송한 후에 이루어지는 것인, 당화 혈색소를 측정하는 방법.
제11항 또는 제15항에 있어서,

상기 흡광도를 측정하는 것은 400~600㎚의 광을 이용하는, 당화 혈색소를 측정하는 방법.