JP4653574B2 - ヘモグロビンA1cの測定方法 - Google Patents
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Description
生物学的測定方法の最大の利点は、生体の高度な物質間相互作用を利用して、これまで物理化学的な方法ではなし得なかった選択性を有する目的物質の検出、定量等ができることにあり、医療、食品、飲料水、下水、環境試料等の様々な試料中の低分子化合物から生体高分子まで広範囲な物質を検出できる可能性を有している。
しかしながら、これらの方法は何れも凝集反応を利用しているため、非特異的な凝集反応が生じる可能性があり、異常値が出現したり、抗原抗体反応による濁度増加が検出されにくくなったりすることがあり、特異性や測定精度の点で問題があった。
以下に本発明を詳述する。
上記変性処理は、HbA1cを変性させてHbAと化学構造が異なる部位、即ち、糖結合部位を露出させ、抗HbA1c抗体との抗原抗体反応をしやすくすることや、不安定型HbA1cを除去することを目的として行われるものである。上記変性処理の方法としては特に限定されず種々の方法を用いることができ、例えば、KSCN塩を用いる方法や、弱酸性条件下で、脂肪族カルボン酸緩衝液又はホウ酸緩衝液等を用いる方法等が挙げられる。
上記磁性体含有粒子(B)を構成する磁性体含有粒子としては特に限定されず、例えば、スチレン系共重合体等の有機高分子物質をマトリックスとして、四三酸化鉄(Fe3O4)、γ−重三二酸化鉄(γ−Fe2O3)等の各種フェライト類;鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等の超常磁性を有する磁性体が分散したもの等が挙げられる。
上記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径のCV値は、50%以下であることが好ましい。50%を超えると、定量的な測定を行う場合に誤差を生じることがある。
従って、測定試料中の測定試料中のHbAに対するHbA1cの比率が大きいほど、結合する磁性体含有粒子(B)、即ち、磁性量が大きくなる。
そして、後に説明する捕集工程を行った後、得られた担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体5の磁性量を測定する。更に、図1(II)に示すように、測定試料中のHbAに対するHbA1cの比率が異なる場合についても、同様の操作を行い、複合体の磁性量を測定した後、これらの結果を基に検量線を作成することにより、磁性量の測定結果から、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定することが可能となる。
この工程について詳しく説明する。
なお、1はヘモグロビンA、2はヘモグロビンA1cを表す。
図2において、フィルタ又は流路チャネル分離部6の上流においては、測定試料中には、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体5、未反応の担体粒子(A)3、未反応の磁性体含有粒子(B)4が混ざりあった状態にある。平均粒子径から、フィルタ又は流路チャネル分離部5を通過できるのは、未反応の磁性体含有粒子(B)4のみであり、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体5と未反応の担体粒子(A)3とは、フィルタ又は流路チャネル分離部6に捕集される。
なお、この方法では担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体5と未反応の担体粒子(A)3とは分離されないが、本発明のヘモグロビンA1cの測定方法では、磁性量を測定することにより被検物質の定量を行うことから、磁性を全く帯びない担体粒子(A)3が存在しても測定結果には何らの影響も及ぼさない。
上記フィルタとしては、水性媒体からなる測定試料が透過可能であるものであれば特に限定されず、例えば、多孔質膜等を用いることができる。
上記多孔質膜としては特に限定されず、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、ろ紙、スチロール樹脂、ビニル系樹脂等からなるものが挙げられる。また、上記多孔質膜の水性媒体に対する親和性が低い場合には、界面活性剤を用いる等の従来公知の親水化処理を施してもよい。
上記フィルタが多孔質膜からなる場合において、連続した同一の多孔質膜を用いてもよいし、異なる材料を併用してもよい。
上記流路チャネルは、公知のエッチングや微細機械加工等により形成することができる。
第1の実施態様は、ヘモグロビンAを含む測定試料に対して、抗ヘモグロビンA抗体が結合又は吸着した担体粒子(A)、及び、抗ヘモグロビンA1c抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子(B)を加えて、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を形成させる反応工程と、担体粒子(A)の粒子径と磁性体含有粒子(B)の粒子径との差を利用して、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の磁性体含有粒子(B)とを分離し、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を捕集する分離捕集工程と、捕集された担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体の磁性量を測定する測定工程とを有する。
このように、被検物質と担体粒子(A)、磁性体含有粒子(B)との反応の順番は、測定方法にあわせて適宜選択し得る。
上記濃縮の方法としては特に限定されず、例えば、上記磁性体含有粒子(B)や、これを含む複合体は、磁性を帯びることから、反応させた溶液を収容する容器の外部より磁場印加手段を適用すれば、容器の内壁に吸着することができる。測定試料の溶媒(上清)の大部分を除去し、磁場を取り除いた後、微少量の分散媒(例えば、バッファー)等により容器の内壁を洗浄すれば、これらの粒子を回収して高度に濃縮することができる。
上記未感作の担体粒子(A)を構成する担体粒子としては、HbA、HbA1c、タンパク質等と非特異的に結合又は吸着するものであることが好ましく、例えば、ガラスビーズ、有機高分子ビーズ、有機高分子ラテックス等を用いることができる。有機高分子としてはスチレン重合体、アクリル酸エステル重合体、スチレン-アクリル酸エステル共重合体、スチレン-ジビニルベンゼン共重合体等が挙げられる。
そして、捕集工程を行った後、得られた担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体の磁性量を測定する。更に、図3(II)に示すように、測定試料中のHbAに対するHbA1cの比率が異なる場合についても、同様の操作を行い、複合体の磁性量を測定した後、これらの結果を基に検量線を作成することにより、磁性量の測定結果から、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定することが可能となる。
なお、別の態様の本発明は、未感作の担体粒子(A)を用いる点以外は、本発明のヘモグロビンA1cの測定方法と同様であるため、その詳しい説明を省略する。
このようなヘモグロビンA1c測定用キットを用いることで、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を高い精度で測定することが可能となる。
担体粒子(ポリスチレン系、平均粒子径50μm、積水化学社製)10mgに20mMリン酸緩衝液(pH7.5)10mLを加え、3000RPMにて20分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)に抗HbAモノクローナル抗体を0.1mg/mLの濃度になるように溶解した溶液を1mL加え、充分に混和して、室温にて1時間撹拌した。
磁性体含有粒子(ポリスチレン系、磁性体量60%、平均粒子径0.3μm、積水化学社製)10mgに20mMリン酸緩衝液(pH7.5)10mLを加え、15000RPMにて20分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)に抗HbA1cモノクローナル抗体を0.2mg/mLの濃度になるように溶解した溶液を2mL加え、充分に混和して、室温にて1時間撹拌した。
フィルタとしてグラスファイバーフィルタ(AP25、孔径1.5μm、直径90mm、日本ミリポア社製)を吸水用ろ紙(日本ミリポア株式会社製)の上に重ねてフィルタ試験片とした。
石英ガラス基板内に、深さ100μm、幅200μmの流路チャネル、その流路の先に、深さ5μmの微細な流路チャネル分離部を設けたマイクロチップデバイスを用いた。
結果を表1に示した。
フィルタとしてグラスファイバーフィルタ(AP25、孔径1.5μm、直径90mm、日本ミリポア社製)を吸水用ろ紙(日本ミリポア株式会社製)の上に重ねてフィルタ試験片とした。
石英ガラス基板内に、深さ100μm、幅200μmの流路チャネル、その流路の先に、深さ5μmの微細な流路チャネル分離部を設けたマイクロチップデバイスを用いた。
結果を表2に示した。
検体として、グリコHbコントロールレベルI(HbA1c=5.4±0.3%)、レベルII(HbA1c=10.6±0.5%)(国際試薬社製)それぞれ125μLを精製水5mLに加え測定試料を作製した。
65mMリン酸緩衝液(pH7.4)に0.1%濃度となるように担体粒子(ポリスチレン系、平均粒子径50μm、積水化学工業社製)を分散した懸濁液200μLに、得られた測定試料5μLを添加し、37℃で30分間撹拌して、担体粒子表面に測定試料を吸着させた。
グラスファイバーフィルタ(AP25、孔径1.5μm、直径90mm、日本ミリポア社製)を吸水用ろ紙(日本ミリポア株式会社製)の上に重ねたフィルタ試験片の滴下部位にキャピラリーを用いて得られた反応液を200μL滴下した。続いて、滴下部位に、牛血清アルブミンを1%(w/v)、トリトン−Xを0.01%(w/v)の濃度の20mMリン酸緩衝液(pH7.5)を100μL滴下した後、フィルタ試験片のグラスファイバーを取り出し、滴下部位の磁性量を、市販のGMRセンサ(差動磁界センサ、NVE社製)を用いて測定した。結果を表3に示した。
2 ヘモグロビンA1c
3 抗ヘモグロビンA抗体が結合又は吸着した担体粒子(A)
4 抗ヘモグロビンA1c抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子(B)
5 担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体
6 フィルタ又は流路チャネル分離部
Claims (6)
- ヘモグロビンA及びヘモグロビンA1cを含む測定試料に対して、ヘモグロビンA及びヘモグロビンA1cと特異的に結合する抗ヘモグロビンA抗体が結合又は吸着した担体粒子(A)、及び、ヘモグロビンA1cと特異的に結合する抗ヘモグロビンA1c抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子(B)を加えて、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を形成させ、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体の磁性量を測定することによりヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定するヘモグロビンA1cの測定方法であって、
前記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径は、前記担体粒子(A)の平均粒子径よりも小さいものであり、
前記担体粒子(A)の粒子径と前記磁性体含有粒子(B)の粒子径との差を利用して、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の前記磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を捕集する工程を有する
ことを特徴とするヘモグロビンA1cの測定方法。 - ヘモグロビンAを含む測定試料に対して、未感作の担体粒子(A)、及び、ヘモグロビンA1cと特異的に結合する抗ヘモグロビンA1c抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子(B)を加えて、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を形成させ、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体の磁性量を測定することによりヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定するヘモグロビンA1cの測定方法であって、
前記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径は、前記担体粒子(A)の平均粒子径よりも小さいものであり、
前記担体粒子(A)の粒子径と前記磁性体含有粒子(B)の粒子径との差を利用して、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の前記磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を捕集する工程を有する
ことを特徴とするヘモグロビンA1cの測定方法。 - 磁性体含有粒子(B)の平均粒子径は、担体粒子(A)の平均粒子径の10%以下であることを特徴とする請求項1又は2記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 磁性体含有粒子(B)は、平均粒子径が0.03〜0.5μmであることを特徴とする請求項3記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 担体粒子(A)の粒子径と磁性体含有粒子(B)の粒子径との差を利用して、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を捕集する工程は、前記担体粒子(A)の平均粒子径よりも小さく、かつ、前記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径よりも大きい孔径のフィルタを用いて、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の前記磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を前記フィルタ上に捕集するものであることを特徴とする請求項3又は4記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 担体粒子(A)の粒子径と磁性体含有粒子(B)の粒子径との差を利用して、担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を捕集する工程は、前記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径よりも小さく、かつ、前記磁性体含有粒子(B)の平均粒子径よりも大きい断面積を有する流路チャネル分離部を用いて、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体と未反応の前記磁性体含有粒子(B)とを分離し、前記担体粒子(A)−ヘモグロビンA1c−磁性体含有粒子(B)複合体を前記流路チャネル分離部に捕集するものであることを特徴とする請求項3又は4記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
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