JP4881077B2 - 免疫クロマト法 - Google Patents
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このような免疫クロマト法の問題は、その他の生物学的反応を利用した種々の測定法にも共通するものであった。
以下に本発明を詳述する。
上記抗体としては、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、Fab抗体、(Fab)2抗体等の形態であってもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル;酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類;アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類;(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸2−エチルヘキシル、(メタ)アクリル酸ステアリル、エチレングリコール(メタ)アクリレート、トリフルオロエチル(メタ)アクリレート、ペンタフルオロプロピル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、2種以上が併用されてもよい。
上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよいし、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄(Fe3O4)、γ−重三二酸化鉄(γ−Fe2O3)等の各種フェライト類;鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄(Fe3O4)が好適である。
このような磁性体としては、Fe2+とFe3+とを1:2の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでFe3O4が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドHC−50(タイホー工業社製)、HX―20(シグマハイケミカル社製)等の市販品も用いることができる。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体含有粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、即ち磁性体含有粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち磁性体含有粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が0.3を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は0.27、更に好ましい上限は0.25、特に好ましい上限は0.20である。
これにより、磁性体含有粒子の凝集や非特異反応を引き起こす液状測定試料中に存在するタンパク質や脂質等の夾雑物質を除去することが可能となる。
具体的には、例えば、0.1%ウシ血清アルブミンと、0.01%トリトンX−100と、0.9%塩化ナトリウムとを含む0.1Mリン酸緩衝液等が挙げられる。
(1)抗α−hCGモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の作製
磁性体含有粒子(ポリスチレン系、磁性体含有量60%、平均粒子径0.3μm、積水化学社製)5.0mgに、0.02Mリン酸バッファー1.0mLを添加し、超音波で再分散後、15000RPMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を3回繰り返した。
続いて、得られた磁性体含有粒子に、0.02Mリン酸バッファー1.0mLを添加し、抗α−hCGモノクローナル抗体100μg加え、37℃恒温槽中で2時間攪拌した。その後、15000RPMにて20分間遠心分離を行い、未反応の抗α−hCGモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−hCGモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの72%であることを確認した。
得られた磁性体含有粒子を100mMリン酸緩衝液(pH6.5)1mLに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その後、磁性体含有粒子を、牛血清アルブミンが1%(w/v)濃度になるように調整した100mMリン酸緩衝液(pH6.5)1mLに懸濁させ、37℃恒温槽で1時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。次いで、15000RPMにて20分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々1%(w/v)、アジ化ナトリウムを0.01%(w/v)濃度になるように調整した100mMリン酸緩衝液(pH7.5)1mLに分散させ、免疫測定用粒子(抗α−hCGモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子)を得た。
ニトロセルロースメンブレン(SRHF P70、日本ミリポア社製)を幅20cm×長さ6cmに裁断し、その長さ方向上端より2cmの部位(反応部位)に、抗β−hCGモノクローナル抗体を2.0mg/mLの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液(10mmol/L、pH7.4)に溶解した溶液を幅0.7mmの直線状に塗布した。その後、37℃で2時間乾燥した後、牛血清アルブミン(和光純薬社製)を1重量%の濃度になるようにリン酸緩衝液(100mmol/L、pH7.5)に溶解した溶液に1時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを0.1重量%の濃度になるようにリン酸緩衝液(100mmol/L、pH7.5)に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−hCGモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。
得られた試験片を幅5mmに裁断し、長さ方向上端に幅5mm×長さ20mmの吸水パッド(AP22、日本ミリポア社製)を、下端に幅5mm×長さ15mmのコンジュゲートパッド(グラスファイバー、日本ミリポア社製)を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。
hCG濃度が0mIU/mL、5mIU/mL、50mIU/mL、100mIU/mLになるよう血漿中に混合することにより各測定試料用溶液を調製した。
各測定試料用溶液200μLに免疫測定用粒子10μgを添加し、10分間混合した。次いで、容器の底にフェライト磁石を近づけて、免疫測定用粒子を集めた状態で、反応液を除去した。続いて、牛血清アルブミンが1%(w/v)濃度、トリトン−Xを0.01%(w/v)の濃度になるように調整した50mMリン酸緩衝液(pH7.2)200μLを添加し、再分散させ、作製した試験片のコンジュゲートパッドに100μLをそれぞれ滴下した。
滴下から20分経過後、市販のGMRセンサ(差動磁界センサ、NVE社製)を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表1に示した。
実施例1と同様にして抗α−hCGモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子、固定相及び試験液を作製し、各試験液200μLに免疫測定用粒子10μgを添加し、10分間混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに100μLをそれぞれ滴下した。
滴下から20分経過後、市販のGMRセンサ(差動磁界センサ、NVE社製)を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表1に示した。
一方、磁石による分離を行わなかった比較例1では、試験片への免疫測定用粒子の残留があり、また、試験液0mIU/mLにおいて抗体固定化部への非特異吸着(磁性量の検出)が認められ、実施例1に比べ、検出感度、精度が低い結果となった。
2 被検物質と特異的に結合する第1の物質
3 磁性体含有粒子
4 被検物質−磁性体含有粒子複合体
5 磁気
6 測定妨害物質を含まない溶液
7 被検物質と特異的に結合する第2の物質
8 固定相
Claims (1)
- 被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第1の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させて被検物質−磁性体含有粒子複合体を作製する工程1と、
磁気により前記被検物質−磁性体含有粒子複合体と、液状測定試料とを分離する工程2と、
前記被検物質−磁性体含有粒子複合体を測定妨害物質を含まない溶液に分散させて分散液を調製する工程3と、
被検物質と特異的に結合する第2の物質が固定化された固定相と、前記分散液とを反応させる工程4と、
前記分散液を反応させた固定相の磁性量を測定することにより、前記液状測定試料中における前記被検物質の量を算出する工程5とを有し、
前記磁性体含有粒子は、有機高分子物質と、該有機高分子物質中に50〜80重量%の含有量で分散した磁性体とからなるものである
ことを特徴とする免疫クロマト法。
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