JP3717735B2 - 免疫固相検定用の固相担体 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫固相検定用の固相担体に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
EIA、RIA、MPHA法等の免疫検定は、抗原抗体反応を利用して検体中の物質を特異的に検出、定量する方法である。特に、抗体又は抗原を吸着させた固相を用いる免疫固相検定は、ELISAを中心に、臨床検査の分野等で汎用されている。
【０００３】
免疫固相検定用の固相には、ポリスチレン(PS)、ポリ塩化ビニル(PVC)が多用されており、吸着能を向上させるために、固相プレート表面には、コーティング処理を施すのが通常である。
【０００４】
従来、固相には直接抗体を固定化するのが通常であったが、近年、レクチンや接着タンパク質等のように特異的又は非特異的にある種の物質を結合し得る物質（以下バインダー物質）を介して抗体又は抗原を固相に吸着させる方法が用いられるようになってきており、これによって、多様な物質を固相に吸着させることが可能となった。とりわけ、レクチンは、各種類毎に特異的な糖鎖を結合するという特性を有しているので、赤血球抗原等を固相に吸着させるためのバインダー物質として極めて有用であり（特開平2-124464参照）、多くの免疫固相検定で使用されるに至っている。
【０００５】
このように、最近では、固相プレート上にバインダー物質を吸着して用いることが多くなっているが、従来の固相プレートは、抗体を効率的に吸着し得るように作成されているので、抗体以外の物質に優れた吸着能を有するものは少ない。
【０００６】
このため、バインダー物質、特にレクチンに対する吸着能が優れた固相プレート材料の開発及び探索、並びに固相プレート材料への吸着方法の開発が盛んに行われているが、必ずしも良好な結果は得られていない。また、固相プレートは、再使用が困難であるにもかかわらず、従来の固相プレートは吸着能を高めるために特別な表面処理を施しているため、固相プレート自体が高価なものとなり、コスト高な利用を余儀なくされる。
【０００７】
例えば、磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法を開示する特開平2-124464の実施例には、レクチンを介して赤血球が固定化されたプレートの作成、及び該プレートを用いた血液型の判定法が記載されている。
【０００８】
該実施例では、ポリスチレン製のＵ字型マイクロプレート（Nunc.社）にレクチンを吸着させているが、材質及び形状ともにレクチンの吸着には適していない。
【０００９】
また、レクチンを固相プレートに固定化する方法として、特開平8-319300は、糖鎖高分子を用いて固定化する方法を開示している。該方法では、まず糖鎖高分子を固相プレートに物理吸着させ、該糖鎖高分子を介して固相基材にレクチンを結合させる。固相担体に物質を吸着させる方法には、物理吸着による方法と化学的に共有結合させる方法があるが、該方法では、操作が煩雑な共有結合法を用いずに、物理吸着のみを用いている。また、糖鎖はレクチンを強固に吸着し得るので、結合力が弱いという物理吸着の一般的な欠点も克服されている。
【００１０】
しかし、該方法では、糖鎖高分子を固相基材に物理吸着させる操作が一段階必要であり、直接レクチンを強固に吸着し得る固相用基材を提供するものではない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存するこのような欠点を克服するためになされたものであり、バインダー物質を直接物理的に吸着させるための免疫固相検定用の固相担体を提供することを目的とする。
【００１２】
とりわけ、本発明は、レクチンを直接吸着させるための固相担体を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、ポリブタジエン、ポリスチレンブタジエン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、HIPS、ポリアリレート、及びクマロン樹脂からなる群から選択されるプラスチック材料を用いて作成された免疫固相検定用の固相担体であって、抗体又は抗原を固相担体に固定化するバインダー物質を直接吸着させるための固相担体を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、バインダー物質を直接物理的に吸着させるための免疫固相検定用の固相担体を提供する。
【００１５】
本明細書において、「免疫固相検定」とは、試料中の所望の検出すべき被検物質に対して特異的な親和性を有する特異親和性物質を固相に吸着させて、この固相との特異親和性に基いて被検物質を検出する固相検定において、免疫学的に抗体又は抗原となり得る物質との抗原抗体反応による結合を介して固相への吸着を強化させるようにしたものをいう。ここで、特異親和性物質は、抗体又は抗原であり得、固相に吸着させる際の抗原抗体反応によって直接的に吸着させることができ、例えば粒子凝集法、混合凝集法、及び固相酵素免疫検定法（ELISA）等があげられる。また、特異親和性物質は、遺伝学的活性、生化学的活性などの非免疫学的活性を有するものでもよく、この場合には抗原としての結合性を利用して抗原抗体反応により固相に吸着させるか、あるいは特異親和性物質に対応する抗体を固相に吸着させて、この吸着させた抗体を介して抗原抗体反応により二次的に固相に吸着させることができ、これによって、例えば酵素活性度や核酸ハイブリダイゼーションによる生化学的ないし遺伝学的検定を実施することができる。
【００１６】
本発明の固相担体は、ポリブタジエン、ポリスチレンブタジエン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、HIPS、ポリアリレート、及びクマロン樹脂からなる群から選択されるプラスチック材料を用いて、周知の方法により作成される。
【００１７】
本発明の固相担体の形状は、実施すべき免疫検定の種類に応じて、シャーレ、マイクロプレート、キュベット、フィルム、ビーズ、多孔性フィルター、細径チューブ、棒、針等であり得る。
【００１８】
本発明の固相担体に吸着させるべき物質は、バインダー物質である。
【００１９】
ここで、「バインダー物質」とは、抗体又は抗原と固相担体の間に介在して、抗体又は抗原を固相担体に固定化するための、抗体又は抗原に対して親和性を有する物質を意味し、例えば、タンニン、レクチン、バルサム等の植物系粘着物質があげられる。
【００２０】
本発明において好ましいバインダー物質は、小麦、大豆等から得られる植物凝集素としてのレクチンであり、コムギ胚芽凝集素(WGA)が特に好ましい。
【００２１】
バインダー物質には、抗体又は抗原を結合させるが、レクチンをバインダー物質として用いるときには、赤血球を結合せしめるのが好ましい。
【００２２】
本発明の固相担体には、バインダー物質は物理的に吸着させる。バインダー物質を固相担体に吸着させるには、担体材料上にバインダー物質を含有する溶液を適用した後、適当な時間インキュベートすればよい。
【００２３】
以下、実施例に従って本発明を詳述する。
【００２４】
［実施例１］
本実施例では、様々なプラスチック材料のWGA吸着能を調べた。
【００２５】
本実施例で用いたプラスチック材料は、下表のとおりである。
【００２６】
【表１】

【００２７】
本実施例では、赤血球がWGAを結合する能力を利用して、赤血球の結合状態を調べることによって各プラスチック材料のWGA吸着能を評価している。
【００２８】
上記各プラスチック材料上へのWGAの吸着は、以下のように行った。
【００２９】
各プラスチック材料の中で、テトラヒドロフラン(THF)に溶解するものは、約5%の濃度に溶解し、スライドガラスに100μL滴下して、カバーグラスを用いて素早くガラス面に伸ばし、スライドガラス上にプラスチック薄膜を形成した。
【００３０】
THFに溶けない板状の材料、及びマイクロプレートは、そのまま使用した。
【００３１】
形成したプラスチック薄膜、及び該板状の材料に、ドーナツ状に穴の空いたビニールパッチ（コクヨ ビニールパッチクリア）を貼り、50μLの10μG/mL WGA(0.01M炭酸緩衝液pH9.6中に溶かしたもの)をその中に分注した。続いて、室温で1時間インキュベートして、0.05% Tween 80／純水で洗浄した。
【００３２】
マイクロプレートのものは、50μLの10μG/mL WGA(0.01M炭酸緩衝液pH9.6中に溶かしたもの) をウェルに分注して、同様に処理した。
【００３３】
このようにしてWGAを吸着せしめた各プラスチック材料に、生理食塩水で1.0%に希釈した洗浄Ｏ型赤血球を25μL/ウェルになるように分注し、室温で10分間静置した。その後、生理食塩水で洗浄して、赤血球の結合を観察した。
【００３４】
結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】

【００３６】
表２から明らかなように、赤血球が良好に固相したプラスチック材料は、ポリブタジエン（アルドリッチ）、ポリスチレン−ブタジエン（アルドリッチ）、ポリカーボネート（アルドリッチ）、ニトロセルロース（アルドリッチ）、ポリカーボネート（帝人化成 パンライト）、HIPS（旭化成 アサフレックスAFX805）、ポリアリレート（ユニチカ ポリマーU-100）、クマロン樹脂であった。
【００３７】
この中でも特に赤血球の結合が良好なものは、ポリカーボネート、ポリアリレート、クマロン樹脂であった。
【００３８】
以上の結果から、これらのプラスチック材料は優れたWGA吸着能を有すること、WGAを介して赤血球を強固に結合し得ることが示された。これらのプラスチック材料は、赤血球を用いた血液型判定試験に適しているであろう。
【００３９】
［実施例２］
本実施例では、実施例１においてWGAの結合が良好であったポリカーボネート（帝人化成 パンライト）及びポリアリレート（ユニチカ ポリマーU-100）を用いてＵ底マイクロプレートを成形し、WGAの固相状態の比較を行った。
【００４０】
対照には、従来WGAを吸着させるために用いられてきたNunc社Maxisorp（Cat. No. 475078）、Nunc社Polysorp（Cat. No. 475086）、Nunc社Microwellプレーン（Cat. No. 262170）を使用した。
【００４１】
まず、5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.31, 0.15μg/ウェルになるように、0.01Mの炭酸緩衝液pH9.6で、WGA（生化学工業 Cat. No. 300191, Lot. No. 62404）を希釈し、室温で1時間インキュベートした。
【００４２】
その後、0.05% Tween 80／純水で洗浄した。
【００４３】
洗浄後、ウェルに市販のＯ型スクリーニング赤血球（Orthoセレクトジェン）を生理食塩水で約1%に希釈して分注し、静置して赤血球を固相した。余剰赤血球は、生理食塩水で洗浄除去した。
【００４４】
赤血球結合後、赤血球結合を肉眼観察し、その後100μL/ウェルの精製水を分注して溶血せしめ、OD410nmで溶血を測定する。得られた溶血値を赤血球の結合量とした。
【００４５】
結果を図１及び表３に示す。
【００４６】
【表３】

【００４７】
図１に示されているように、ポリカーボネート（PC）及びポリアクリレート(PAr)は、特別な表面処理を施していないにもかかわらず、従来レクチンを吸着させるための固相担体として使用されてきたNunc社のMaxisorpと同等の赤血球結合能を有していた。
【００４８】
Nunc.社のMicrowellは、これらのプラスチック材質に比べて、明確に赤血球結合能が劣っており、Polysorpは殆ど赤血球を結合しなかった。
【００４９】
表３は、各濃度における、それぞれのプラスチック材質の赤血球結合状態を肉眼判定及び顕微鏡判定した結果である。
【００５０】
表３の結果も、図１に示されている結果と同様であり、ポリカーボネートとポリアクリレートは、1.25μg/mL以上の濃度で極めて良好に赤血球を固相していた。
【００５１】
なお、上述した例に限定されず、例えば、抗体を介して核酸や酵素等の遺伝的又は生化学的物質を固相化して検定を行う場合も本発明に含まれる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によって、ポリブタジエン、ポリスチレンブタジエン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、HIPS、ポリアリレート、及びクマロン樹脂は、レクチンを良好に吸着させ得ることができ、レクチンを固定化するための担体として適していることが明らかとなった。これらの樹脂は、レクチンの固定化に適した唯一の固相担体として従来から用いられてきたNunc社のMicrowellと同等のレクチン吸着能を有しており、特別な表面処理を施す必要がなく、安価に固相免疫検定を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種プラスチック材料のレクチン吸着能力を比較した結果を示す図。

Claims (5)

1. ポリカーボネート、ポリアリレート、及びクマロン樹脂からなる群から選択されるプラスチック材料を用いて作成された免疫固相検定用の固相担体であって、抗体または抗原となり得る物質による結合を介して、被検物質に対する特異親和性物質を前記固相担体に固定化するためのバインダー物質を、表面処理を実質的に行うことなく直接吸着させたことを特徴とする固相担体。
2. 前記バインダー物質がレクチンであることを特徴とする請求項１に記載の固相担体。
3. 前記特異親和性物質が、免疫学的活性、遺伝学的活性、生化学的活性のいずれかの活性を有するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の固相担体。
4. 前記固相担体がガラス上に前記プラスチック材料を薄膜化したものであることを特徴とする請求項１に記載の固相担体。
5. 請求項１〜４の何れか1項に記載の固相担体であって、形状がシャーレ、マイクロプレート、キュベット、フィルム、ビーズ、多孔性フィルター、細径チューブ、棒、又は針の何れかである固相担体。

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