JP4897581B2 - 親水化磁性体内包粒子の製造方法、親水化磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子 - Google Patents
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また、免疫測定用粒子として使用する際に、測定試料中の抗原又は抗体が非特異吸着を生じる恐れがあり、これを防止するためには、ブロッキング剤によるブロッキング処理を施さなければならないという問題があった。
更に、免疫測定用粒子として使用する際に、磁性体内包粒子と抗原又は抗体とを物理的に吸着させる方法では、経時的な安定性に欠け、吸着させた抗原又は抗体が脱離したりするという問題があった。
以下に本発明を詳述する。
これは、オゾン水処理により、有機高分子物質表面の疎水性構造部分が酸化されたり、ベンゼン環や未反応の二重結合がオゾンと反応したりすることにより、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基が生成するためと考えられる。
上記有機高分子物質は、上記磁性体内包粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体、すなわち、ポリスチレン系樹脂であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、上記磁性体内包粒子の水系媒体中における分散性が向上することに加え、後述するようにオゾン水を用いて親水化処理をした場合に、上記磁性体内包粒子の表面にカルボキシル基を生成することができる。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル;酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類;アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類;(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸2−エチルヘキシル、(メタ)アクリル酸ステアリル、エチレングリコール(メタ)アクリレート、トリフルオロエチル(メタ)アクリレート、ペンタフルオロプロピル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサンジオールジ(メタ)アクリレート、ネオペンチルグリコールジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ(メタ)アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄(Fe3O4)、γ−重三二酸化鉄(γ−Fe2O3)等の各種フェライト類;鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄(Fe3O4)が好適である。
このような磁性体としては、Fe2+とFe3+を1:2の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでFe3O4が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドHC−50(タイホー工業社製)、HX―20(シグマハイケミカル社製)等の市販品も用いることができる。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、即ち磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、即ち磁性体内包粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が0.3を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は0.27、更に好ましい上限は0.25、特に好ましい上限は0.20である。
このような平均粒子径等を有することによって、自己凝集を抑制することができ、上記磁性体内包粒子を支持体として、抗原や抗体等を結合又は吸着させた免疫測定用粒子は、通常孔径が5〜20μmであるクロマト担体中を容易に展開(移動)することができる。更に、クロマト担体に非特異的に吸着することもないことから、クロマト展開性にも極めて優れる。従って、上記磁性体内包粒子を用いてなる免疫測定用粒子を用いれば、磁性体内包粒子の磁性量を標識として分析を行う免疫測定法、特に免疫クロマト法を好適に行うことができる。
具体的には、例えば、特開2006−292721号公報に開示されているように、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程1、前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程2、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程3、及び、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が50〜80重量%の粒子を分画し、回収する工程4を有する磁性体内包粒子の製造方法が挙げられる。
本明細書において、上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解してなるものをいう。
また、オゾンは、二重結合との反応性が高いことが知られている。オゾンが二重結合と反応すると、中間体であるオゾナイドが形成され、その後、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等の親水性基が生成する。例えば、上記有機高分子物質として、ポリスチレン系樹脂を用いた場合には、構造中のベンゼン環や未反応の二重結合が溶存オゾンと反応することによって、容易にカルボキシル基が生成すると考えられる。
上記オゾン水の濃度は、高い程好ましいが、ある程度以上の高濃度とするには技術的に困難となるため、現実的には、好ましい上限が200ppm、より好ましい上限が150ppmである。将来的に利用可能になれば、より高濃度のオゾン水を用いることが好ましい。
このような有機高分子物質と前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなり、表面を濃度が20ppm以上のオゾン水を用いて親水化処理された親水化磁性体内包粒子もまた、本発明の一つである。
このような本発明の親水化磁性体内包粒子と、該磁性体内包粒子の表面に共有結合により固定化した抗原又は抗体とからなる免疫測定用粒子もまた、本発明の一つである。
具体的には、例えば、縮合剤として水溶性カルボジイミド(WSC)を用いることによって、本発明の親水化磁性体内包粒子の表面に形成されたカルボキシル基等の親水性基と、抗原又は抗体とを共有結合により固定化する方法が挙げられる。この方法によれば、本発明の免疫測定用粒子を容易に製造することができる。
(1)磁性体内包粒子の作製
磁性流体「フェリコロイドHC50(タイホー工業社製)」10.0g(磁性体5g含有)をインキュベーター中で80℃にて12時間乾燥し、濃縮された磁性流体7.0gを得た。得られた磁性流体にヘキサン3gを加えて、一晩放置し、磁性体を分散させて磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液の全量に対して、スチレン10g、ヘキサデカン0.8g及び2,2’−アゾビスイソブチロニトリル0.05gを加え、スターラーを用いて氷冷下で混合してモノマー混合液を得た。
得られたミニエマルジョン溶液を窒素雰囲気下、80℃で、24時間重合することにより、磁性体内包粒子分散液を得た。
次いで、得られた磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて1分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取した。
得られた磁性体内包粒子10gにpH9.5の水酸化カリウム水溶液100mLを加え、15000RPMにて20分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、純水100mLを添加し、超音波で再分散後、15000RPMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を3回繰り返した。続いて、溶存オゾンガス濃度100ppmのオゾン水300mLに浸漬し、30分間攪拌した。攪拌終了後、15000RPMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。この操作を2回繰り返し、親水化処理を施し、粒子表面にカルボキシル基を有する親水化磁性体内包粒子を得た。
なお、オゾン水は、内径15cm×長さ20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径0.5mm×厚さ0.04mm×長さ350cmの中空管状のオゾンガス透過膜400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム(積水化学工業社製)を用いて調製した。
オゾン水で親水化処理した親水化磁性体内包粒子10.0mgに0.02Mリン酸緩衝液を625μL、予め調製した2%濃度の水溶性カルボジイミド溶液(リン酸緩衝液)625μL添加し、37℃恒温槽中で1.5時間撹拌した。反応溶液は、15000PRMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。その後、0.02Mリン酸緩衝液1.2mLを添加し、超音波で再分散し、15000PRMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。この操作を3回繰り返し、未反応の水溶性カルボジイミドを除去した。
実施例1と同様の方法により得られた磁性体内包粒子について、15ppmのオゾン水を用いて親水化処理を行ったこと以外は、実施例1と同様の方法により、免疫測定用粒子を得た。
なお、粒子への抗α−hCGモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの6%であることを確認した。
(1)磁性体内包粒子の作製
実施例1と同様の方法により、磁性体内包粒子を作製した。
(2)免疫測定用粒子の作製
得られた磁性体内包粒子5.0mgにpH9.5の水酸化カリウム水溶液1mLを加え、15000RPMにて20分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、0.02Mリン酸バッファー1.0mLを添加し、超音波で再分散後、15000RPMにて20分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を3回繰り返した。
実施例1及び比較例1、2で得られた免疫測定用粒子について、以下の方法により性能評価を行った。
次いで、各試験液200μLに免疫測定用粒子10μgを添加、混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに100μLをそれぞれ滴下した。
測定結果を表1に示した。
Claims (5)
- 有機高分子物質と前記有機高分子物質中に1〜30nmの分散径で分散した磁性体とからなる平均粒子径50〜500nmの磁性体内包粒子を、濃度が20ppm以上のオゾン水を用いて親水化処理する工程を有することを特徴とする免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子の製造方法。
- 有機高分子物質は、ポリスチレン系樹脂であることを特徴とする請求項1記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子の製造方法。
- 平均粒子径50〜500nmであり、有機高分子物質と前記有機高分子物質中に1〜30nmの分散径で分散した磁性体とからなり、表面を濃度が20ppm以上のオゾン水を用いて親水化処理されたものであることを特徴する免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子。
- 有機高分子物質は、ポリスチレン系樹脂であることを特徴とする請求項3記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子。
- 請求項3又は4記載の免疫クロマト法用の親水化磁性体内包粒子と、前記親水化磁性体内包粒子の表面に共有結合により固定化した抗原又は抗体とからなることを特徴とする免疫クロマト法用粒子。
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