JP4860133B2 - 糖化ヘモグロビンの分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法に関する。

イオン交換液体クロマトグラフィー法は、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。なかでも、近年では糖化ヘモグロビン類（以下、ヘモグロビンＡ１ｃともいう）の分析方法として注目されている。
ヘモグロビンＡ１ｃは、血液中の糖がヘモグロビンのα鎖Ｎ末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンＡ１ｃが占める割合、すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、１〜２ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンＡ１ｃが占める割合を示すヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。

イオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、例えば、シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応して得られたもの（特許文献１等）、架橋性単量体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの（特許文献２、特許文献３等）等が知られている。

これらのイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基と基材とからなるが、基剤部分には、膨潤したり収縮したりしないことが求められている。このため、例えば、基材として樹脂を用いる場合には、架橋度の高い樹脂が用いられている。しかし、架橋度の高い樹脂は、親水性が低いことからタンパク質等の非特異吸着を引き起し、測定精度が低下するという問題があった。このような非特異吸着を抑制する方法として、基材樹脂に親水性単量体を多く含有させる方法等が検討されているが、親水性を高めると基材の膨潤や収縮が生じやすくなり、高流速下における分析ができなくなったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりし、測定の遅延を招くという問題があった。

これに対して特許文献４には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を親水化処理した、具体的には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面にタンパク質等の親水基を有する化合物を吸着して親水化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が開示されている。このようなイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、基材が膨潤したり収縮したりしない一方で、親水性表面によりタンパク質等の非特異吸着を効果的に防止することができる。しかしながら、このように物理吸着により親水性化合物が固定化されている場合、使用初期の段階では高い性能を発揮できるものの、長期間使用しているうちに充填剤粒子の表面から親水性化合物が脱離してしまい、保持時間や測定値が変動することがあるという問題があった。また、吸着させる親水性化合物のロット間差によっても保持時間や測定値が変動するという問題点もあった。

特開平１−２６２４６８号公報 特公昭６３−５９４６３号公報 特公平８−７１９７号公報 特開２００１−９１５０５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により洗浄することにより親水化処理を施すイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により洗浄することにより、充填剤粒子の表面のみが親水化されることを見出し、本発明を完成するに至った。オゾン水には強力な酸化作用があることから、オゾン水により洗浄することによりイオン交換基を有する充填剤粒子の表面に親水性基（−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ）を生成させるものと考えられる。
このような方法により親水化処理を行った場合には、オゾン水が直接触れた表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。

上記充填剤粒子としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィー法の充填剤粒子として用いられているものを用いることができ、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子からなる有機系粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子からなる有機系粒子等が挙げられる。なかでも、合成高分子からなる有機系粒子は、架橋度等を調整することにより高い耐圧性や耐膨潤性を得ることができることから好ましい。

上記イオン交換基としては特に限定されず、陽イオン交換基であっても、陰イオン交換基であってもよい。上記陽イオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、ヘモグロビンＡ１ｃの分析にも高い効果が得られることから好適である。

上記イオン交換基を有する充填剤粒子は、粒子の表面にイオン交換基を導入したり、イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子としたりする方法により調製することができる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法としては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平８−７１９７号公報に記載された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法；（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル等の重合性エステル化合物を架橋性単量体等と混合し、重合
開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオン交換基に変換する方法等も用いることができる。

上記イオン交換基を有する充填剤粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎ分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。

上記イオン交換基を有する充填剤粒子の粒度分布について、粒子径のＣＶ値の好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法においては、上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により洗浄することにより親水化処理を施す。上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により洗浄する方法としては特に限定されないが、例えば、イオン交換基を有する充填剤粒子をオゾン水中に浸漬して撹拌する方法等が好適である。このような方法により、イオン交換基を有する充填剤粒子の表面を均一に親水化処理することができる。

上記洗浄に用いるオゾン水は、溶存オゾンガス濃度が２０ｐｐｍ以上であることが好ましい。２０ｐｐｍ未満であると、処理に時間がかかったり、充分な親水化処理を施せずにタンパク質の非特異吸着を充分に防止できなかったりすることがある。好ましくは５０ｐｐｍ以上である。溶存オゾンガス濃度の上限は特にないが、好ましい上限は２００ｐｐｍ未満である。２００ｐｐｍを超えると、充填剤粒子が劣化してその強度が不充分となることがある。
このような高濃度のオゾン水は、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを気体のみ通し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、オゾン水が直接接触した表面部分のみが親水化されていることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、また、タンパク質等が非特異吸着することもないことから極めて正確な測定を行うことができる。また、長期間にわたってこのような性能を維持することができ、長期間の使用後でも保持時間や測定値のバラツキが少ない。更に、ロット間差による保持時間や測定値のバラツキも極めて少ない。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、とりわけ糖化ヘモグロビンの分析に好適に用いることができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものである糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の１つである。

本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着
を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート４００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン８０ｇ、及び、ベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。

（２）オゾン水による洗浄処理
上記充填剤粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１５０ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、５分間攪拌した後、吸引濾過洗浄を行った。この操作を２回繰り返して親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。

（比較例１）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水洗浄を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。

（比較例２）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子２０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍＬを加え、２分間超音波処理し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍＬ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍＬ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるＢＳＡが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。

（評価）
実施例１及び比較例１、２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。

（１）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における初期測定値の評価
実施例１及び比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖
化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体の平均値を測定値とした。
結果を表１に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ

表１より実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、極めて正確な測定ができたのに対して、比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤も用いた場合には、想定される値よりもかなり低いヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。これは、比較例１のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、タンパク質等の非特異吸着が起こっているためと考えられる。

（２）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例１及び比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷資料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いて、１日に３００検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表２に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

表２より、実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、４５００検体の負荷試験を行ったあとでも、ほとんどヘモグロビンＡ１ｃの保持時間に変化がなく、正確なヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が可能であることが判った。一方、比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、負荷検体数が増えるに従ってヘモグロビンＡ１ｃの保持時間が変化する傾向があり、得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）も、実施例１の場合に比べてバラツキが大きいものであった。

本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。

Claims (2)

1. イオン交換基を有する充填剤粒子表面を、溶存オゾンガス濃度が１５０ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満のオゾン水により洗浄することにより親水化処理を施したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
2. イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１記載の糖化ヘモグロビンの分析方法。