JP2021032749A - 試料前処理方法及び分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖化ストレス評価法としての生体由来最終糖化生成物の分析方法、及びそれを可能にする試料調製方法の短時間化及び高感度、高精度化を目的とする。【解決手段】生体試料を、６５℃〜１１０℃で、塩酸を用いて酸加水分解処理し、前記処理した生体試料をシリカモノリス体で構成される固相に添加し、溶出する、糖化最終生成物（ＡＧＥｓ）の分析のための試料前処理方法。【選択図】図１
Description
本発明は、試料前処理方法及び分析方法に関し、特に、糖化最終生成物（advanced glycation endproducts：ＡＧＥｓ）を分析するために行う糖化最終生成物の前処理方法及び当該前処理方法を用いた糖化最終生成物の分析方法に関する。
生体内で蛋白とグルコ−スが非酵素的に反応すると、組織内には糖化最終生成物（advanced glycation endproducts：ＡＧＥｓ）が生成され、蓄積されることが知られている。そして、糖化最終生成物（以下「ＡＧＥｓ」ということもある。）の生体内での蓄積は、糖尿病、炎症、動脈硬化などの発症、進展に関与しているため、ＡＧＥｓの生体への影響は糖化ストレス（glycative stress）と呼ばれている。
ＡＧＥｓの物理化学的特徴の一つとして、蛍光性を有する化合物の存在が知られており、蛍光性ＡＧＥｓの多くは、励起波長３７０ｎｍ蛍光波長４４０ｎｍの条件で特異的な蛍光を持っていると言われている。この性質を利用し、腕や指先に励起光を光源からレンズを通して照射することで、ＡＧＥｓ由来の自家蛍光を取得し、体内に蓄積したＡＧＥｓを評価する測定機も開発されている。
生体内に存在するＡＧＥｓには様々な種類があり、このうちペントシジン（pentosidine）は、分子量が３７９で、分子内にリジン残基、アルギニン残基およびイミダゾピリジニウム環（imidazopyridinium ring） を持ち、蛍光性（励起波長３３５ｎｍ、蛍光波長３８５ｎｍ）かつ蛋白架橋性を有するＡＧＥｓの一種である。生体内でのペントシジンの生成・蓄積は組織のタンパク質を硬化させ、機能を低下させるため、皮膚老化、糖尿病合併症、骨粗鬆症などの進展に関与する。そのため、生体の糖化ストレス評価を目的に血中ペントシジンを精度高く定量することは非常に大きな意義がある。
そして、生体の糖化ストレス評価を行うためには、正確でかつ操作し易い測定方法の準備が必要である。現在、血中ペントシジンの測定方法はいくつか提案、実施されており、例えば、ヒト血中ペントシジン測定用に、酵素免疫測定法（enzyme‐linked immuno sorbent assay； ELISA）を用いた測定キットが販売されている（非特許文献１）。
又、血液サンプルを加水分解した後、イオン交換カラムで夾雑物を除去し、サンプルをイオンペア法による高速液体クロマトグラフィー（high performanceliquid chromatography； ＨＰＬＣ）で測定する方法（イオンペアＨＰＬＣ法）が提案されている（非特許文献２）。
一方、血液サンプルを加水分解の後、前処理カラムを使用せず、クエン酸を溶離液とした逆相ＨＰＬＣ法によりペントシジンを測定する方法（クエン酸ＨＰＬＣ法）（非特許文献３）は、前処理時のカラム精製が不要なため、測定時間の短縮、サンプル回収率の安定化による分析精度向上の可能性があった。
更に、上述の前処理カラムを使用しないクエン酸ＨＰＬＣ法の前処理条件とカラム温度の最適化に関する提案もされていた。具体的には、ＡＧＥｓ測定の前処理は、血漿サンプルを水素化ホウ素ナトリウムによる蛋白中アミノ酸残基の保護後、トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿を行い、水に再溶解し、６Ｎ塩酸を添加後に酸加水分解（１０５℃、１８時間）、濃縮乾固（遠心減圧乾燥）、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ２．０）に再溶解する。その後逆相カラムを用いて、カラム温度を２０℃とし、クエン酸を溶離液としたＨＰＬＣ測定を行う分析方法も提案されていた（非特許文献４）。
ＡＧＥｓ測定の前処理には、生体試料を加水分解する必要がある。この際の温度として、６５〜１００℃で６〜２４時間で処理することが提案されている（特許文献１、非特許文献５）。更に、生体試料を分解した後には、スチレン、アクリル系などポリマーを母体にした強陽イオン交換基を有する充填剤固相、言い換えれば強酸性陽イオン交換樹脂を用いた前処理方法が提案されている（特許文献１）。
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非特許文献１に記載された、ヒト血中ペントシジン測定のための、酵素免疫測定法（ELISA）では、前処理段階において加熱処理があるため、熱処理によって人為的に生成したペントシジンの影響により、測定値が高値化する可能性があるという問題点があった。
又、非特許文献２に記載された、イオンペアＨＰＬＣ法は、実験操作が煩雑で、サンプルの前処理において長い時間が必要であり、サンプル回収率が低下してしまうという問題点があった。
又、非特許文献３及び４に記載された、クエン酸ＨＰＬＣ法は、前処理時のカラム精製が不要なため、測定時間の短縮、サンプル回収率の安定化による分析精度向上の可能性があったが、ＨＰＬＣカラムの平衡化などを含めたトータルの分析時間、前処理を行わないことによる分析精度に問題があった。又、非特許文献４の手法では、２４検体を分析する場合に、前処理での濃縮乾固処理に４〜５時間を要し、又、ＨＰＬＣ測定も平衡化などを加えると１検体あたり１時間程度かかるため、２４検体では２４時間を要していた。このように分析を行う前処理部分において、操作が煩雑であり、濃縮乾固に時間がかかるため、精度と時間に改良が求められている。
又、特許文献１に記載された方法において使用される充填剤固相には、陽イオン交換基が結合されているが、疎水性官能基は結合されていない。そのため、精製の目的物質の物性にあわせた化学的修飾剤が充分ではなく、目的物質の精製の精度が充分ではなかった。
ここでいう前処理時のカラム精製とは、固相抽出法を用いた精製のことであり、従来の粒径の大きな粒子を詰めたカラムクロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなどの煩雑で特別な装置や技術を必要とする方法に代わって、粒子充填剤をカートリッジカラムに充填した方法が確立されている。この方法により前処理工程の簡便性、迅速性は格段に上昇したが、依然として微量且つ少量の成分を処理するにあたっては、多くの課題を抱えている。尚、固相抽出法とは、複雑な成分を含む試料中から目的成分のみを選択的に吸着、保持することにより分離精製を行う方法である。
このように、従来、前処理に使用する固相カラムは、粒子充填剤として破砕形或いは数十マイクロメートルの粉体を用いており、樹脂製（主にポリプロピレン製）のリザーバーに充填して使用していた。そして、粉体が溶出液中に逸脱することを防ぐために、分離にはかかわらないフリットといわれるフィルターで粉体を挟んでおり、乾式で充填を行っていた。しかし、乾式充填によって充填された粉体の充填状態は、ＨＰＬＣ用カラムのように高密度に充填されているわけではないため、フィルターを用いた粉体逸脱防止法では、振動や衝撃、急激な圧力変化に伴い、上部フリットと粉体上部との間に隙間が生じたり、粉体のフィルターからの逸脱や流出も見られるため、高流速での使用や安定した抽出回収率を得ることは困難であった。そのため、生体中の微量成分の前処理時間を短縮化することは出来なかった。又、カラムの上下にフリットを配置する形状では、カラム容量が小さくなるほど、フリットの体積が占める割合が大きくなるため、生体試料を扱う場合、自然落下法やバキューム法では、フィルター内部に処理時に用いる溶液や溶出時の目的成分が残存してしまうことが多く、特に微量成分の場合は、目的成分の大きなロスに繋がっていた。
そして、この固相抽出法の前処理における問題点は、溶出時に十分な溶出液を用いることにより解決することが可能であるが、この方法では、試料を希釈することとなり、後の検出操作での感度低下をもたらす原因となってしまう。その原因を解消する為に、溶出後に溶出液を濃縮乾固することも可能だが、濃縮乾固する場合には長い時間がかかるという問題点があった。
そこで、糖化ストレス評価法としての生体由来ＡＧＥｓの分析方法、及びそれを可能にする試料調製方法の短時間化及び簡便化が望まれていた。
上記課題を解決するための手段としての本発明は、生体試料を酸加水分解処理した後、モノリス体に逆相官能基及び陽イオン交換基を有する固相を用いて精製し、得られた試料をギ酸を添加した移動相を用いたＨＰＬＣ分析にかける方法であり、この方法により従来より分析時間を大幅に短縮し、高感度且つ高精度でＡＧＥｓを分析することが出来た。尚、試料は酸加水分解処理した後に濃縮乾固してもよいが、しなくてもよい。又は、試料を固相を用いて精製し、得られた試料を濃縮乾固してもよいが、しなくてもよい。
即ち、本発明は、ＡＧＥｓのための試料調製方法と分析方法であって、生体試料を酸加水分解処理した後、モノリス体に逆相官能基および陽イオン交換基を有する固相を用いて精製する試料調製方法である。尚、試料は酸加水分解処理した後に濃縮乾固してもよいが、しなくてもよい。又、本発明は、上記試料調製方法により調製された試料を、移動相、好ましくはギ酸を添加した移動相を用いたＨＰＬＣ−ＵＶ、蛍光検出器、質量分析計にて分析することを含むＡＧＥｓの分析方法である。
具体的には、生体試料を、６５℃〜１１０℃で、酸加水分解処理し、前記酸加水分解処理された生体試料をモノリス体で構成される固相に添加し、溶出する、糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記酸加水分解処理された生体試料に塩基性緩衝液を添加し、前記固相に添加する糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記塩基性緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液である糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記モノリス体が、疎水性官能基と陽イオン交換基とを有する糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記酸加水分解処理された生体試料を前記固相に添加し、揮発性塩及び有機溶媒を含有する溶媒で溶出する工程を備える糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記酸加水分解処理された生体試料を前記固相に添加し、揮発性塩を含有する溶媒で溶出し、連続して、揮発性塩及び有機溶媒を含有する溶媒で溶出する糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記モノリス体がカーボン量２０〜３０ｗｔ％、表面積３００〜４００ｍ２／ｇ、細孔径５〜２０ｎｍである糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記固相の通液方法が遠心法である糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記酸加水分解処理された生体試料を濃縮乾固処理を行わないで前記固相に添加する糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記モノリス体は、前記陽イオン交換基がリンカーを介したグラフト重合により合成されている糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記モノリス体は、疎水性官能基とリンカー試薬を同時に結合させる工程を含んだ方法により製造された糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記モノリス体は、シリカモノリス体である糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記生体試料が血漿又は血清である糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記酸加水分解処理は、塩酸を用いて行う糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法において、前記糖化最終生成物はペントシジンである糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法である。
又、上記試料前処理方法により調製された試料を、液体クロマトグラフィーを用いると共に、ＵＶ検出、蛍光検出又は質量分析することを含む糖化最終生成物の分析方法である。
又、上記分析方法において、液体クロマトグラフィー溶離液にギ酸を添加する糖化最終生成物の分析方法である。
又、上記分析方法において、液体クロマトグラフィー用カラム充填剤がＣ１８、Ｃ８、Ｃ４、Ｐｈから選択される１種である糖化最終生成物の分析方法である。
本発明の試料前処理方法により、ＡＧＥｓの試料調製から分析までの時間を短縮化することが可能となった。又、モノリス体に目的物質の物性にあわせて、疎水性官能基及び陽イオン交換基を有する固相を用いてＡＧＥｓを前処理、即ち精製することにより、夾雑ピークを除去することが出来、高精度且つ高感度なＡＧＥｓの分析が可能となった。又、分析カラム選択による時間短縮も可能となった。
本発明は、ＡＧＥｓの分析のための試料前処理方法であって、生体試料を、６５℃〜１１０℃で、酸を用いて加水分解処理し、酸加水分解処理した生体試料をモノリス体、例えばシリカモノリス体で構成される固相に添加し、溶出して、ＡＧＥｓの分析のための試料を調製する方法である。又、本発明は、この試料前処理方法で調製された試料を、液体クロマトグラフィーを用いて分析するＡＧＥｓの分析方法であり、ＡＧＥｓを分析する。
モノリス体とは、三次元網状の骨格構造を備え、一方の端部から他方の端部に連続し、且つ相互に連通する貫通孔（以下「スルーポア」ということもある。）と、貫通孔内に貫通孔より小径であって貫通孔間に連通する又は連通しない細孔（以下「メソポア」ということもある。）を有した、単一の多孔質体の構造物である。貫通孔は相互に連通し、モノリス体の上端から下端まで貫通した構造である。モノリス体としては、貫通孔が連続的かつ規則正しく三次元網目構造を形成しているものが好ましいが、これに限定されない。尚、貫通孔はモノリス体の軸と直行する方向の断面が円形又はそれに近いものが好ましい。
モノリス体の原料は、特に限定されないが、多孔質セラミックや多孔質ガラスなどの無機質が望ましい。多孔質セラミックの例としては、特に限定されないが、シリカやチタン、ジルコニウム、ハフニウムなどの４族元素化合物、アルミナシリケート質Ａ（硬磁気粒子を燒結したもの）、けい砂質、アルミナ質、アルミナシリケート質Ｂ（シャモット粒子を燒結したもの）、多孔質ムライト質、けいそう土質のもの等から選択することが出来る。この場合の製造方法として、例えば、一定範囲の粒子径の陶磁器粒子（硬磁気粉砕物、シリカ、アルミナ、シャモットなど）と気孔形成材、例えば結晶セルロ−スと適当な分散溶媒と混合・成形・燒結して製造することが出来る。
多孔質ガラスの例としては、特に限定されないが、組成がＮａＯ−Ｂ２Ｏ３−ＳｉＯ２−ＣａＯ系のものが挙げられ、Ａ１２Ｏ３、ＺｒＯ２、ＺｎＯ２、ＴｉＯ２、ＳｎＯ２、ＭｇＯ２など種々の酸化物を添加したガラスを用いて製造する場合もある。この場合の製造方法として、例えば、けい砂、硼酸、ソ−ダ灰及びアルミナを混合し、１２００〜１４００℃に溶融し、これを８００〜１１０℃にて成形後、未分相硼けいガラスを得、熱処理によりＳｉＯ２相とＢ２Ｏ３−ＮａＯ−ＣａＯ相に分相させ、酸処理によってＳｉＯ２骨格を残して製造することが出来る。モノリス体の原料が無機質の場合、熱処理時の条件を変化させることにより、細孔分布の均一なものが製造可能である。
このように、モノリス体の原料は特に限定されないが、生体試料成分の場合はモノリス体を形成する原料により、非対象物の吸着が生じる場合があり、固相抽出など実績のあるＳｉ骨格のものが好ましい。例えば、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン等を原料として製造されるシリカモノリス体が好ましく、又、これらの原料を単独又は混合してから行うゾル−ゲル合成により製造されるシリカモノリス体が好ましい。
シリカモノリス体の製造は、特に限定されないが、以下のように行うことが出来る。水溶性高分子を酢酸水溶液に溶解し、この溶液に上記原料加えて加水分解反応を行って攪拌した後に得られた溶液を固化させる。そして、固化したゲルをアンモニア水溶液中に浸漬した後、乾燥し、加熱することによって、非晶質シリカよりなる多孔質のモノリス体を得る。尚、アンモニア溶液浸漬の温度が高いほど大きいメソポアが得られ、温度コントロールによりメソポアの大きさは自由に変化させることが可能である。又、上記原材料比や固化時の温度によってスルーポアもコントロール可能である。
又、モノリス体として、耐薬品性やアルカリ性溶媒への耐久性が高く、多種な種類がある、高分子物質を原料とした多孔性有機ポリマーモノリス体を用いることが出来る。多孔性有機ポリマーモノリス体の材質は、特に限定されるものではないが、疎水性とカチオン交換基、好ましくはスルホン酸基をもつ樹脂を用いることができる。具体的には、スチレンージビニルベンゼン系、メタクリル酸エステル系、アクリルアミド系などの共重合体が挙げられる。これらの共重合体にカチオン交換基を導入したものなど多機能なものであってもよい。多孔性有機ポリマーモノリス体を構成するモノマーは、共重合体を有するものであれば特に限定されず、目的に適合したモノマーを選択すればよい。
これらに限定されるものではないが、例をあげれば、エチルメタクリレート、ｎ‐オクチルメタクリレート等のメタクリル酸アルキルエステル、スチレン、２‐アクリルアミド‐２‐メチルプロパンスルホン酸等のイオン交換基を有するものを用いることが出来、ジビニルベンゼンやエチレンジメタクリレート等の架橋剤と重合させるだけで逆相ポリマーモノリス体やイオン交換モノリス体をワンステップで調製することが出来る。またモノマーの配合割合を調節することで、疎水性やイオン交換容量を制御することが出来る。又、多孔性有機ポリマーモノリス体のスルーポアサイズや孔の均一性を制御するパラメーターとしては、モノマーを溶解するポロゲンの配合割合や溶媒種、モノマー濃度、架橋剤や重合開始剤の割合、重合温度が挙げられる。
モノリス体は、液体の流れる貫通孔であるスルーポアが、直径１〜５０μｍが好ましい。基本的にはスルーポア径が小さいほど、接触回数が増えるが、液体を流す際の通液抵抗も上昇する。遠心機を用いる場合には、スルーポアの直径は１〜１０μｍが好ましい。モノリス体の骨格表面にあるメソポアは、直径５ｎｍ以下のノンポーラスから直径１００ｎｍ程度が好ましいが、低分子の生体試料成分を処理対象とする場合は、メソポアの直径は５〜２０ｎｍ程度の細孔がより好ましい。又、モノリス体は表面積３００ｍ２／ｇ〜４００ｍ２／ｇとすることが好ましい。
モノリス体を用いる利点としては、以下の点を挙げることが出来る。先ず、モノリス体は３次元網状構造を備えることから、ろ過膜と同様な機能を有しているので、試料をろ過膜を通して濾過処理を行う工程や遠心分離により不溶物を除去する工程を省略することが出来る。
又、モノリス体は、粒子充填剤とは異なり、一体型の形状であるため、粒子充填剤に比べて機械的強度が高いことから、固相の通液方法として遠心分離機を用いた遠心法を使用することが出来るので、粒子充填剤を用いる場合と比較して、短時間に並列な試料の処理が可能であると共に、固相により精製を行う際にかかる時間も短縮化することが出来る。又、モノリス体は、遠心法を使用することが出来るので、バキューム法を使用した場合のように吸引速度をポンプで調製する必要がないため、初心者でも扱いやすく、作業者による回収率の差が生じ難い。特に生体試料のような微量の試料を扱う作業では、再現性が特に難しくなるが、粒子充填剤に比べてモノリス体を用いることにより、再現性の差を生じ難くすることが出来る。
更に、粒子充填剤を用いた固相では、充填剤を固相カートリッジに封入するためのフリットが必要であり、このフリットがデットボリュームとなる。又、バキュ−ム法では、フリット部分での液残りが大きな問題となっている。そして、固相容量が小さくなるほどこのデットボリュームの割合は大きくなり、回収率への影響は大きくなる。又、生体試料は、固相通液時に泡が発生しやすく、飛散などコンタミネーションの原因になりやすい。一方、モノリス体を用いた固相を用いることにより、遠心法を採用することが出来、遠心法では、下部に重力がかかるため、消泡作用も期待することが出来る。また試料量に対して希釈することなく、良好な回収率を可能にすることが出来る。従って、本発明では、操作性、操作時間、回収率の観点から、モノリス体を用いた遠心法による固相処理が好ましい。
モノリス体は、従来の充填剤に用いられている、試料の精製に適したコ−ティング剤及び／又は化学的修飾剤を適用してスルーポア及びメソポアの表面を修飾、改質することが出来る。
固相としてＳｉ骨格のシリカモノリス体を用いることにより、目的物質の物性にあわせて、疎水性官能基を選択して結合させることが出来る。本発明で使用するモノリス固相に使用する疎水性官能基としては、特に限定されず、従来固相に用いられているオクタデシル基、オクチル基、ブチル基、フェニル基、ペンタフルオロフェニル基、トリアコンチル基、オクタコシル基等を使用することが出来るが、オクタデシル基が好ましい。
疎水性官能基のシリカモノリス体の表面へ修飾する表面処理をオクタデシル基を例に説明するが、この方法に限定されるものではない。先ず、シリカモノリス体を所定厚に切断し、減圧乾燥させる。乾燥させたシリカモノリス体に対してオクタデシルトリメトキシシラン、特級ヘキサンをＬナス型フラスコに入れ、減圧にしながら超音波をあて、シリカモノリス体のメソポア内の空気を除去しながら、溶解し、混合する。混合後、ヘキサンを飛ばし、その後、シリカモノリス体を密閉容器に入れ、窒素パージを行った後、加熱して反応させる。反応後、シリカモノリス体を超音波洗浄し、デカンテーション破棄を繰り返した後、減圧乾燥を行う。
又、陽イオン交換基としては、特に限定されず、従来固相に用いられている陽イオン交換基を使用することが出来、例えば、２−（４−クロロスルフォニルフェニル）エチルクロロシランや２−（４−クロロスルフォニルフェニル）エチルトリメトキシシラン等シラン剤から出発するベンゼンスルホン酸を使用することが出来るが、スルホン酸型陽イオン交換基が好ましい。特に、リンカーを介したグラフト重合により製造され、多くのスルホン酸型陽イオン交換基を有するモノリス体が、試料の吸着性が向上するので好ましい。
陽イオン交換基のシリカモノリス体の表面へ修飾する表面処理をｐ−スチレンスルホン酸ナトリウムを用いた例で説明するが、この方法に限定されるものではない。先ず、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウムに蒸留水を添加し、分散させ、温め、試薬を完全に溶解させる。溶液が室温２５℃まで下がるまで静置する。メタノ−ル溶液を加え、０．２ｇのペルオキソ２硫酸アンモニウムを添加し、溶解する。上記混合溶液に対して、リンカー結合処理を施したシリカモノリス体を投入し、超音波をあてながら、脱気を行い、メソポア内の空気を除去した後、密閉容器に入れ、反応させる。反応後、反応液をデカンテーションにより除去し、シリカモノリス体を洗浄し、減圧乾燥を行う。
グラフト重合は公知の方法で行うことが出来、これらに限定されないが、例えば、シリカモノリス体に３−メタクリルアミドプロピルトリエトキシシラン或いは３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランをリンカーとして導入し、モノマーとしてアリールメタクリレート、同アクリレートをはじめとする不飽和エステル類、不飽和アミド類、スチレン、ビニル化合物、アリル化合物を重合させる方法で行うことが出来る。
特に陽イオン交換ポリマーとしては、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウムを用いることができるが、これに限定されない。又、開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム、ペルオキソ２硫酸アンモニウムなどを使用することができ、重合反応は、温度２０〜８０℃、時間１〜２４時間で行うことが出来る。
疎水性官能基と陽イオン交換基を同時にもつゲル合成では、オクタデシル基結合反応、リンカー結合反応、陽イオン交換基のグラフト重合反応と３段階でもよいし、時間的負担を減少させるために、リンカー試薬と疎水性官能基試薬を同時に結合させる反応工程を行った後に陽イオン交換基のグラフト重合を行う工程を行ってもよい。
ＡＧＥｓのひとつであるペントシジンを精製する場合、スルホン酸型官能基のみを有したモノリス体を使用すると、スルホン酸型官能基の数が多いために強い吸着が認められ、オクタデシル基を同時に有するモノリス体よりも溶出効率が悪くなる。
このように、モノリス体、詳しくはＳｉ骨格のシリカモノリス体が、疎水性官能基と陽イオン交換基を同時に有することで、試料の回収率の向上が認められるので、モノリス体はＳｉ骨格のシリカモノリス体が好ましい。又、シリカモノリス体は炭素量２０〜３０％、表面積３００ｍ２／ｇ〜４００ｍ２／ｇ、細孔径５〜２０ｎｍとすることが好ましい。このような構成とすることで、ＡＧＥｓの目的物質として用いたペントシジンにおいて９２％以上の良好な回収率を示す。
モノリス体は、図９に示すように、モノリス体３をポリプロピレン製等の空のカラム２へ挿入し、超音波融着法又は熱圧入法等にてスピンカラム１を作成して用いてもよい。
本発明の試料前処理方法で調製される試料及び分析方法により分析される試料は、ＡＧＥｓ（advanced glycation endproducts）を含有している。ＡＧＥｓとしては特に限定されないが、例えば、ペントシジン、アルグピリミジン、クロスリン、ピロピリジン、イミダゾロン、ピラリン、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＥＬ）カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ベスパリジンＧＡ‐ピリジン、ＧＯＬＤ、ＭＯＬＤ、ＤＯＬＤ、ＧＬＡＰ、グルコスパン、ＭＧ‐Ｈ１、Ｇ‐Ｈ、３ＤＧ‐Ｈ、ＣＭＣ等が挙げられる。又、上記ＡＧＥｓの中で、ペントシジン、クロスリン、ピロピリジン、ベスパリジンは蛍光性を有することで知られている。
本発明の試料前処理方法の処理の流れを説明する。先ず、生体試料を蛋白中アミノ酸残基保護のために水素化ホウ素ナトリウムによる処理を行う。続いて、生体試料をタンパク分解酵素や酸などを用いて分解する工程を経る。生体試料は、健常者から採取されたものでも患者から採取されたものでもよい。生体試料は、生体から採取されたあらゆる細胞、組織及び体液を含み、例えば、筋肉、骨、脂肪組織、血管、リンパ、血液、全血、血清、血漿、唾液、尿、毛髪、皮膚組織、爪等が含まれる。これらのうち、採取が容易な生体試料として血漿、血清、毛髪、皮膚角層、爪を使用することが好ましい。
酸加水分解に使用される酸は、有機酸でも無機酸でもよいが、塩酸が好ましい。酸加水分解に使用される酸の量、反応時間及び温度条件は、生体試料を十分に溶解できる条件且つ反応が進む温度であれば特に限定されず、使用する生体試料や酸の種類に応じて適宜決定することが出来る。酸加水分解の一具体例としては、血漿１００μＬに対して、６Ｎ塩酸を１００μＬ添加し、酸加水分解温度は、６５〜１１０℃で６〜２４時間処理して行うことが出来る。
酸加水分解された生体試料は、図５及び図６に示すように、遠心減圧乾燥による濃縮乾固処理を行い、適した溶媒に再溶解する溶媒置換を行い、固相により精製を行う（図５左側、図６左ルート）。しかし、この方法では、４〜５時間の大幅な時間ロスに繋がるので、時間短縮をするために、エバポレーター等による濃縮乾固処理（遠心減圧乾燥）を行わずに、酸加水分解された生体試料に、塩基性緩衝液、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下「Ｔｒｉｓ」という。）水溶液等のアルカリを添加して塩酸濃度等の酸濃度を下げ、直接モノリス体に添加して精製を行うことが好ましい（図５右側、図６右ルート）。
又、酸加水分解後の希釈には、Ｔｒｉｓ‐ｂａｓｅのような塩基性を示し、且つナトリウムイオンを含まないアンモニウム塩型の化合物が好ましい。ナトリウムイオンを含むと試料の回収が安定しないが、Ｔｒｉｓを含むと試料の回収が安定するからである。尚、添加する塩基性緩衝液は、特に限定されないが、酸加水分解で使用された酸と等量とすることが出来、又、Ｔｒｉｓ水溶液は１．５Ｍとすることが出来る。更に、疎水性官能基（逆相官能基）及び陽イオン交換基を有するモノリス体で構成される固相に添加して精製を行うことがより好ましい。酸加水分解された試料の精製は、固相としてのモノリス体に試料を添加した後に、モノリス体を洗浄し、吸着した物質を溶出させ、溶出液を回収することにより行う。
疎水性官能基（逆相官能基）と陽イオン官能基を同時に有するモノリス体の固相は、酸加水分解処理した試料を添加する前に、予め有機酸であるクエン酸やギ酸水溶液等にて洗浄及び平衡化しておくことが好ましい。例えば、０．１Ｍクエン酸水溶液／アセトニトリル（９９０／１０）２００μＬ又は０．１Ｍギ酸水溶液／アセトニトリル（９９０／１０）２００μＬにて洗浄し、次に０．１Ｍクエン酸水溶液４００μＬ又は０．１Ｍギ酸水溶液４００μＬにて平衡化するとよい。
そして、酸加水分解処理した試料を塩基性緩衝液、好ましくはアンモニウム塩緩衝液である１．５Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液にて混和し、モノリス体に添加し、通液させる。モノリス体に添加した試料中のＡＧＥｓを含む目的物質は、疎水性官能基と陽イオン交換を同時に有するモノリス体の固相に吸着する。
次いで、目的物質が吸着したモノリス体を洗浄する。洗浄は、例えば０．１Ｍクエン酸水溶液５００μＬ又は０．１Ｍギ酸水溶液５００μＬで洗浄する。この際夾雑物の除去を目的にアセトニトリルやメタノールの濃度を変更してもよい。この洗浄により夾雑物が除去され、溶出条件にて目的物質を選択的に回収することが出来る。
溶出液は、特に限定されないが、溶出は非酸性条件下で行うことが望ましいので、例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの揮発性塩が好ましく、これらの揮発性塩に有機溶媒を加えた溶出液も好ましい。有機溶媒は、特に限定されないが、アセトニトリル等を使用することが出来る。溶出は、例えば、１５０μＬの試料を固相に添加した場合、これに限定されないが、１Ｍギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．５）１５０μＬ又は１Ｍギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル（５０／５０（Ｖ／Ｖ））１５０μＬを用いて１回で溶出してもよい。又、１回で溶出するのではなく、複数回で溶出することとしてもよい。例えば、これに限定されないが、１Ｍギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．５）７５μＬで１回目の溶出をし、更に１Ｍギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル（５０／５０（Ｖ／Ｖ））７５μＬで２回目の溶出をし、或いは１Ｍギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル（５０／５０（Ｖ／Ｖ））７５μＬで１回目の溶出をし、１Ｍギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．５）７５μＬで２回目の溶出をして連続的に溶出しても良い。尚、固相に添加する試料溶液の量と溶出時に用いる溶出液の全量は異なる量でもよいが、溶出液の量が多いと、溶出後に試料の濃縮が必要になるので、溶出液の全量を等量程度とすることが好ましい。
上記の手順により精製された試料は、ＡＧＥｓ分析に適切な形態へと調製され、分析へと供される。
ＡＧＥｓ分析の方法は、液体クロマトグラフィーとＵＶ検出器を用いたＵＶ検出、蛍光検出器を用いた蛍光検出又は質量分析計を用いた質量分析との組み合わせが好ましい。サンプルやサンプル濃度、必要データによって検出器は使い分けることが好ましい。又、ＨＰＬＣカラムの固定相としては、逆相充填剤として使用されている、オクタデシル基、オクチル基、ブチル基、フェニル基、ペンタフルオロフェニル基、トリアコンチル基又はオクタコシル基を有する充填剤を利用することが出来るが、これらに限定されない。そして、特に夾雑物との分離、ＡＧＥｓの保持時間を重視し、ＨＰＬＣカラムの充填剤を適宜選択することが出来る。例えば、ＨＰＬＣカラムは、これに限定されないが、オクタデシル基結合型シリカゲル充填カラムで、粒子径が１．５〜７μｍ、修飾後のシリカゲルの炭素量が５〜１６％、表面積２００〜５００ｍ２／ｇ、細孔径が８〜３０ｎｍであるカラムを用いることが出来る。
液体クロマトグラフィーと質量分析計の組み合わせでは、ＨＰＬＣに使用する移動相に添加する揮発性の酸や塩はイオンサプレッションを引き起こさないものに限定される。そのため移動相は、クエン酸を用いることも出来るが、０．１％〜０．５％程度のギ酸添加等が好ましい。例えば、移動相をクエン酸とアセトニトリル又はギ酸とアセトニトリルを用いてステップグラジエントで溶出させることが出来る。又、ギ酸を用いることで、試料溶出後の洗浄及び平衡化に要する時間を短縮することが可能となる。液体クロマトグラフィーと検出器によるＡＧＥｓの測定条件は、目的とするＡＧＥｓの種類や、機器の型、試料の状態によって、通常の知識に則って適宜設定することが出来る。上記手順で測定された試料中のＡＧＥｓに関する測定値を、同様の手順で測定された標準物質からの測定値と比較することによって、生体由来のＡＧＥｓを定量することが出来る。具体的には、所定濃度のＡＧＥｓを含有する標準溶液から測定結果に基づいて、検量線を作成する。また、カラムスイッチング法等を用い、ＡＧＥｓの固相抽出処理を自動化することが出来れば、前処理から分析までを自動化（オンライン化）することも可能となる。
（試薬・機器）
以下の実施例１〜６において、試薬としては、ペントシジンの標準物質にはPolypeptide社（フランス）のpentosidine‐トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩を使用した。クエン酸は、和光純薬工業社製のものを使用した。ギ酸は和光純薬工業社製のものを使用した。血液サンプルの加水分解には３５％塩酸（和光純薬工業）又は無鉄塩酸（hydrochroric Acid（３５％） Fe free：ナカライテスク）を使用した。アセトニトリルは、ＨＰＬＣ用を使用した。装置は、ＨＰＬＣ Prominence システム（on‐line degassing unit：DGU20A3、pump unit with low‐pressure gradient unit：LC20AT、auto‐sampler：SIL20AC、column oven：CTO20AC、fluorescence detector：RF20Axs）及びデータ解析システム（LC solution：島津製作所）又は、Gulliver&EXTREMA ＨＰＬＣシステム（3-line degasser：DG-980-50、Ternary gradient unit：LG-1580-02、Intelligent HPLC pump：PU-980、Intelligent sampler：AS-2057-Plus、Fluorescence detector：FP-4020、Column oven：CO-4020）及びデータ解析システム（ChromNAV：日本分光）を使用した。
以下の実施例１〜６において、試薬としては、ペントシジンの標準物質にはPolypeptide社（フランス）のpentosidine‐トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩を使用した。クエン酸は、和光純薬工業社製のものを使用した。ギ酸は和光純薬工業社製のものを使用した。血液サンプルの加水分解には３５％塩酸（和光純薬工業）又は無鉄塩酸（hydrochroric Acid（３５％） Fe free：ナカライテスク）を使用した。アセトニトリルは、ＨＰＬＣ用を使用した。装置は、ＨＰＬＣ Prominence システム（on‐line degassing unit：DGU20A3、pump unit with low‐pressure gradient unit：LC20AT、auto‐sampler：SIL20AC、column oven：CTO20AC、fluorescence detector：RF20Axs）及びデータ解析システム（LC solution：島津製作所）又は、Gulliver&EXTREMA ＨＰＬＣシステム（3-line degasser：DG-980-50、Ternary gradient unit：LG-1580-02、Intelligent HPLC pump：PU-980、Intelligent sampler：AS-2057-Plus、Fluorescence detector：FP-4020、Column oven：CO-4020）及びデータ解析システム（ChromNAV：日本分光）を使用した。
（シリカモノリス体の合成）
以下の実施例１〜６において使用するシリカモノリス体は、以下のようにして形成した。水溶性高分子であるポリエチレンオキシド０．７０ｇを０．００１Ｎ酢酸水溶液１０ｇに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン５ｍＬを攪拌下で加えて加水分解反応を行った。数分攪拌した後に得られた透明溶液を密閉容器に移し、４０℃の恒温槽中で固化させた。固化したゲルを数時間熟成させ、０．１Ｎアンモニア水溶液中に、４０℃で１日毎に溶液を交換しながら３日間浸漬した。この後、ゲルを６０℃で乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で６００℃まで加熱した。これによって非晶質シリカよりなる多孔質のモノリス体を得た。得られた多孔質のシリカモノリス体は、水銀圧入測定及び窒素吸着測定により、中心孔径５μｍ程度の貫通孔（スルーポア）、１０ｎｍ程度の細孔（メソポア）が多数存在していることが確認され、表面積は３５０ｍ２／ｇであることが分かった。
以下の実施例１〜６において使用するシリカモノリス体は、以下のようにして形成した。水溶性高分子であるポリエチレンオキシド０．７０ｇを０．００１Ｎ酢酸水溶液１０ｇに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン５ｍＬを攪拌下で加えて加水分解反応を行った。数分攪拌した後に得られた透明溶液を密閉容器に移し、４０℃の恒温槽中で固化させた。固化したゲルを数時間熟成させ、０．１Ｎアンモニア水溶液中に、４０℃で１日毎に溶液を交換しながら３日間浸漬した。この後、ゲルを６０℃で乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で６００℃まで加熱した。これによって非晶質シリカよりなる多孔質のモノリス体を得た。得られた多孔質のシリカモノリス体は、水銀圧入測定及び窒素吸着測定により、中心孔径５μｍ程度の貫通孔（スルーポア）、１０ｎｍ程度の細孔（メソポア）が多数存在していることが確認され、表面積は３５０ｍ２／ｇであることが分かった。
（表面処理）
シリカモノリス体へのオクタデシル基及び強陽イオン交換基の修飾は以下の方法で行った。表面処理として、オクタデシル基とリンカーの同時修飾は以下ように行った。先ず、上記のようにして得られたシリカモノリス体を１．５ｍｍ厚でダイアモンドカッターにて機械的に切断し、８０℃で２日間減圧乾燥させた。乾燥させたシリカモノリス体１ｇに対してオクタデシルトリメトキシシラン１ｇ、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン０．２ｇ、特級ヘキサン３ｇを３００ｍＬナス型フラスコに入れ、減圧にしながら超音波をあて、メソポア内の空気を除去しながら、溶解し、混合した。混合後、７０℃でロータリーエバポレーターによりヘキサンを飛ばした。その後、シリカモノリス体をステンレス製の密閉容器に入れ、窒素パージを行った後、２００℃、１０時間反応させた。反応後、シリカモノリス体をヘキサン５０ｍＬで２回、アセトン５０ｍＬ１回で超音波洗浄し、デカンテーション破棄を繰り返した後、７０℃で減圧乾燥を１日行った。
シリカモノリス体へのオクタデシル基及び強陽イオン交換基の修飾は以下の方法で行った。表面処理として、オクタデシル基とリンカーの同時修飾は以下ように行った。先ず、上記のようにして得られたシリカモノリス体を１．５ｍｍ厚でダイアモンドカッターにて機械的に切断し、８０℃で２日間減圧乾燥させた。乾燥させたシリカモノリス体１ｇに対してオクタデシルトリメトキシシラン１ｇ、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン０．２ｇ、特級ヘキサン３ｇを３００ｍＬナス型フラスコに入れ、減圧にしながら超音波をあて、メソポア内の空気を除去しながら、溶解し、混合した。混合後、７０℃でロータリーエバポレーターによりヘキサンを飛ばした。その後、シリカモノリス体をステンレス製の密閉容器に入れ、窒素パージを行った後、２００℃、１０時間反応させた。反応後、シリカモノリス体をヘキサン５０ｍＬで２回、アセトン５０ｍＬ１回で超音波洗浄し、デカンテーション破棄を繰り返した後、７０℃で減圧乾燥を１日行った。
更なる表面処理として、強陽イオン交換基（ＳＣＸ）の修飾は以下のように行った。先ず、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム３ｇに蒸留水１２ｍＬを添加し、分散させた。６０℃のお湯で温め、試薬を完全に溶解させた。溶液が室温２５℃まで下がるまで静置した。８ｍＬのメタノール溶液を加え、０．２ｇのペルオキソ２硫酸アンモニウムを添加し、溶解した。上記混合溶液２０ｍＬに対して、上記のようにして得られた、オクタデシル基結合とリンカー導入されたシリカモノリス体１ｇを投入し、超音波をあてながら、脱気を行い、メソポア内の空気を除去した後、密閉容器に入れ、６０℃で１５時間反応させた。反応後、反応液をデカンテーションにより除去し、シリカモノリス体を５０％メタノール水溶液５０ｍＬで２回、水５０ｍＬで１回、アセトン５０ｍＬで１回、夫々超音波をあてながら洗浄し、７０℃で減圧乾燥を行った。乾燥後ＴＧ測定を行った結果、カーボン量は２５ｗｔ％であった。
（スピンカラムの作成）
以下の実施例１〜６においてシリカモノリス体を用いる時にはスピンカラムを用いた。スピンカラムは、直径約４．３ｍｍ×厚み１．５ｍｍの上記シリカモノリス体３を、ポリプロピレン製の空のカラム２へ挿入し、超音波融着法にて、図９に示すスピンカラム１を作成した。
以下の実施例１〜６においてシリカモノリス体を用いる時にはスピンカラムを用いた。スピンカラムは、直径約４．３ｍｍ×厚み１．５ｍｍの上記シリカモノリス体３を、ポリプロピレン製の空のカラム２へ挿入し、超音波融着法にて、図９に示すスピンカラム１を作成した。
（試料・機器）
血漿サンプル５０μＬに０．２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）２５０μＬを添加、３０分間室温にて静置し、アミノ基の保護処理をおこなった。次に、処理済みサンプル３００μＬに２０％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。そして、沈殿に５％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。その後沈殿に蒸留水１００μＬを添加し懸濁させた。次に、トリクロロ酢酸沈殿後懸濁試料１００μＬに６Ｎ塩酸１００μＬを添加し酸加水分解（１０５℃、１８時間）をおこなった。そして、遠心エバポレーターで乾固し、０．１Ｍクエン酸４００μＬにて再溶解した。この溶液を試料溶液（血漿酸加水分解物）とした。
血漿サンプル５０μＬに０．２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）２５０μＬを添加、３０分間室温にて静置し、アミノ基の保護処理をおこなった。次に、処理済みサンプル３００μＬに２０％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。そして、沈殿に５％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。その後沈殿に蒸留水１００μＬを添加し懸濁させた。次に、トリクロロ酢酸沈殿後懸濁試料１００μＬに６Ｎ塩酸１００μＬを添加し酸加水分解（１０５℃、１８時間）をおこなった。そして、遠心エバポレーターで乾固し、０．１Ｍクエン酸４００μＬにて再溶解した。この溶液を試料溶液（血漿酸加水分解物）とした。
又、試料の濃縮乾固には遠心エバポレーター（CC−105：トミー精工）を使用した。試料の加水分解時の加熱には、ブロックインキュベーター（Genius Dry Bath Incubator MD-02N：Major Science社）を使用した。試料の溶解、分散、懸濁には超音波洗浄機（VS−150：アズワン）を使用した。
血漿酸加水分解物中の夾雑物の除去並びにペントシジンの吸着が可能な官能基を選択するために、上述のように作成した、表面積３５０ｍ２／ｇ、メソポアサイズ１０ｎｍを有するシリカモノリス体の固相に様々な官能基、オクタデシル基（Ｃ１８）、フェニル基（Ｐｈ）、オクタデシル基及び強陽イオン交換基（Ｃ１８−ＣＸ）、オクタデシル基及び強陰イオン交換基（Ｃ１８−ＡＸ）、強陽イオン交換基（ＳＣＸ）、強陰イオン交換基（ＳＡＸ）、アミノ基（ＮＨ２）、弱陽イオン交換基（ＣＢＡ）、アミド基（Ａｍｉｄｅ）を修飾したシリカモノリス体を作成した。オクタデシル基及び強陽イオン交換基は上述のように修飾し、他は、それに準じた公知の方法で修飾した。
試料を添加する前に、上記のようにして得たシリカモノリス体に、０．１Ｍクエン酸水溶液／アセトニトリル（９９０／１０）２００μＬを通液し洗浄し、次に０．１Ｍクエン酸水溶液４００μＬを通液し平衡化した。そして、洗浄及び平衡化したシリカモノリス体に、上記のように調製した試料溶液（血漿酸加水分解物）を夫々１５０μＬ添加して通液し、そのフロースルー画分の分析を以下の条件で行った。シリカモノリス体への夫々の通液は、遠心加速度５，０００ｇ×１分を４℃にて遠心法で行った。結果を図１のクロマトグラムに示す。
分析条件：測定装置：Prominence （島津製作所）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２０℃、注入量２０μＬ、カラム：Ｕｎｉｓｏｎ ＵＳ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ）、検出器：蛍光Ｅｘ：３２５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ、移動相：Ａ）０．１Ｍクエン酸／アセトニトリル（９９５／５）、Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件（ステップグラジエント）：Ａ／Ｂ=１００／０−（０〜１５ｍｉｎ）−５０／５０−（１５〜２０ｍｉｎ）−１００／０−（２０〜６０ｍｉｎ）
図１のクロマトグラムに示すように、オクタデシル基＋強陽イオン交換基（Ｃ１８−ＣＸ）又は強陽イオン交換基（ＳＣＸ）を有するシリカモノリス体固相にて前処理をすると、ペントシジンが固相へ吸着した為、ペントシジンのピークは検出されなかった。よって、この２つの官能基種が精製度を向上させる官能基と判断することが出来た。又、強陽イオン交換基（ＳＣＸ）はペントシジンだけでなく、夾雑物も吸着していることから、溶出時に夾雑物も溶出してしまう可能性がある。よって、オクタデシル基＋強陽イオン交換基（Ｃ１８−ＣＸ）の方が強陽イオン交換（ＳＣＸ）と比較してクリーンアップ効果が高いことが分かる。若干ではあるがオクタデシル基（Ｃ１８）でもペントシジンの吸着が確認された。これらの結果から、オクタデシル基（Ｃ１８）と強陽イオン交換基（ＳＣＸ）が補完的にペントシジンの吸着に作用することが分かる。
次に実施例１と同様に洗浄、平衡化をおこなったオクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）又は強陽イオン交換（ＳＣＸ）を有するシリカモノリス体に、１０ｎｇ／ｍＬペントシジン標準試料（０．１Ｍクエン酸水溶液に溶解）１５０μＬを通液して吸着させ、０．１Ｍクエン酸水溶液５００μＬを通液して洗浄した。そして、１Ｍギ酸アンモニウム水溶液７５μＬを通液して第１回目の溶出をし、連続して１Ｍギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル（５０／５０（Ｖ／Ｖ））７５μＬを通液して第２回目の溶出をし、オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）と強陽イオン交換（ＳＣＸ）固相カラムの溶出効率の比較を行った。連続溶出した溶出液は１つにまとめ、１５０μＬとし、マイクロプレートリーダー（Ｅｘ：３２５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ）にて分析を行った。尚、シリカモノリス体への夫々の通液は、遠心加速度５，０００ｇ×１分を４℃にて遠心法で行った。結果を図２のグラフ図に示す。尚、図２の左の棒はペントシジン標準試料を前処理することなく分析したものである。
図２のグラフ図に示すように、連続溶出にて十分な回収率が得られた。又、オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）のほうが強陽イオン交換（ＳＣＸ）よりも溶出効率が高く、ペントシジンの前処理に最も有用であることが分かる。強陽イオン交換（ＳＣＸ）では陽イオン交換基量が多く、強力に吸着していると考えられる。オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）では、オクタデシル基が存在していることから、陽イオン交換基の結合量が減少し、なおかつオクタデシル基による保持も起こり、補完的な作用があることが理解できる。連続溶出することにより標準試料１５０μＬと同量の溶出液で希釈することなく精製出来たことから、時間短縮及び精度向上にはオクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）結合型のシリカモノリス体の固相がもっとも好ましいと判断することが出来る。
実施例１で調製した試料溶液（血漿酸加水分解物）を、上記のように作成したオクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）結合型シリカモノリス体の固相にて精製し、Ｃ１８結合型シリカゲルカラムを用いて以下の条件で分析を行った。固相による精製方法は、試料を添加する前に、シリカモノリス体に、０．１Ｍクエン酸水溶液／アセトニトリル（９９０／１０）２００μＬを通液し洗浄し、次に０．１Ｍクエン酸水溶液４００μＬを通液し平衡化した。そして、洗浄及び平衡化したシリカモノリス体に、実施例１で調製した試料溶液（血漿酸加水分解物）を１５０μＬ添加して通液した。その後、０．１Ｍクエン酸水溶液５００μＬを通液して洗浄した。そして、１Ｍギ酸アンモニウム水溶液７５μＬを通液して第１回目の溶出をし、連続して１Ｍギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル（５０／５０（Ｖ／Ｖ））７５μＬを通液して第２回目の溶出をし、溶出液は１つにまとめ、１５０μＬとし分析試料とした。シリカモノリス体への夫々の通液は、遠心加速度５，０００ｇ×１分を４℃にて遠心法で行った。
比較例として、従来までの非特許文献４に記載の前処理、即ち固相による精製無しのクエン酸ＨＰＬＣ法にてＣ１８結合型シリカゲルカラムを用いて、実施例１で調製した試料溶液（血漿酸加水分解物）を以下の条件で分析を行い、分析時間を比較した。結果を図３のクロマトグラムに示す。
本発明の実施例３の分析条件は以下の通りである。測定装置：Prominence （島津製作所）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２０℃、注入量：２０μＬ、カラム：Ｃ１８結合型シリカゲルカラム（４．６×１００ｍｍ、粒子径：３μｍ粒子、表面積：３００〜４００ｍ２／ｇ、細孔径：８〜１２ｎｍ、カ−ボン量：１２〜１６％）、検出器：蛍光Ｅｘ：３２５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ、移動相：Ａ）０．１％ギ酸（Ｖ／Ｖ）、Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件（ステップグラジエント）：Ａ／Ｂ=１００／０−（０〜１５ｍｉｎ）−５０／５０−（１５〜２０ｍｉｎ）−１００／０−（２０〜６０ｍｉｎ）
従来法の比較例の分析条件は以下の通りである。測定装置：Prominence （島津製作所）、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２０℃、注入量２０μＬ、カラム：Ｃ１８結合型シリカゲルカラムＵｎｉｓｏｎ ＵＳ−Ｃ１８（４．６×１００ｍｍ、粒子径：５μｍ粒子、細孔径：１３ｎｍ、Ｉｍｔａｋｔ社製）、検出器：蛍光Ｅｘ：３２５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ、移動相：Ａ）０．１Ｍクエン酸／アセトニトリル（９９５／５）、Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件（ステップグラジエント）：Ａ／Ｂ=１００／０−（０〜１５ｍｉｎ）−５０／５０−（１５〜２０ｍｉｎ）−１００／０−（２０〜６０ｍｉｎ）
図３のクロマトグラムに示すように、左側のクロマトグラムに示される比較例としての従来法では、固相による精製が無いため、多くの夾雑物ピークも検出された。夾雑物ピークが多いことから、アセトニトリルによる洗浄工程でとり切れなかった化合物の蓄積により、カラム寿命に影響することが予想される。又、ベースラインの安定を図るための平衡化時間までを含めると１分析が６０分程度かかっている。一方、右側のクロマトグラムに示される実施例によれば、この分析をＣ１８結合型シリカゲルカラム（４．６×１００ｍｍ、粒子径：３μｍ粒子、表面積３００〜４００ｍ２／ｇ、細孔径：８〜１２ｎｍ、カーボン量：１２〜１６％）、０．１％ギ酸にて行うことにより、短時間でペントシジンのピークを検出することが出来、更に、平衡化時間までを含めても１／２の３０分で分析が可能であった。又、実施例では、オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）結合型シリカモノリス体の固相による精製を行うことで夾雑物ピ−クが明確に減少していることも確認された。これにより分析時間短縮化が可能であること及びオクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）結合型シリカモノリス体による夾雑物除去効果が高く、分析精度の向上が可能であることが確認された。
実施例３の方法を用いて、更なる分析時間の短縮を検討し、以下の条件で分析を行った。結果を図４のクロマトグラムに示す。分析条件は以下の通りである。測定装置：Gulliver&EXTREMA（日本分光）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２０℃、注入量２０μＬ、カラム：Ｃ１８結合型シリカゲルカラム（４．６×１００ｍｍ、粒子径：３μｍ粒子、表面積：３００〜４００ｍ２／ｇ、細孔径：８〜１２ｎｍ、カ−ボン量：１２〜１６％）、検出器：蛍光Ｅｘ：３２５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ、移動相：Ａ）０．１％ギ酸（Ｖ／Ｖ）、Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件（ステップグラジエント）：Ａ／Ｂ=１００／０−（０〜８ｍｉｎ）−５０／５０−（８〜１０ｍｉｎ）−１００／０−（１０〜１８ｍｉｎ）
図４のクロマトグラムに示すように、溶離条件、即ちグラジエント条件を変更することで、平衡化時間までを含めた分析時間を、１８分まで短縮することが出来ることが明らかとなった。
濃縮乾固処理として遠心減圧乾燥及び再溶解を行う工程を含む、前処理から分析まで行う方法と、遠心減圧乾燥及び再溶解を行う工程を含まず、前処理から分析まで行う方法とを比較した。夫々の方法の工程及び相違点を図５に示す。尚、酸加水分解処理は、血漿サンプル５０μＬに０．２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）２５０μＬを添加、３０分間室温にて静置し、アミノ基の保護処理をおこなった。次に、処理済みサンプル３００μＬに２０％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。そして、沈殿に５％トリクロロ酢酸１ｍＬを添加し、１５分間氷冷後に遠心分離を行い、上清を除去した。その後沈殿に蒸留水１００μＬを添加し懸濁させた。次に、トリクロロ酢酸沈殿後懸濁試料１００μＬに６Ｎ塩酸１００μＬを添加し酸加水分解（１０５℃、１８時間）を行った。
図５に示すように、遠心減圧乾燥を行う方法（乾固法）（図５左側）と遠心減圧乾燥を行わない方法（乾固省略法）（図５右側）では、試料２４検体の酸加水分解工程までは２０時間と違いがない。その後、遠心減圧乾燥及び再溶解を行わずに、オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）を有するシリカモノリス体を用いた前処理及び実施例４に記載のＨＰＬＣ測定方法を用いることにより、遠心減圧乾燥工程及び分析時間の短縮が可能となり、約２９時間の工程が７．５時間と約１／４に短縮することが可能になったことが分かる。
実施例５と同様に、血漿サンプルを水素化ホウ素ナトリウムによるアミノ基の保護後、トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿を行い、水に再溶解し、６Ｎ塩酸を添加後に酸加水分解（１０５℃、１８時間）をする酸加水分解工程の後、遠心減圧乾燥及び再溶解を行わずに、オクタデシル基＋強陽イオン交換（Ｃ１８−ＣＸ）を有するシリカモノリス体を用いた前処理方法における、試料の希釈方法の相違による回収率の違いを確認した。又、酸加水分解した後、遠心減圧乾燥を行い、０．１Ｍクエン酸４００μＬで再溶解を行った場合（乾固法）と、遠心減圧乾燥を行わず、酸加水分解後に直接希釈溶液を添加した場合（乾固省略法）においての回収率の違いを確認した。
酸加水分解後に直接添加した希釈溶液は、１．５Ｍ ＮａＯＨ２００μＬ、０．３Ｍ ＮａＯＨ２００μＬ、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液２００μＬの３種類である。１．５Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液は、Trizma-base(Sigma-Aldrich社、Cat.No. T6066)を１８．１７ｇ量り取り、８０ｍLのMilliQ水に溶解した後、１００ｍＬにメスアップした。尚、ｐH調整はしていない。実験フロー図を図６に示す。又、試行回数３回のクロマトグラムを図７、回収量と再現性を図８に示す。
図７に示すように、塩酸をＴｒｉｓ水溶液で希釈することにより、酸加水分解後、濃縮乾固処理として遠心減圧乾燥を行うことなく、前処理を行うことが出来ることが明らかである。ＮａＯＨにおいては、ピーク面積値の再現性が悪いことが明らかであり、１．５Ｍ Ｔｒｉｓは、ピーク形状、面積再現性ともに高いことがわかる。ＮａＯＨにおいては、ナトリウムイオンが、モノリス体上のスルホン酸基と相互作用するため、試料中ペントシジンの吸着に影響し、回収が安定しないと考えられる。Ｔｒｉｓは、ナトリウムイオンを含まない緩衝液の一つであり、酸加水分解後の希釈には、Ｔｒｉｓ‐ｂａｓｅのような塩基性を示し、且つナトリウムイオンを含まないアンモニウム塩型の化合物が好ましい。
図８に示すように、従来法である濃縮乾固法（乾固法）はＣＶ値が９．３％であり、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ添加の場合はＣＶ値が４．２％と濃縮乾固法よりも高い再現性を示した。濃縮乾固法においては、一度試料を乾固させ、再溶解を行う際の人為的なロスが影響し、ＣＶ値が上昇していると考えられる。又、ペントシジン量平均値が濃縮乾固法では１１．３±１．０５ｐｇ、Ｔｒｉｓ添加法では１６．１±０．６８ｐｇとＴｒｉｓ添加法の値が上昇していた。濃縮乾固法の実試料では、酸加水分解処理後に乾固することで炭化物が容器に固着し、一部再溶解できないことに起因し、ペントシジン量が減少していると考えられる。Ｔｒｉｓ添加法では、濃縮乾固工程と再溶解工程を省略していることから、炭化物の固着が抑えられ、高い回収率が得られたと考えられる。上記実験結果から、Ｔｒｉｓ添加法は濃縮乾固法に比べ、回収量、再現性も向上し、より感度高く、安定した分析が可能となった。
以上のような本発明によれば、ＡＧＥｓの試料調製から分析までの時間を短縮化し、高精度且つ高感度なＡＧＥｓの分析が可能となったので、生体の糖化ストレス評価が正確且つ短時間で行うことが出来、医療の分野の研究並びに応用において利用が可能であると共に、糖化に着目した食品や化粧品等の様々な分野の研究並びに応用において利用が可能である。
１ スピンカラム
２ 空のカラム
３ モノリス体
２ 空のカラム
３ モノリス体
Claims (18)
- 生体試料を、６５℃〜１１０℃で、酸加水分解処理し、前記酸加水分解処理された生体試料をモノリス体で構成される固相に添加し、溶出する、糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記酸加水分解処理された生体試料に塩基性緩衝液を添加し、前記固相に添加する請求項１に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記塩基性緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液である請求項２に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記モノリス体が、疎水性官能基と陽イオン交換基とを有する請求項１から３のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記酸加水分解処理された生体試料を前記固相に添加し、揮発性塩及び有機溶媒を含有する溶媒で溶出する工程を備える請求項１から４のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記酸加水分解処理された生体試料を前記固相に添加し、揮発性塩を含有する溶媒で溶出し、連続して、揮発性塩及び有機溶媒を含有する溶媒で溶出する請求項５に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記モノリス体がカーボン量２０〜３０ｗｔ％、表面積３００〜４００ｍ２／ｇ、細孔径５〜２０ｎｍである請求項１から６のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記固相の通液方法が遠心法である請求項１から７のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記酸加水分解処理された生体試料を濃縮乾固処理を行わないで前記固相に添加する請求項１〜８のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記モノリス体は、前記陽イオン交換基がリンカーを介したグラフト重合により合成されている請求項１から９のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記モノリス体は、疎水性官能基とリンカー試薬を同時に結合させる工程を含んだ方法により製造された請求項１０に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記モノリス体は、シリカモノリス体である請求項１から１１のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記生体試料が血漿又は血清である請求項１から１２のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記酸加水分解処理は、塩酸を用いて行う請求項１から１３のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 前記糖化最終生成物はペントシジンである請求項１から１４のうち何れか１項に記載の糖化最終生成物の分析のための試料前処理方法。
- 請求項１から１５のうち何れか１項に記載の試料前処理方法により調製された試料を、液体クロマトグラフィーを用いると共に、ＵＶ検出、蛍光検出又は質量分析することを含む糖化最終生成物の分析方法。
- 液体クロマトグラフィー溶離液にギ酸を添加する請求項１６に記載の糖化最終生成物の分析方法。
- 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤がＣ１８、Ｃ８、Ｃ４、Ｐｈから選択される１種である請求項１６又は１７に記載の糖化最終生成物の分析方法。
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