JPH03179258A - 液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、液体クロマトグラフィーに適した充填剤、特
に弱カチオン交換クロマトグラフィーに適した充填剤に
関する。

（従来の技術） 各種物質の分離又は検出に液体クロマトグラフィーが使
用され、生体試料からのタンパク質の分離など、特に親
水性物質の分離には、水系のゲル浸透クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等が利用されている
。イオン交換クロマトグラフィー法はイオン交換基を有
する充填剤を用い、分離対象成分イオンの充填剤に対す
るイオン交換吸着性の差異によって分離する方法である
。

イオン交換基としてカルボキシル基を持つものは弱イオ
ン交換クロマトグラフィーとして、タンパク質やペプチ
ドの分析に有用である。

弱カチオン交換クロマトグラフィー用として最もよく用
いられる充填剤は、スチレン−ジビニルベンゼンの架橋
重合体粒子の表面にカルボキシル基を導入したゲル、或
はスチレン、ジビニルベンゼンとカルボキシル基を有す
る単量体との架橋共重合体ゲル等がある。このような合
成高分子系充填剤は、通常、特開昭５８−２２１１６４
号に開示された方法、つまり架橋性単量体及びカルボキ
シル基を有する単量体に重合開始剤を加えて懸濁重合す
ることによって調製される。或はスチレン、ジビニルベ
ンゼン及び加水分解反応によりカルボキシル基を生成し
得る官能基（以下、加水分解性の基、とする）を有する
単量体とを共重合させた後、加水分解反応により該官能
基をカルボキシル基としたゲルも用いられ得る。このよ
うな充填剤の耐圧性を向上させるには架橋度を上げる必
要があるが、架橋部分が疎水性なので架橋度を上げると
、ゲルの疎水性が増し、タンパク質の非特異的吸着が生
じる。このため架橋剤量が制限され、十分な耐圧性を得
ることが難しい、更に上記方法で得られた充填剤は、重
合体粒子内の全体にカルボキシル基が分散して存在する
ため、水性溶媒中では膨潤・収縮し易く、このような理
由からも耐圧性が不十分である。

耐圧性に優れ、比較的高速処理が可能で分離能に優れた
充填剤として、多孔性シリカゲルの表面にカルボキシル
基を化学結合したシリカ系充填剤がある。しかしこの充
填剤は表面の残存シラノール基の影響によりタンパク質
などの塩基性基を有する物質を吸着する特性を有する。

更にシリカゲルは酸及びアルカリで溶解するため、溶離
液のｐＨが３〜８に限定される。

更に、上記弱カチオン交換クロマトグラフィー用充填剤
に使用され得、比較的耐圧性に優れた充填剤として、特
開昭５９−１８７０５号、特開昭６２−６３８５６号及
び特開昭６３−７９０６４号に開示されている、いわゆ
るシード重合法によって得られる充填剤がある。

この重合法は、架橋重合体粒子に重合開始剤及び単量体
を含浸させて、これらを懸濁重合に供し、二層構造の粒
子を得ようとする方法である。この方法において、架橋
重合体粒子に含浸させる単量体としてカルボキシル基を
有する単量体を用いれば、弱カチオン交換クロマトグラ
フィー用充填剤が得られる。また加水分解性の基を有す
る単量体を含浸させて重合し、その後加水分解しても同
様の弱カチオン交換クロマトグラフィー用充填剤が得ら
れる。しかし、得られる充填剤粒子の内部にカルボキシ
ル基が存在するため、上記と同様の理由により、水系溶
媒中で膨潤・収縮し易く、従って耐圧性はなお不十分で
ある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり、その目
的とするところは、タンパク質等の親水性物質の分離に
適したクロマトグラフィー用充填剤であって、耐圧性が
高く、膨潤・収縮が少なく、かつタンパク質等の非特異
吸着が少ない充填剤およびその製造法を提供することに
ある０本発明の他の目的は、上記の優れた性質を有し、
特に弱カチオン交換クロマトグラフィーに好適な充填剤
およびその製造法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、疎水性架
橋重合体粒子の表面部分に、加水分解反応によりカルボ
キシル基を生成し得る官能基を有する単量体を重合させ
て１０〜３００人の厚さに被覆し、次いで被覆された重
合体粒子の表面を加水分解させることにより得られる、
表面がカルボキシル基を持つ重合体で被覆された液体ク
ロマトグラフィー用充填剤であり、そのことにより上記
目的が達成される。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法は、
重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を調製す
る工程；および該疎水性架橋重合体粒子を分散させた分
散液に、加水分解反応によりカルボキシル基を生成し得
る官能基を有する単量体を添加して溶解させ、該疎水性
架橋重合体粒子の表面部分で該単量体を重合させ、該疎
水性架橋重合体粒子の表面部分に、加水分解反応により
カルボキシル基を生成し得る官能基を有する重合体の層
を形成する工程；および該官能基を加水分解し、粒子表
面にカルボキシル基を有する被覆重合体粒子を得る工程
を包含し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明に使用される疎水性架橋重合体粒子の素材として
は、疎水性架橋性単量体を（共）重合さセて得られる（
共）重合体又は疎水性架橋性単量体と疎水性非架橋性単
量体との共重合体が挙げられる。これらの（共）重合体
は、上記のように本発明の充填剤の骨格部分であるから
、後述する加水分解反応条件において化学反応（例えば
、加水分解）しない重合体を形成するものであることが
必要である。従って素材となる上記単量体は、加水分解
反応条件において、化学反応し得る官能基を持たない単
量体である。また上記の疎水性架橋重合体は、疎水性架
橋性単量体の単独重合体、或は二種以上の架橋性単量体
よりなる共重合体である。また必要に応じて、一種以上
の非架橋性の単量体を添加する事も出来る。

上記疎水性架橋性単量体としては、例えばジビニルベン
ゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニル
ナフタレン等の２個以上のビニル基を有する芳香族系化
合物が挙げられる。また必要に応じて素材とし得る、疎
水性非架橋性の単量体としては、例えばスチレン、メチ
ルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。上記架
橋性及び非架橋性単量体を混合して用いる場合には、架
橋性単量体が全単量体１００重量部に対して１０重量部
以上、好ましくは２０重量部以上となるよう使用される
。

本発明において、疎水性架橋重合体粒子を被覆する重合
体の素材としては、加水分解性の基を有する単量体を重
合して得られるものである。この様な単量体としては、
例えばアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル等のアク
リル酸又はメタクリル酸（以下、（メタ）アクリル酸と
する）のアルキルエステル類：（メタ）アクリルアミド
；（メタ）アクリロニトリル等が挙げられる。これらの
加水分解性の基を有する単量体は、必要に応じて二種以
上が混合して用いられ得る。該単量体の使用量は単量体
の種類によって異なるが疎水性架橋重合体１００重量部
に対して５〜５０重量部の割合である。

上記の加水分解性の基を有する単量体は、疎水性架橋重
合体の表面で重合されて該重合体を被覆するが、その被
覆層の平均的な厚さは１０〜３００人が好ましい、該被
覆層は、重合後に加水分解されてカルボキシル基を生成
し、弱カチオン交換能を有する様になると共に、親水性
を有する様になる。

そのため平均厚さが３００Åを超えると、該被覆層部の
膨潤・収縮効果が無視できないほど大きくなり、分離能
の低下、圧力の上昇が起こり易くなる。

また、平均厚さが３００人を超えると、溶離液との平衡
化に時間が掛かるため分離能の低下、分析時間の延長を
起こすので好ましくない、平均厚さが１０人より小さい
場合は被覆が不完全であり、疎水性架橋重合体粒子の表
面が露出している部分が生し易い。このような露出があ
ると、被分離物質（例えば、タンパク質等）が充填剤に
非特異的に吸着する可能性がある。

本発明における被覆層の観察及びその厚さの測定は以下
の様にして行われる。試料とする充填剤粒子からミクロ
トームで１０００Å以下の切片を作成する。該切片を、
カルボキシル基に特異的なラベル化剤又は染色試薬で処
理し、透過型電子顕微鏡で観察および写真撮影する０例
えば硝酸銀溶液で処理する事により、カルボキシル基は
銀と反応しＣＯＯＡｇとなるので、透過型電子顕微鏡に
より充填剤粒子内のカルボキシル基の分布状態、被覆層
の状態及び平均厚さの測定をする事が出来る。

次に本発明の充填剤を調製する為の代表的な製造例を説
明する。但し本発明の充填剤は、下記の方法によって得
られた物に限定されるものではない。

本発明の弱イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を調
製するには、最初に疎水性架橋重合体粒子が調製される
。この疎水性架橋重合体粒子は、既知の任意の水性懸濁
重合法により調製され得る。

まず上記疎水性単量体（疎水性架橋性単量体及び必要に
応じて疎水性非架橋性単量体）と重合開始剤とを希釈剤
に溶解させる。該重合開始剤及び得られた疎水性架橋重
合体粒子に含浸させる（後述）重合開始剤は、ラジカル
を発生する触媒であり、疎水性であれば特に限定されな
い０例えばベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオ
キサイド、クメンパーオキサイド等の有機過酸化物；ア
ゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチロアミド
等のアゾ化合物等、既知のラジカル発生触媒のいずれも
が使用され得る。

上記の希釈剤は多孔形成剤として添加するもので、上記
単量体を溶解させ、かつその重合体を溶解させない有機
溶媒のいずれもが使用可能である。

例えば、トルエン、キシレン、ジエチルヘンゼン、ドデ
シルヘンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタ
ン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素類；イソアミル
アルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール
等のアルコール類が挙げられる。その使用量は何等限定
されないが、上記単量体混合物１００重量部に対して２
００重量部以下の割合である事が好ましい。

上記単量体混合物（単量体、開始剤、希釈剤）をポリビ
ニルアルコール、リン酸カルシウム等の懸濁安定剤を溶
解した水相に添加し、窒素置換後撹拌しながら４０〜１
００°Ｃに加熱する事によりＰ！濁重合を行う、得られ
た重合体粒子中には希釈剤である有機溶媒が分散して存
在する為、重合終了後に有機溶媒を除去する事により、
多孔性の球状粒子が得られる。希釈剤として上記単量体
混合物と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用する事に
より、多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変化させる
事が可能である。

次に、得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含
浸させる０重合開始剤を含浸させるには、該重合開始剤
を、低沸点でかつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶媒
に溶解させ、これに上記疎水性架橋重合体粒子を浸漬す
る。これにより重合開始剤が粒子中に浸透する。これを
必要に応じて重合開始剤の分解点以下の）温度で加熱し
て溶媒を留去すれば、その内部に重合開始剤を含有する
疎水性架橋重合体粒子が得られる。この重合開始剤含有
粒子を上記加水分解性の基を有する単量体が溶解する分
散媒中に分散させ、或は該粒子が分散する分散媒中に加
水分解性の基を有する単量体を添加し、溶解させて、窒
素置換後撹拌下に加熱して重合を行う、この重合により
、加水分解性の基を有する単量体が疎水性架橋重合体粒
子の表面に重合し、該粒子を被覆する。上記の分散媒と
しては加水分解性の基を有する単量体を熔解する水又は
有機溶媒、或は両者の混合物が使用され得る１分散媒に
は疎水性架橋重合体の分散性を安定させる為、カルボキ
シメチルセルロース、ポリビニルアルコール等の分散安
定剤を添加することも出来る。

重合の温度及び時間は、反応させる加水分解性の基を有
する単量体の種類と重合開始剤の種類によっても異なる
が、４０〜ｉｏｏ　’ｃで０．５〜２０時間程度である
１以上の方法（以下含浸法とする）により、上記の二層
構造の重合体粒子が調製される。

上記重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を加
水分解性の基を有する単量体の重合反応に供する方法の
他、疎水性架橋重合体粒子の調製に引き続いて加水分解
性の基を有する単量体を反応させる方法（以下連続法と
する）によっても上記二層構造の重合体粒子が調製され
得る。この方法においては、まず上記疎水性架橋重合体
粒子を調製する為の重合反応を開始させる１重合がある
程度進行し、かつ未反応の重合開始剤が残存している時
に上記加水分解性の基を有する単量体を反応系に加える
。このような状態においては、系内の油相及び生成した
疎水性架橋重合体粒子内部に重合開始剤が存在する為、
引き続いて加水分解性の基を有する単量体の重合が起こ
り、しかも該疎水性架橋重合体粒子の表面部分を被覆す
る形で加水分解性の基を有する重合体の層が形成される
。

従ってこの連続法によっても、上記含浸法と同様の二層
構造粒子が得られる。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒等で
十分洗浄し、粒子に含有されている、或いは付着してい
る懸濁安定剤、溶媒、残存単量体等を除去する。

得られた重合体粒子を酸触媒又はアルカリ触媒により加
水分解を行う事により、粒子表面の被覆層に存在する加
水分解性の官能基が加水分解されてカルボキシル基とな
る０例えば加水分解性の基を有する単量体としてアクリ
ル酸メチルを用いた場合、重合体粒子を水酸化ナトリウ
ムの１５〜２５重量％メタノール溶液中で６０〜８０°
Ｃの温度で４〜１０時間反応させる事によって粒子表面
の−ＣＯＯＣ１ｈ基はカルボキシル基となる。

加水分解反応後、重合体粒子を濾取し、数回洗浄して乾
燥し、更に必要に応して粒子を分級する事により、弱カ
チオン交換クロマトグラフィー用の充填剤が得られる０
本発明の充填剤は疎水性架橋重合体を骨格とし、カルボ
キシル基を有する重合体で該疎水性架橋重合体の表面部
分が被覆された二層構造の重合体粒子である。骨格部分
として架橋度の高い重合体を用いる事によって、機械的
強度が極めて大きく耐圧性に優れた液体クロマトグラフ
ィー用充填剤を得る事が出来る。この充填剤の骨格部分
には親水性基が存在しない為、膨潤及び収縮の度合が極
めて小さい０表面はカルボキシル基を有する親水性の重
合体が被覆されている為、タンパク質等の非特異吸着が
無く、弱カチオン交換クロマトグラフィー用充填剤とし
て好適である。この充填剤は広いｐｌ＋範囲において使
用する事が可能である。さらに上記の様に耐圧性が大き
く、膨潤・収縮の度合が極めて低い為、粒径の微小化が
図れ、その結果高精度での分離が可能となる。高圧条件
下での使用が可能な為、迅速分析がなされ得る。

（以下、余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例及び比較例において得られた充填剤の物性
測定及び性能評価の方法は次の通りである。

「被覆層の平均厚さの測定方法」 充填剤に用いる被覆重合体粒子をエポキシ樹脂に包埋し
た後、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社製ミクロトームＵ
ＬＴＲＡＣｔｌＴＥを用いて厚さ約９００人の切片を得
る。

この切片を、硝酸銀溶液（容量分析用、和光純薬工業ｅ
珀製）でラベル化し、日本電子■型透過型電子顕微鏡Ｊ
ＥＭ１００Ｓにて観察および写真撮影を行い、カルボキ
シル基の分布状態及び被覆層の平均厚さを測定した。

「充填剤の評価方法］ 得られた充填剤を内径６ｍｍおよび長さ７５ｍｍのステ
ンレス製カラムに充填し、耐圧性および水に対する膨潤
性を調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し、流速を変
えて流速と圧力損失との関係より測定した。膨潤性は、
イオン強度の異なる液を流したときのカラム圧の変化よ
り求めた。

京都電子工業■製電位差自動滴定装置ＡＴ−３１０によ
り充填剤表面のカルボキシル基を定量した。更に■京都
第−科学製旧−ＡＵＴＯ＾３．でヒト血液の分析を行い
分離能などを従来品と比較した。測定方法は次の通りで
ある。ヒト血液検体として、同一人（健康人）の血液を
採取後直ちにヘパリンを添加したものを用いた。血液検
体は、本装置付属の専用溶血液２１Ｌ（ノニオン系界面
活性剤を含むリン酸緩衝液）によって、自動的に２９０
倍に希釈、溶血される。溶離液は本装置付属の専用試薬
であるＡ液（ｐ１１５．９のリン酸緩衝液）、Ｂ液（ｐ
ｌ＋７．２のリン酸緩衝液）およびＣ液（ｐＨ５，９の
リン酸緩衝液）を使用した。別に、積木化学工業■製液
体クロマトグラフシステム５ＳＬＣ−２０を用いてタン
パク質標準物質の分離を行った。

実施例１ 疎水性架橋重合体粒子として種水化学工業■製ポリスチ
レン系ゲルＨ３Ｇ−５０２００ｇを用い、これをアセチ
ルパーオキサイド（重合開始剤）０．５ｇが溶解してい
るアセトン１ｊ２に浸漬して該重合開始剤を含浸させた
０次に、アセトンを２０″Ｃにおいて減圧下で留去した
。５０％メタノール水溶液２１に上記の含浸処理した疎
水性架橋重合体を分散させ、撹拌しながらアクリル酸メ
チル（加水分解性の基を有する単量体）５０ｇを添加し
、窒素置換後７０°Ｃで５時間重合反応を行った。生成
物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。得ら
れた微小のポリマー粒子１５０ｇを、水酸化ナトリウム
の２０重量％メタノール？容液液５００Ｒ中に添加し、
７５°Ｃにて５時間加熱してポリアクリル酸メチルのエ
ステル部分を力１１水分解した０反応混合物を室温に冷
却した後、重合体粒子を濾取して、数回洗浄し乾燥した
。

得られたポリマー粒子を、日清エンジニアリング■製空
気分級機ターポクラシファイアＴＣ−１５Ｎにより分級
して粒径が８〜１０μｍの粒子を集め、充填剤を得た。

これを内径６　ｍｍおよび長さ７５ｎ＋＋ｎのステンレ
ス製カラムに充填した。充填は精製水３５ｍ１に充填剤
２ｇを取り５分間撹拌した後、　２　、０　ｍｌ　７分
で定流量充填することより行った。

上記の方法により耐圧性及び膨潤性の評価を行った。耐
圧性評価においては、１５０ｋｇ／ｃ−まで圧力損失が
流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離液を
４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリン酸緩衝液
に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められなかった０
滴定により充填剤表面のイオン交換能を測定したところ
０．７ｍｅｑ／ｇであった。また充填剤を上記の方法に
より硝酸銀溶液で処理して、被覆層の平均厚さを測定し
たところ、約１００人であった。■京都第−科学製旧−
ＡＵＴＯＡｒｃでヒト血液の分析を行った。その結果得
られたクロマトグラムを第１図に示す。第１図および後
述の第３図、第５図において、１はヘモグロビン（以下
）１ｂとする）Ａ１．およびＡ＋ｂ　、２は胎児性Ｗｂ
（Ｆ）　、３は不安定型１１ｂＡ、ｃ、４は安定型）１
ｂ＾Ｉｃ　、そして５は正常Ｈｂ（Ａｏ）に起因するピ
ークである。

さらに積木化学工業■製液体クロマトグラフシステム５
ＳＬＣ−２０を用い数種のタンパク質（Ｓｉｇｍａ社製
）の混合物の分離を行った。溶離は、２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐ）１７．０、以下Ａ液と表す）：およびＡ液と
０．５Ｍ　ＮａＣ１との等量混合物（以下Ｂ液と表す）
を用い、Ａ液１００χからＢ液１００χへのリニアグラ
ジェント法により行った。その結果得られたクロマトグ
ラムを第２図に示す。第２図及び後述の第４図、第６図
において、ピーク６はξオグロビン、７はトリプシノー
ゲン、８はリボヌクレアーゼＡ、９はチトクロームＣ、
モして１０はリゾチームに起因するピークである。

実施例２ スチレン（疎水性非架橋性単量体）１００ｇ　、ジビニ
ルヘンゼン（疎水性架橋性単量体）２００ｇ及びベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤）Ｉｇをトルエン（希
釈剤）２００ｇに溶解させた。これを４χポリビニルア
ルコール水溶液２．５Ｃに添加して、撹拌しながら調粒
した後、窒素置換下で８０’Ｃに加熱し懸濁重合を行っ
た。　８０″Ｃで８時間重合した後、生成物を熱水及び
アセトンで順次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架橋重合
体粒子を得た。

この疎水性架橋重合体粒子２００ｇをアセチルノく−オ
キサイド（重合開始剤）０．５ｇが溶解しているアセト
ン１１に浸漬して、該重合開始剤を含浸させた０次に、
アセトンを２０’Ｃにおいて減圧下で留去した。５０％
メタノール水溶液２１に上記の含浸処理した疎水性架橋
重合体を懸濁させ、撹拌しながらアクリロニトリル（加
水分解性の基を有する単量体）　５０ｇを添加し、窒素
置換後７０°Ｃで１０時間重合反応を行った。生成物を
熱水及びアセトンで順次洗浄し、乾燥した。このポリマ
ー粒子を実施例１と同様に加水分解、分級及び充填して
評価した。

その結果、而（正性については１５０ｋｇ／　ｃ＋ａま
で圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験を行ったとこ
ろ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭの
リン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認めら
れなかった０滴定により充填剤表面のイオン交換能を測
定したところ０．４ｍｅｑ／ｇであった。また、充填剤
を硝酸銀溶液で処理して、上記の方法にしたがって被覆
層の平均厚さを測定したところ、約７０人であった。実
施例１と同様にしてヒト血液および種々のタンパク質の
分離を行った。その結果得られたクロマトグラムを第３
図および第４図に示す。

実施例３ この実施例では、疎水性架橋重合体粒子の調製に続いて
加水分解性の基を有する単量体を反応させる、連続法を
採用した。

スチレン１００　ｇ　、ジビニルへンゼン２００ｇおよ
びヘンシイルバーオキサイド１ｇをトノレニン２００ｇ
にン容解し、４％ポリビニルアルコール水溶液２．５１
に添加して、撹拌しながら調粒した後、窒素置換下で８
０″Ｃに加熱し懸濁重合を行った。８０°Ｃで２時間重
合した後アクリルアミド（加水分解性の基を有する単量
体）５０ｇを上記の系に添加し、さらに８０°Ｃで２時
間重合し、生成物を熱水及びアセトンで順次洗浄し乾燥
した９次に乾燥ゲル２００ｇを水酸化ナトリウムの２０
（重量）％メタノール？容？夜５００ｍｆｆ１中で１０
時間７５°Ｃに加熱した。反応混合物を室温に冷却した
後、数回水洗し、乾燥した。得られた微小のポリマーゲ
ルを実施例１と同様の方法で、分級および充填して評価
した。その結果、耐圧性については１５０　ｋｇ／　ｃ
ｆｒまで圧力損失と流速が比例した。

膨潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸
緩衝液から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えた場合、カ
ラム圧力の上昇は認められなかった０滴定により充填剤
表面のイオン交換能を測定したところ０゜５ｍｅｑ／ｇ
であった。また、充填剤を硝酸銀溶液で処理して、上記
の方法にしたがって被覆層の平均厚さを測定したところ
、約８０人であった。実施例１と同様にしてヒト血液お
よび種々のタンパク質の分離を行った。その結果得られ
たクロマトグラムは第１図および第２図と同様であった
。

実施例４ この実施例においても、疎水性架橋重合体粒子の調製に
続いて加水分解性の基を有する単量体を。

反応させる、連続法を採用した。

スチレン１００　ｇ　、ジビニルベンゼン２００ｇおよ
びベンゾイルパーオキサイド１ｇをトルエン２００ｇに
溶解し、４％ポリビニルアルコール水溶液２１に添加し
て、撹拌しながら調粒した後、窒素置換下で８０°Ｃに
加熱し懸濁重合を行った。８０°Ｃで４時間重合した後
、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（加水分解性の
基を有する単量体）５０ｇを上記の系に添加し、さらに
８０°Ｃで２時間重合し、生成物を熱水及びアセトンで
順次洗浄し乾燥した。得られた微小のポリマー粒子を実
施例１と同様の方法で加水分解、分級および充填して評
価した。その結果、耐圧性については１５０ｋｇ／　Ｃ
ＴＩＩまで圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験を行
ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２０
０ｍＭ　のリン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上
昇は認められなかった０滴定により充填剤表面のイオン
交換能を測定したところ０．６ｍｅｑ／ｇであった。ま
た、充填剤を硝酸銀）液液で処理して、上記の方法にし
たがって被覆層の平均厚さを測定したところ、約１００
人であった。実施例１と同様にしてヒト血液および種々
のタンパク質の分離を行った。その結果得られたクロマ
トグラムは第１図および第２図と同様であった。

比較例１ スチレン１００ｇ　、ジビニルベンゼン２００ｇ、アク
リル酸メチル（加水分解性の基を有する単量体）７０ｇ
、アセチルパーオキサイド１ｇをトルエン２００ｇに溶
解し、４％ポリビニルアルコール水溶液２．５１に添加
して、撹拌しながら調粒した後、７０″Ｃに加熱し懸濁
重合した。７０°Ｃで８時間重合した後、生成物を実施
例工と同様の操作により加水分解、分級、充填し評価し
た。

実施例１と同様の評価を行った結果、耐圧性については
８０ｋｇ／　ｃｆｆｌまで圧力損失は流速と比例した。

膨潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸
緩衝液から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えた場合、カ
ラム圧力が２０ｋｇ／　ｃｆｆｌ上昇した。このように
実施例１の充填剤より耐圧性および耐膨潤性は劣ること
が明らかである。また、充填剤を硝酸８Ｍ溶液で処理し
て、上記の方法にしたがって被覆層の平均厚さを測定し
たところ、カルボキシル基は充填剤粒子内にも一様に存
在していた。さらに実施例１と同様にヒト血液および種
々のタンパク質の分離を行った。その結果を第５図およ
び第６図に示す。

第１図および第２図に比較すると明らかに分離能が劣っ
ていることがわかる。

比較例２ 疎水性架橋重合体粒子として積木化学工業■製ポリスチ
レン系ゲルＨ５Ｇ−５０２００ｇを用い、また加水分解
性の基を有する単量体としてアクリル酸メチル３００ｇ
を用いて実施例１と同様に操作して充填剤を調製し、そ
の評価を行った。

その結果、耐圧性については１５０ｋｇ／　ｃｆｆｌま
で圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験を行ったとこ
ろ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭの
リン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力が２５ｋｇ／Ｃ
ボ上昇した。これは後述の如く、被覆層が厚くなったた
めに耐膨潤性が劣化したものと思われる。

滴定によって充填剤表面のイオン交換能を測定したとこ
ろ１．２ｍｅｑ／ｇであった。また、充填剤を硝酸！Ｉ
溶液で処理して、上記の方法にしたがって被覆層の平均
厚さを測定したところ、約４００人であった。しかし被
覆層が厚く細孔が殆ど塞がれていた。

実施例１と同様にタンパク質の分離を行った。

その結果得られたクロマトグラムを第７図に示す。

第２図および第４図に比べ保持力が弱くなっているが、
これは上述のように細孔が塞がれたため、表面積が減少
したことによる。

比較例３ 疎水性架橋重合体粒子として積木化学工業■製ポリスチ
レン系ゲルＨ５Ｇ−５０２００ｇを用い、また加水分解
性の基を有する単量体としてアクリル酸メチルＬｏｇを
用いて実施例１と同様に操作して充填剤を調製し、その
評価を行った。

その結果、耐圧性については１５０　ｋｇ／　ｃＪまで
圧力損失と流速が比例した。膨潤性試験を行ったところ
、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリ
ン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められ
なかった。滴定によって充填剤表面のイオン交換能を測
定したところ０．１ｍｅｑ／ｇであった。

また、充填剤を硝酸銀溶液で処理して、上記の方法にし
たがって被覆層の平均厚さを測定したところ、約８人で
あった。また充填剤表面の一部に、被覆されてない箇所
があった。

実施例１と同様にタンパク質の分離を行った。

その結果得られたクロマトグラムを第８図に示す。

第２図および第４図と溶出順が異なっているが、これは
被覆が不十分のため、疎水性相互作用により分離が行わ
れていることによると思われる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、耐圧性に優れ、かつ膨潤
および収縮が少なく、タンパク質の非特異的吸着がない
水系の液体クロマトグラフィー用充填剤が得られる。こ
のような充填剤は、弱カチオン交換クロマトグラフィー
用充填剤として各種親水性物質の単離もしくは分析に広
範囲に利用され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図および第５図は、それぞれ実施例１、実
施例２および比較例１で得られた充填剤を充填したカラ
ムを用いて血液の分析を行った時に得られたクロマトグ
ラムを示す。 第２図、第４図および第６〜８図は、それぞれ実施例１
、実施例２及び比較例１〜３で得られた充填剤を充填し
たカラムを用いて種々のタンパク質の分離を行った時に
得られたクロマトグラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、加水分解反応
   によりカルボキシル基を生成し得る官能基を有する単量
   体を重合させて１０〜３００Åの厚さに被覆し、次いで
   被覆された重合体粒子の表面を加水分解させることによ
   り得られる、表面がカルボキシル基を持つ重合体で被覆
   された液体クロマトグラフィー用充填剤。 ２、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法であって
   、 重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を調製す
   る工程； 該疎水性架橋重合体粒子を分散させた分散液に、加水分
   解反応によりカルボキシル基を生成し得る官能基を有す
   る単量体を添加して溶解させ、該疎水性架橋重合体粒子
   の表面部分で該単量体を重合させ、該疎水性架橋重合体
   粒子の表面部分に、加水分解反応によりカルボキシル基
   を生成し得る官能基を有する重合体の層を形成する工程
   ；および該官能基を加水分解し、粒子表面にカルボキシ
   ル基を有する被覆重合体粒子を得る工程； を包含する液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。