JPH11180996A - リポ蛋白質の分離方法および定量方法 - Google Patents
リポ蛋白質の分離方法および定量方法Info
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- JPH11180996A JPH11180996A JP9346139A JP34613997A JPH11180996A JP H11180996 A JPH11180996 A JP H11180996A JP 9346139 A JP9346139 A JP 9346139A JP 34613997 A JP34613997 A JP 34613997A JP H11180996 A JPH11180996 A JP H11180996A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リポ蛋白質を短時間で高精度に分離する方法
を提供することを目的とする。 【解決手段】 多孔質粒子の表面を被覆する親水性高分
子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基を有する
イオン交換体に、リポ蛋白質含有液を接触させた後、溶
離液により溶離することを特徴とするリポ蛋白質の分離
方法。
を提供することを目的とする。 【解決手段】 多孔質粒子の表面を被覆する親水性高分
子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基を有する
イオン交換体に、リポ蛋白質含有液を接触させた後、溶
離液により溶離することを特徴とするリポ蛋白質の分離
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リポ蛋白質の分離
方法及び定量方法に関するものである。詳しくは、液体
クロマトグラフィーにより、高比重リポ蛋白質（ＨＤ
Ｌ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白
質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に
分離定量することができる分離方法並びにその定量方法
に関するものである。
方法及び定量方法に関するものである。詳しくは、液体
クロマトグラフィーにより、高比重リポ蛋白質（ＨＤ
Ｌ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白
質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に
分離定量することができる分離方法並びにその定量方法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血漿や血清中にはコレステロール、リン
脂質、中性脂肪（トリグリセリド）が含まれているが、
これらの脂質のうち、コレステロールの定量は動脈硬
化、肝疾患、糖尿病あるいは一時的な脂質代謝障害のス
クリーニング検査として利用されており、また、中性脂
肪の定量はコレステロールと共に脂質代謝異常の鑑別に
不可欠な検査となって来ている。これらの脂質は蛋白質
と会合してリポ蛋白質の状態で存在しているが、リポ蛋
白質は単一のものではなく、蛋白質の種類や脂質の含有
比率などにより高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リ
ポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）
等、いくつかの種類があり、これまでの研究により、そ
れぞれのリポ蛋白質の量と疾病との関係が明らかとなり
つつあることから、これらのリポ蛋白質を短時間にて高
精度に分離定量する方法の開発が望まれている。
脂質、中性脂肪（トリグリセリド）が含まれているが、
これらの脂質のうち、コレステロールの定量は動脈硬
化、肝疾患、糖尿病あるいは一時的な脂質代謝障害のス
クリーニング検査として利用されており、また、中性脂
肪の定量はコレステロールと共に脂質代謝異常の鑑別に
不可欠な検査となって来ている。これらの脂質は蛋白質
と会合してリポ蛋白質の状態で存在しているが、リポ蛋
白質は単一のものではなく、蛋白質の種類や脂質の含有
比率などにより高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リ
ポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）
等、いくつかの種類があり、これまでの研究により、そ
れぞれのリポ蛋白質の量と疾病との関係が明らかとなり
つつあることから、これらのリポ蛋白質を短時間にて高
精度に分離定量する方法の開発が望まれている。
【０００３】リポ蛋白質の分離には超遠心法が広く用い
られているが、この方法では処理に長時間を要するばか
りでなく、リポ蛋白質の性状がヒトとは異なるラットや
マウスのような動物種においては、その正確な分画が困
難である。高速液体クロマトグラフィーにより分離する
方法では、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ， Ｖｏｌ．５７０，ｐ３８２−３８９，１
９９１年に、分子サイズにより分画を行うサイズ排除ク
ロマトグラフィーによる分離方法が報告されているが、
精密な分離を行うには長時間を要し、その場合でも各リ
ポ蛋白質分画の間に混合が生じ、サイズ排除クロマトグ
ラフィー法では原理的に完全な分離は達成出来ないとい
う問題があった。
られているが、この方法では処理に長時間を要するばか
りでなく、リポ蛋白質の性状がヒトとは異なるラットや
マウスのような動物種においては、その正確な分画が困
難である。高速液体クロマトグラフィーにより分離する
方法では、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ， Ｖｏｌ．５７０，ｐ３８２−３８９，１
９９１年に、分子サイズにより分画を行うサイズ排除ク
ロマトグラフィーによる分離方法が報告されているが、
精密な分離を行うには長時間を要し、その場合でも各リ
ポ蛋白質分画の間に混合が生じ、サイズ排除クロマトグ
ラフィー法では原理的に完全な分離は達成出来ないとい
う問題があった。
【０００４】また、特開平７−８９９８４号公報には、
アニオン交換基を導入したグルコマンナンゲルを用いた
イオン交換クロマトグラフィーによる分離方法および定
量方法が開示されており、また特開平９−１２６２９号
公報には、水不溶性、親水性のマトリックスに陰イオン
交換基が導入された陰イオン交換体からなるリポ蛋白質
分離用樹脂が開示されている。しかし、これらの特許に
開示されている様な多孔質粒子の表面に直接官能基を導
入したイオン交換体を用いた場合、分離対象物質である
リポ蛋白質が非常に高い疎水性を有するために多孔質粒
子表面に存在する疎水性領域との相互作用が生じ、その
結果としてリポ蛋白質が不可逆吸着する、各リポ蛋白質
の分離が不充分となる、もしくは各リポ蛋白質の分離を
所望のものとするための分離時間が４５分〜１時間の長
時間になる等の問題があった。
アニオン交換基を導入したグルコマンナンゲルを用いた
イオン交換クロマトグラフィーによる分離方法および定
量方法が開示されており、また特開平９−１２６２９号
公報には、水不溶性、親水性のマトリックスに陰イオン
交換基が導入された陰イオン交換体からなるリポ蛋白質
分離用樹脂が開示されている。しかし、これらの特許に
開示されている様な多孔質粒子の表面に直接官能基を導
入したイオン交換体を用いた場合、分離対象物質である
リポ蛋白質が非常に高い疎水性を有するために多孔質粒
子表面に存在する疎水性領域との相互作用が生じ、その
結果としてリポ蛋白質が不可逆吸着する、各リポ蛋白質
の分離が不充分となる、もしくは各リポ蛋白質の分離を
所望のものとするための分離時間が４５分〜１時間の長
時間になる等の問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のごと
き問題を解決するため、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、
低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（Ｖ
ＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に分離、
定量する方法を提供することを目的とするものである。
き問題を解決するため、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、
低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（Ｖ
ＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に分離、
定量する方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、液体クロ
マトグラフィー法による分離方法につき種々検討した結
果、特定構造のイオン交換体を使用することにより、リ
ポ蛋白質を短時間で高精度に分離し得ることを見いだし
本発明に到達した。すなわち、本発明は、多孔質粒子の
表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分
子層のみに官能基を有するイオン交換体に、リポ蛋白質
含有液を接触させた後、溶離液により溶離することを特
徴とするリポ蛋白質の分離方法に存する。
マトグラフィー法による分離方法につき種々検討した結
果、特定構造のイオン交換体を使用することにより、リ
ポ蛋白質を短時間で高精度に分離し得ることを見いだし
本発明に到達した。すなわち、本発明は、多孔質粒子の
表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分
子層のみに官能基を有するイオン交換体に、リポ蛋白質
含有液を接触させた後、溶離液により溶離することを特
徴とするリポ蛋白質の分離方法に存する。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明に用いられるイオン交換体は、多孔質粒子の
表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分
子層のみに官能基を有するものである。例えば特開平１
−３１０７４４号公報に開示される分離材料のうち、イ
オン交換基を有するポリマーを用いたもの、特開平３−
１７９２５８号公報に開示される疎水性架橋重合体粒子
の表面がカルボキシル基を持つ重合体で被覆された液体
クロマトグラフィー充填剤、特開平３−１７９２５９号
公報に開示される疎水性架橋重合体粒子の表面が水酸基
を持つ重合体で被覆された液体クロマトグラフィー充填
剤に対し、公知の方法でイオン交換基を導入したもの、
特開平７−０８８３６６号公報に開示される分離剤のう
ち、イオン交換基を有する重合性ビニル単量体を用いた
もの及びイオン交換基を後反応により導入可能である重
合性ビニル単量体を用い、公知の方法でイオン交換基を
導入したもの、および特開平７−１７１３８９号公報に
開示される分離剤のうち、イオン交換基を有する重合性
ビニル単量体を用いたもの及びイオン交換基を後反応に
より導入可能である重合性ビニル単量体を用い、公知の
方法でイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。
る。本発明に用いられるイオン交換体は、多孔質粒子の
表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分
子層のみに官能基を有するものである。例えば特開平１
−３１０７４４号公報に開示される分離材料のうち、イ
オン交換基を有するポリマーを用いたもの、特開平３−
１７９２５８号公報に開示される疎水性架橋重合体粒子
の表面がカルボキシル基を持つ重合体で被覆された液体
クロマトグラフィー充填剤、特開平３−１７９２５９号
公報に開示される疎水性架橋重合体粒子の表面が水酸基
を持つ重合体で被覆された液体クロマトグラフィー充填
剤に対し、公知の方法でイオン交換基を導入したもの、
特開平７−０８８３６６号公報に開示される分離剤のう
ち、イオン交換基を有する重合性ビニル単量体を用いた
もの及びイオン交換基を後反応により導入可能である重
合性ビニル単量体を用い、公知の方法でイオン交換基を
導入したもの、および特開平７−１７１３８９号公報に
開示される分離剤のうち、イオン交換基を有する重合性
ビニル単量体を用いたもの及びイオン交換基を後反応に
より導入可能である重合性ビニル単量体を用い、公知の
方法でイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。
【０００８】本発明のイオン交換体を構成する多孔質粒
子としては親水性、疎水性の何れも用いうるが、リポ蛋
白質はその疎水性が非常に高いために、多孔質粒子表面
を被覆する親水性高分子層の種類および層の厚みによっ
ては該多孔質粒子の疎水性の影響を受けうることから、
多孔質粒子自体が親水性であることが好ましい。親水性
の多孔質粒子としては、具体的には、デキストラン、セ
ルロース、キトサン、グルコマンナン等の天然高分子系
多孔質粒子や（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）ア
クリルアミド等の親水性多孔質架橋共重合体粒子等が挙
げられるが、特に短時間での分析を行う場合には高流速
での通液が必要なことから、機械的強度に優れた（メ
タ）アクリル酸エステル親水性多孔質架橋共重合体粒子
が好適に用いられる。
子としては親水性、疎水性の何れも用いうるが、リポ蛋
白質はその疎水性が非常に高いために、多孔質粒子表面
を被覆する親水性高分子層の種類および層の厚みによっ
ては該多孔質粒子の疎水性の影響を受けうることから、
多孔質粒子自体が親水性であることが好ましい。親水性
の多孔質粒子としては、具体的には、デキストラン、セ
ルロース、キトサン、グルコマンナン等の天然高分子系
多孔質粒子や（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）ア
クリルアミド等の親水性多孔質架橋共重合体粒子等が挙
げられるが、特に短時間での分析を行う場合には高流速
での通液が必要なことから、機械的強度に優れた（メ
タ）アクリル酸エステル親水性多孔質架橋共重合体粒子
が好適に用いられる。
【０００９】かかる多孔質粒子の表面に親水性高分子層
を被覆する手段としては、例えば、上述の公報に記載の
各方法が採用される。本発明においてイオン交換体を液
体クロマトグラフィー法にて用いる場合には、その粒径
は１〜２０μｍの範囲にあることが好ましく、更にはそ
の粒径分布が狭いことが好ましい。また、本発明に用い
られるイオン交換体は陰イオン交換体、陽イオン交換体
の何れも用いうるが、ジメチルアミノエチル基、ジエチ
ルアミノエチル基をはじめとする各種アミノ基、各種４
級アンモニウム基等を有する陰イオン交換体が特に好ま
しく用いられる。導入される陰イオン交換基の量として
は、乾燥樹脂重量１ｇあたり０．１〜１．５ミリ当量、
好ましくは０．２〜１．２ミリ当量である。なお、陽イ
オン交換体を得るための官能基としては、カルボキシル
基、スルホン酸基等が挙げられる。
を被覆する手段としては、例えば、上述の公報に記載の
各方法が採用される。本発明においてイオン交換体を液
体クロマトグラフィー法にて用いる場合には、その粒径
は１〜２０μｍの範囲にあることが好ましく、更にはそ
の粒径分布が狭いことが好ましい。また、本発明に用い
られるイオン交換体は陰イオン交換体、陽イオン交換体
の何れも用いうるが、ジメチルアミノエチル基、ジエチ
ルアミノエチル基をはじめとする各種アミノ基、各種４
級アンモニウム基等を有する陰イオン交換体が特に好ま
しく用いられる。導入される陰イオン交換基の量として
は、乾燥樹脂重量１ｇあたり０．１〜１．５ミリ当量、
好ましくは０．２〜１．２ミリ当量である。なお、陽イ
オン交換体を得るための官能基としては、カルボキシル
基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００１０】また、分離された各リポ蛋白質の定量方法
については、該リポ蛋白質中のコレステロールエステル
を酵素反応を用いた蛍光検出法にて検出し、既知量のコ
レステロールを注入した場合の蛍光物質ピークの面積と
の検量線を用いることにより、該リポ蛋白質由来の総コ
レステロール量として求められる。
については、該リポ蛋白質中のコレステロールエステル
を酵素反応を用いた蛍光検出法にて検出し、既知量のコ
レステロールを注入した場合の蛍光物質ピークの面積と
の検量線を用いることにより、該リポ蛋白質由来の総コ
レステロール量として求められる。
【００１１】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例に限定されるものではない。 実施例１ 親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共
重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層
を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陰イオ
ン交換基であるジエチルアミノエチル基を有するイオン
交換体が充填された高速液体クロマトグラフィー用充填
カラム「ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ」（カラムサイズ：内
径４．６ｍｍ×長さ５０ｍｍ、粒子径：５μｍ、交換容
量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱化学株式会社製）を用い、図
１に示す分離システムにより各種動物のリポ蛋白質を分
離した。
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例に限定されるものではない。 実施例１ 親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共
重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層
を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陰イオ
ン交換基であるジエチルアミノエチル基を有するイオン
交換体が充填された高速液体クロマトグラフィー用充填
カラム「ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ」（カラムサイズ：内
径４．６ｍｍ×長さ５０ｍｍ、粒子径：５μｍ、交換容
量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱化学株式会社製）を用い、図
１に示す分離システムにより各種動物のリポ蛋白質を分
離した。
【００１２】図１は、本実施例で使用したリポ蛋白質分
離試験法のシステムを示す概略図である。図１におい
て、ポンプＡにより貯槽２より溶離液Ａとして１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を、またポンプＢにより貯槽３より溶離液Ｂと
して１ｍＭのＥＤＴＡを含む５００ｍＭのＮａＣｌ水溶
液を送液し、ミキサーにて混合することにより流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎでのステップワイズグラジエント送液を
行った。ミキサーにより混合された溶離液にオートサン
プラー１を介して試料が注入さりたのち、恒温槽にて２
５℃に保たれた充填カラム４に送液され、液体クロマト
グラフィー法により分離される。充填カラム４からの溶
離液に、貯槽６の酵素溶液（コレステロールオキシダー
ゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ７Ｕ／ｍｌ、コレ
ステロールエステルヒドロラーゼ０．７Ｕ／ｍｌ、ホモ
バニリン酸５００ｍｇ／ｍｌおよび０．２％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００（界面活性剤）を含む２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から成り４℃に冷却され
ているもの）がポンプＣから流速０．５ｍｌ／ｍｉｎに
て送液され、溶離液とミキサーにより混合された後、恒
温槽にて４５℃に保たれた内径０．５ｍｍ×長さ１５ｍ
の反応コイル５を通過する間に、充填カラムにて分離さ
れた各リポ蛋白質中のコレステロールが酵素溶液中のコ
レステロールエステルヒドロラーゼ、次にコレステロー
ルオキシダーゼと反応することにより溶離液中に過酸化
水素が生成する。生成した過酸化水素は酵素溶液中のペ
ルオキシダーゼの存在下、酵素溶液中のホモバニリン酸
と反応する。
離試験法のシステムを示す概略図である。図１におい
て、ポンプＡにより貯槽２より溶離液Ａとして１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を、またポンプＢにより貯槽３より溶離液Ｂと
して１ｍＭのＥＤＴＡを含む５００ｍＭのＮａＣｌ水溶
液を送液し、ミキサーにて混合することにより流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎでのステップワイズグラジエント送液を
行った。ミキサーにより混合された溶離液にオートサン
プラー１を介して試料が注入さりたのち、恒温槽にて２
５℃に保たれた充填カラム４に送液され、液体クロマト
グラフィー法により分離される。充填カラム４からの溶
離液に、貯槽６の酵素溶液（コレステロールオキシダー
ゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ７Ｕ／ｍｌ、コレ
ステロールエステルヒドロラーゼ０．７Ｕ／ｍｌ、ホモ
バニリン酸５００ｍｇ／ｍｌおよび０．２％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００（界面活性剤）を含む２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から成り４℃に冷却され
ているもの）がポンプＣから流速０．５ｍｌ／ｍｉｎに
て送液され、溶離液とミキサーにより混合された後、恒
温槽にて４５℃に保たれた内径０．５ｍｍ×長さ１５ｍ
の反応コイル５を通過する間に、充填カラムにて分離さ
れた各リポ蛋白質中のコレステロールが酵素溶液中のコ
レステロールエステルヒドロラーゼ、次にコレステロー
ルオキシダーゼと反応することにより溶離液中に過酸化
水素が生成する。生成した過酸化水素は酵素溶液中のペ
ルオキシダーゼの存在下、酵素溶液中のホモバニリン酸
と反応する。
【００１３】溶離液は次いでポンプＤから流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎにて送液される０．１ＮのＮａＯＨ水溶液と
ミキサーにより混合され、内径０．５ｍｍ×長さ５ｍの
反応コイル８を通過する間に、過酸化水素とホモバニリ
ン酸との反応化合物は蛍光物質に変化する。この蛍光物
質を蛍光検出器９にて励起波長３２５ｎｍ、発光波長４
２０ｎｍの条件下で検出する。以下、図２〜図５に各種
試料を分離した結果を示す。
ｌ／ｍｉｎにて送液される０．１ＮのＮａＯＨ水溶液と
ミキサーにより混合され、内径０．５ｍｍ×長さ５ｍの
反応コイル８を通過する間に、過酸化水素とホモバニリ
ン酸との反応化合物は蛍光物質に変化する。この蛍光物
質を蛍光検出器９にて励起波長３２５ｎｍ、発光波長４
２０ｎｍの条件下で検出する。以下、図２〜図５に各種
試料を分離した結果を示す。
【００１４】１）図２；試料としてヒト血漿２０μｌを
注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグ
ラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬ
が分析時間２０分以内で完全分離されていることが分か
る。 ２）図３；試料として日本白色家兎血漿２０μｌを注入
した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジ
エント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分
析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。 ３）図４；試料としてＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ血漿２０μ
ｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイ
ズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬ
ＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが
分かる。 ４）図５；試料としてｄｄｙ ｍｏｕｓｅ血漿２０μｌ
を注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズ
グラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤ
Ｌが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分
かる。 以上より、本分離方法にて多種の動物血漿中のリポ蛋白
質の分離定量が可能であることが分かる。
注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグ
ラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬ
が分析時間２０分以内で完全分離されていることが分か
る。 ２）図３；試料として日本白色家兎血漿２０μｌを注入
した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジ
エント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分
析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。 ３）図４；試料としてＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ血漿２０μ
ｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイ
ズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬ
ＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが
分かる。 ４）図５；試料としてｄｄｙ ｍｏｕｓｅ血漿２０μｌ
を注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズ
グラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤ
Ｌが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分
かる。 以上より、本分離方法にて多種の動物血漿中のリポ蛋白
質の分離定量が可能であることが分かる。
【００１５】比較例１ メタアクリル酸エステル架橋共重合体からなる親水性多
孔質粒子の表面に、陰イオン交換基としてジエチルアミ
ノエチル基を直接導入して成るイオン交換体（特開昭５
８−２４３５４号公報に開示される方法にて得られたイ
オン交換体）が充填された高速液体クロマトグラフィー
用充填カラム（カラムサイズ：内径７．５ｍｍ×長さ７
５ｍｍ）を用い、図１と同様のシステムにてリポ蛋白質
分離試験を実施した。試料として日本白色家兎血漿１０
μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワ
イズグラジエント条件を図６に示す。多孔質粒子の表面
に親水性高分子層の無いイオン交換体ではＨＤＬ，ＬＤ
ＬおよびＶＬＤＬの分離が達成されないことが分かる。
孔質粒子の表面に、陰イオン交換基としてジエチルアミ
ノエチル基を直接導入して成るイオン交換体（特開昭５
８−２４３５４号公報に開示される方法にて得られたイ
オン交換体）が充填された高速液体クロマトグラフィー
用充填カラム（カラムサイズ：内径７．５ｍｍ×長さ７
５ｍｍ）を用い、図１と同様のシステムにてリポ蛋白質
分離試験を実施した。試料として日本白色家兎血漿１０
μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワ
イズグラジエント条件を図６に示す。多孔質粒子の表面
に親水性高分子層の無いイオン交換体ではＨＤＬ，ＬＤ
ＬおよびＶＬＤＬの分離が達成されないことが分かる。
【００１６】
【発明の効果】本発明方法により、特定の構造を有する
イオン交換体を用いる液体クロマトグラフィーにより、
血漿や血清中のリポ蛋白質を短時間にて極めて精度良く
分離することができる。
イオン交換体を用いる液体クロマトグラフィーにより、
血漿や血清中のリポ蛋白質を短時間にて極めて精度良く
分離することができる。
【図１】実施例１におけるリポ蛋白質分離試験法のシス
テムを示す概略図
テムを示す概略図
【図２】実施例１で得られたヒト血漿中のリポ蛋白質の
分離結果を示すクロマトグラム
分離結果を示すクロマトグラム
【図３】実施例１で得られた日本白色家兎血漿中のリポ
蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図４】実施例１で得られたＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ血漿
中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図５】実施例１で得られたｄｄｙ ｍｏｕｓｅ血漿中
のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図６】比較例１で得られた日本白色家兎血漿中のリポ
蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
１ オートサンプラー ２ 溶離液Ａ貯槽 ３ 溶離液Ｂ貯槽 ４ 充填カラム ５ 反応コイルＡ ６ 酵素溶液貯槽 ７ ＮａＯＨ水溶液貯槽 ８ 反応コイルＢ ９ 蛍光検出器 １０ 記録計
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 足立 正 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 多孔質粒子の表面を被覆する親水性高分
子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基を有する
イオン交換体に、リポ蛋白質含有液を接触させた後、溶
離液により溶離することを特徴とするリポ蛋白質の分離
方法。 - 【請求項２】 多孔質粒子が親水性多孔質粒子であるこ
とを特徴とする請求項１記載のリポ蛋白質の分離方法。 - 【請求項３】 多孔質粒子が（メタ）アクリル酸エステ
ル架橋共重合体からなる親水性多孔質粒子であることを
特徴とする請求項１又は２に記載のリポ蛋白質の分離方
法。 - 【請求項４】 官能基が陰イオン交換基であることを特
徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のリポ蛋白質
の分離方法。 - 【請求項５】 請求項１乃至４の何れかに記載の方法に
より分離されたリポ蛋白質を酵素と反応させた後、蛍光
検出法にて定量することを特徴とするリポ蛋白質の定量
方法。
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| JP (1) | JP4179653B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US7022744B2 (en) | 2002-04-11 | 2006-04-04 | Mitsubishi Chemical Corporation | Ion exchanger for lipoproteins separation and lipoproteins separation method using the same |
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1997
- 1997-12-16 JP JP34613997A patent/JP4179653B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4179653B2 (ja) | 2008-11-12 |
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