JPH03201998A - コレステロールの超微量定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は生体成分内のコレステロールの超微量定量法に
関する。更に詳細には本発明は医学、医療分野、特に生
物化学、細胞化学、臨床検査に利用されるものであり、
血球細胞やその他の生体成分のあらゆる細胞・組織中の
僅かなコレステロールの定量法に関する。更に本発明に
よる定量法により糖尿病薬、あるいは高脂血症改善薬な
どの医薬品の細胞や組織内での薬理学的作用や効果の検
討に応用でき、食品中のコレステロールの定量にも使用
できる。

［従来技術］ 従来より酵素を用いたコレステロールの定量法としては
、ＴＩＩ＃あるいは結合型コレステロールを測定する際
、コレステロールオキシダーゼを単独あるいはコレステ
ロールエステラーゼとともに使用する方法が広く使用さ
れていた。しかしコレステロールオキシダーゼを用いる
方法は、生成した過酸化水素を定量するためにさらにパ
ーオキシダーゼ等を必要とし、操作が煩雑であるばかり
か、試料中の測定の妨害物質、例えばビリルビンやアス
コルビン酸等のよって誤差を生じ易いなどの欠点を有し
ていた。またコレステロールデヒドロゲナーゼを用いて
上記のような欠点を解決する方法が報告されている（特
開昭５８−８９２００）。しかしながら、これらの方法
は測定感度の点で未だ満足できるものではなかった。こ
の点を解決する高感度の総コレステロールの測定法とし
てコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシ
ダーゼを使用して、コレステロールエステルおよび′ｆ
１離型コレステロールを分解し、生成する過酸化水素で
パーオキシダーゼの存在下でＰ−ハイドロキシフェニー
ル酢酸を酸化させ、このときに生じる蛍光を測定する方
法が報告されている［Ｊ、ＬｉｐｉｄＲｅｓ　、　　第
９巻　１２６Ｂ−１２７０（１９７８年）］。しかしな
がら、この方法では生じる蛍光強度と過酸化水素との間
に種々の干渉作用が生じ、測定を阻害することが以前か
ら指摘されている。特に試料として血球細胞や組繊細胞
並びに医薬品、食品等を使用した場合にはカタラーゼや
その他の酸化還元物質の影響が著しい。このように、コ
レステロールエステルや′ｔ１離型コレステロールに特
異性があるコレステロールエステラーゼやコレステロー
ルオキシダーゼを使用してもこの反応以後の測定に問題
があり、測定精度や測定感度を満足できるものはなく、
より高感度でかつ高精度なコレステロールの超微量測定
法の開発が望まれていた。

［発明が解決しようとする課題］ 生体成分中のコレステロールの測定は動脈硬化症の診断
的指標としての検査法として血清脂質（総コレステロー
ル、中性脂肪など）濃度の測定、血清アポリボ蛋白質濃
度の測定ならびに血清リポ蛋白質の電気泳動法による分
析など、主として血清を試料として用いられるものであ
り、比較的高い濃度のコレステロールを対象としたもの
であり、その結果から得られる情報は動脈硬化症の診断
学的情報としてその危険因子の存在の指標としては評価
されるものである。しかし、直接的な動脈硬化病巣の存
在の有無や動脈硬化によって発現する心筋梗塞や脳梗塞
の存在を診断できる方法ではない。これらの診断には心
電図所見や臨床症状によって診断されるものである。

動脈硬化病巣の所期段階における特徴的な所見は脂肪滴
を胞体内に蓄積した細胞群の血管内膜下への出現であり
、これらの細胞は泡沫細胞と呼ばれている。その形成機
序は完全には解明されてはいないが、少なくとも動脈硬
化の所期病変においては血液中の単球／マクロファージ
は血管内皮細胞や平滑筋細胞とともに動脈硬化の発症・
進展に重要な役割を担っているものと認識されている。

その脂質蓄積機構の詳細な解明やそれらの細胞内薄ｒｔ
ｆ１４度の測定は今日の動脈硬化研究における重要なテ
ーマの１つである。

このように血管内膜下での動脈硬化度をよく反映すると
考えられる単球／マクロファージ中の総コレステロール
濃度を定量することによって動脈硬化の所期段階を的確
に把握し、心臓病などを初めとする動脈硬化性疾患を早
期に発見し予防に役立てる必要がある。

単球／マクロファージ内の総コレステロールは従来のコ
レステロール測定の試料に使用されていた血清内の総コ
レステロールと異なり、その含量は非常に僅かなもので
ある。よって、従来の方法では測定は不可能であった。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明者らは、
上記のような現状を考慮し、精度良くかつ簡便に細胞中
とくに血中単球中の総コレステロール濃度を蛍光法で測
定する方法を検討し、本発明を完成した。つまり、本発
明によれば、従来の方法では測定が不可能であったよう
な超微量のコレステロール濃度が測定可能となった。

本発明のコレステロールの超微量定量法は試料にＮＡＤ
の存在下でコレステロールエステラーゼおよびコレステ
ロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨ
の蛍光を測定する方法である。以下、詳細に本発明を説
明する。

本発明の測定対象としては血中単球中などの微量なコレ
ステロールであるが、もちろんその他に由来するコレス
テロールであっても測定できる。

試料の総コレステロールを測定するためには、コレステ
ロールエステルを遊離のコレステロールに分解するため
にコレステロールエステラーゼが使用されるがこれは臨
床試薬として使用可能な程度に精製された酵素であれば
いずれでもよい。例えばＣＨＥ　ｒアマノ」　（天野製
薬製）が挙げられる。遊離のコレステロールのみを測定
の対象とするならばコレステロールエステラーゼを使用
しないで測定することができる。また、ＮＡＤは上記と
同程度に精製されていれば使用できる。コレステロール
デヒドロゲナーゼは市販のものが使用できる。例えばＣ
ＨＤＨｒアマノ」　（天野製薬製）が挙げられる。反応
条件は、使用する酵素の性質によって変化するが、温度
は２５〜４０°Ｃが好ましく、ｐＨは５〜８が好ましい
。酵素の反応時間は５〜３０分が好ましい。緩衝液には
界面活性剤を含有してもよい。

酵素反応によって遊離したＮＡＤＨは蛍光光度計を用い
て定量する。そのときの測定条件としてはＥＸ　３４０
ｎｍ、　ｌＥｍ　４５０ｎｍである。

次に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。

失鵠璽　　　ヒト血中単球中の総コレステロールの測定 （１）単球の分離 ＥＤＴＡ加血液１０容に６％のデキストランＴを含有す
る生理食塩液１容を加え、１５〜３０分間室温に放置す
る。上清をＮｙｃｏｄｅｎｚ−Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ液３
　ｍｌに重層する。６００Ｘｇで１５分間遠心分離後、
中間層の上部２／３を採取し、生理食塩液で洗浄し、細
胞数を計測して５　ＸＩＯ’　ｃｅｌｌｓ／ｍｊ！に調
製する。

（２）　　ｇ＆薬 試薬Ａ　　０．２Ｍ　・ｐＨ７，５グツド緩衝液（Ｔｒ
ｉｃｉｎｅＮａＯＨ：　０．４％トリトンＸ−１００含
有）にＣＨＥ　ｒアマノ」　（天野製薬製）を１単位／
ｄおよびＮＡＤを１７ｍＭ含有する。

試薬Ｂ　　Ｏ，２Ｍ　・ｐｌ＋７．５グツド緩衝液（Ｔ
ｒｉｃｉｎｅＮａＯＨ：　０．４％トリトンＸ−１００
含有）にＣＨＤＨｒアマノ」　（天野製薬製）を９単位
／　ｒｎｌ含有する。

（３）測定法 （１）で調製した液を超音波処理して細胞を破壊し試料
）容液とし、この液５０μｌに（２）の試薬Ａを３００
μ２加え、３７°Ｃで１０分間放置する。その後試薬Ｂ
を加え、３７°ＣでＣ０ＢＡＳ　ＦＡＲ八（ロツシュ社
製）自動分析計を用いてＥｘ　３４０ｒ＋ｍ、　Ｅｍ　
４５０ｎ＋ｎの条件で、タイムコース及び測定の直線性
、および同時再現性等の精度を測定した。

（以下余白） 第　　１　　表　　（ｎ・１０） 第２表 変動を示す。尚、表中の測定値の単位はμｇ　／　５　
Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓである。

［発明の効果１ 本発明により、従来では測定が困難であった血中単球中
に含まれている超微量のコレステロールが精度良く測定
可能となった。

【図面の簡単な説明】 第１図は実施例におけ多タイムコースの結果を示すもの
であり、図中でＡおよびＢは各種濃度のコレステロール
標準試薬を用いた結果を示し、ＣおよびＤは試料の測定
結果を示す。第２図は実施例の反応直線性を示すもので
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）蛍光法によるコレステロールの定量法において、コ
   レステロールデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とす
   るコレステロールの超微量定量法。