JPH0756489B2 - ビタミンｂ▲下１２▼アッセイにおける血清の前処理 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 序 論 技術分野 本発明は、血清試料においてビタミンB₁₂を利用可能に
し、そして次なる血清ビタミンB₁₂濃度の測定のために
内在性の血清結合タンパク質からビタミンB₁₂を遊離せ
しめる方法に関する。

背 景 血清中のビタミンB₁₂の濃度は、ビタミンB₁₂欠乏症の最
も日常の尺度である。しかしながら、血液中のビタミン
B₁₂の大部分はタンパク質と結合している。ビタミンB₁₂
は循環系に吸収されると、血漿β−グロブリンであるト
ランスコバラミンIIと結合する。別の２つのトランスコ
バラミン（ＩおよびIII）も血漿中に存在し、これもビ
タミンB₁₂を結合する。血清試料中に存在するビタミンB
₁₂の量を正確に測定するためには、試料を前処理して種
々の血清結合タンパク質からビタミンB₁₂を遊離させる
ことが必要である。

現存のビタミンB₁₂結合アッセイは、血清試料を前処理
して血清結合タンパク質からビタミンB₁₂を遊離させる
ために種々の方法を用いている。これらの方法には、内
在性の血清結合タンパク質を破壊するのに十分な時間の
間試料を100℃にて加熱する方法（“煮沸”法）および
試料をpH12−13で水酸化ナトリウムで処理するいわゆる
“非煮沸”法が含まれる。煮沸法は、まず他の試薬の添
加前に試料を加熱し次いでそれを室温に戻すことが必要
であるので作業の流れを中断しそして自動化に向ない。
非煮沸法は、存在するかもしれない抗−内因子抗体を完
全には変性させない。従って、内在性の血清結合タンパ
ンク質からビタミンB₁₂を迅速に且つ能率的に遊離させ
得ること並びにアッセイ方法の結果に影響するかもしれ
ない他の因子を不活性化し得ることに実質的な関心が存
在する。

関連文献 有機溶媒を含む遊離剤を使って内在性の血清結合タンパ
ク質からビタミンB₁₂を遊離させる方法は、Mansbachお
よびMcCarterに1981年11月17日に発行された米国特許N
o.4,300,907において開示されている。熱と尿素などの
変性剤との組合せを使ってビタミンB₁₂結合タンパク質
を変性させる方法は、CabelliおよびGromanに1982年６
月１日に発行された米国特許No.4,332,786において開示
されている。GutchoおよびMansbach,Clin.Chem.（197
4）23:1609−1614は、内在性ビタミンB₁₂バインダーを
破壊せしめ、そして還元剤の存在下でアルカリ性のpHに
て加熱することにより、結合したビタミンB₁₂を遊離せ
しめる方法を開示している。

発明の要約 血清試料をペルオキシ酸と共にインキュベートし、次に
残存のペルオキシ酸を還元剤で還元することにより、次
なる血清ビタミンB₁₂濃度の測定のために血清試料を前
処理して内在性の血清結合タンパク質からビタミンB₁₂
を遊離せしめる方法が提供される。

特定の態様の記載 本発明によれば、次なる血清ビタミンB₁₂濃度の測定の
ために内在性の血清結合タンパンク質からビタミンB₁₂
を利用可能にする方法が提供される。

本発明の実施においては、血清試料をペルオキシ酸、例
えばペルオキシモノスルフェートまたはペルオキシトリ
フルオロ酢酸（塩、特にアルカリ金属塩を包含する）で
前処理することによりビタミンB₁₂を利用可能にする。
ペルオキシモノ硫酸カリウムは、E.I.duPont de Nemour
s ＆ Companyから商標“Oxone ”のもとに入手可能で
ある。ペルオキシトリフルオロ酢酸は、過酸化水素とト
リフルオロ酢酸との混合物から調整することができる。
試料の処理後、幾らかの還元されていないペルオキシ酸
は、次なるアッセイ法を妨害しないであろう還元剤を使
って破壊することができる。アッセイ系のための試薬
は、前処理された試料に直接添加することができる。

試料はどんな血清試料でもよい。試料の溶血また脂血症
は、前処理または次なるビタミンB₁₂についてのアッセ
イのどちらにも影響しない。

この前処理プロトコールにおいて使用するために、ペル
オキシ酸は、非妨害性緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液
（pH7.0）またはクエン酸塩緩衝液（pH8）中に希釈され
る。試料中のペルオキシ酸の最終濃度は、通常約10mMよ
り大きく、便利には約25mM〜100mMであり、インキュベ
ーション混合物に添加される該溶液の濃度は、通常少な
くとも20mMであり、好ましくは50−100mMである。試料
はペルオキシ酸と共に通常は室温にて少なくとも５分
間、好ましくは少なくとも10分間インキュベートされる
が、60分以上のインキュベーション時間でも結果に不利
な影響を与えない。

もし試料中に存在するビタミンB₁₂を検出するために特
異的結合タンパク質を用いるアッセイ系において試料を
使用するつもりであれば、特異的結合タンパク質の添加
の前に幾らか残っている還元されてないペルオキシ酸を
還元することが望ましい。アッセイ系が例えばモノクロ
ーナル抗−B₁₂抗体を利用するのであれば、還元剤は非
−亜硫酸塩還元剤、例えばメチオニン、亜リン酸ナトリ
ウム、亜ヒ酸ナトリウム、ジチオトレイトールまたはβ
−メルカプトエタノールであることができる。使用する
アッセイ系が内因子のようなビタミンB₁₂結合タンパク
質を利用するのであれば、還元剤は亜硫酸塩ベースの還
元剤、例えば亜硫酸ナトリウム、異性重亜硫酸ナトリウ
ムもしくはヒドロ亜硫酸ナトリウム、または非−亜硫酸
塩還元剤、例えば前記のようなもの、であることができ
る。ビタミンB₁₂の結合は、還元剤の存否に関係しな
い。

還元剤は、還元剤を安定化するための常用の添加剤を含
む適当な非妨害性緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液（pH7.
0）中に調製される。還元剤は酸化された試料に室温で
添加することができ、試料中の還元剤の最終濃度は通常
5mMより大きく、好ましくは10mMより大きい。

酸化された試料と還元剤とのインキュベーション時間は
重要ではない。試料を即座にビタミンB₁₂アッセイにお
いて使用するのであれば、競合的または連続的プロトコ
ールのためのラベル化されたビタミンB₁₂または結合タ
ンパク質それぞれを還元剤と組み合わせることができ
る。

この前処理プロトコールは、血清中のビタミンB₁₂の測
定のための種々のラジオアッセイまたは非同位体法と共
に用いることができる。これらの方法には、ビタミンB
₁₂に対して特異的な結合タンパク質、例えばモノクロー
ナル抗体または内因子を、溶液中でまたは固体支持体に
結合して、使用するアッセイプロトコールが含まれる。
前処理プロトコールは、好ましくは、ビタミンB₁₂に対
して特異的な結合タンパク質が固体支持体に結合してい
るような固相アッセイプロトコールと組み合わされる。
固体支持体は、臭化シアン−活性化セファロースのよう
なアガロースビース、またはAffiGelのようなアクリル
アミドゲルであることができる。固体支持体は、いずれ
かの常用手段により特異的結合タンパク質と接合され得
る。縮合方法の一般的概説については、例えば、Axen
ら、Nature（1967）214:1302−1304を参照のこと。この
前処理は、β−ガラクトシダーゼ断片の補完に基づく均
質ビタミンB₁₂アッセイと組み合わせることができ、こ
の場合ビタミンB₁₂は前記断片のうちの一方（酵素供与
体）と接触され、そしてB₁₂−酵素供与体接合体が内因
子と結合することにより補完がブロックされる。

前処理された試料および固相の結合タンパク質を用いる
アッセイを実施する上で、試料のビタミンB₁₂と結合タ
ンパク質との間で形成されるいずれの複合体でも、ビタ
ミンB₁₂に付けられているラベルにより検出することが
できる。トレーサー溶液は、試料への還元剤の添加と同
時にまたはそれに続いて試料に添加することができる。
トレーサー分子は様々な方法で共有結合的にラベル化さ
れる。該ラベルは例えば、酵素、例えばアルカリホスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼもしくはその断
片、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレ
アーゼ；放射性核種、例えば⁵⁷Co;化学発光または蛍光
化学物、例えばフルオレセインイソシアネート；または
検出可能なシグナルを提供する他のいずれかのラベルで
あることができる。

ラベル化されたビタミンB₁₂を含む試料は、次いで固相
の結合タンパク質と接触される。内因子が例えばセファ
ロースに結合しているならば、該セファロースは、例え
ば、BSAまたはゼラチンのようなタンパク質を含む100mM
のリン酸塩緩衝液（pH7.5）中のスラリー、好ましくは5
0％スラリーの形であることができる。次いで試料−ス
ラリーは、通常室温にて、B₁₂−内因子複合体を形成せ
しめるのに充分な時間の間インキュベートされる。固体
支持体がセファロースである時、セファロースビースの
沈澱を防ぐために、インキュベーション時間の間、イン
キュベーション混合物は振とうされるのが好ましい。イ
ンキュベーション時間は、16時間まで結果に不利な影響
を与えないが、通常は室温で最小限の60分である。

インキュベーションに続き、固体支持体の性質に応じ
て、結合した試料と結合しなかった試料とを遠心、洗浄
等により分離することができる。結合しなかったラベル
化ビタミンB₁₂を含む上清はデカンテーションされる。B
₁₂−結合タンパク質複合体を含む固体支持体または上清
のどちらかを分析して存在するラベルの量を決定するこ
とができる。検出の方法は、使用するラベルのタイプに
も所望する感度にも依存するであろう。ラベルが放射性
核種である場合、固体支持体または上清のどちらをカウ
ントして存在する放射能の量を決定することができる。
ラベルが酵素である場合、基質の添加の後で基質の消失
または反応生成物の出現を分光光度的に測定することが
できる。酵素が例えばウレアーゼである場合、クレゾー
ルレッドなどの指示薬色素を用いて、酵素基質の添加後
の試料中のpHの変化をモニターすることができる。

対照を使って試料中のビタミンB₁₂の濃度を定量するこ
ともできる。普通は、ビタミンB₁₂を全く含まない少な
くとも１つのバックグラウンド溶液、および既知量のビ
タミンB₁₂を含む少なくとも１つの血清対照標準溶液
を、未知の濃度のビタミンB₁₂を含む試料として等しく
処理する。バックグラウンド溶液中の検出可能なラベル
の量を対照標準溶液および未知試料中の検出可能なラベ
ル量から差し引く。次いで対照標準溶液および未知試料
について調製された値を関連づけて試料中に存在するビ
タミンB₁₂の量を決定する。

便利には、試薬類はしばしば、別々の容器の中に、ビタ
ミンB₁₂アッセイにおいて使用することになっている血
清試料のための前処理として使用するためのペルオキシ
酸もしくはその塩および還元剤を含んで成るキットにお
いて；並びに、該アッセイの実施に必要な追加の試薬と
一緒に、ペルオキシ酸もしくは塩および還元剤がラベル
化ビタミンB₁₂溶液、結合タンパク質または既知量のビ
タミンB₁₂を含んで成る対照標準試料のいずれか１つと
共に存在するようなビタミンB₁₂アッセイキットとして
用意される。便利には、試薬類は凍結乾燥された形で用
意されるだろう。

次の例は例示の目的で掲示され、限定の目的ではない。

実 験^１ １ 特に指示しない限り、全ての実施例において、⁵⁷Co
−ビタミンB₁₂についての血清試料中のおよその濃度は
0.22ng/ml（0.15〜0.25ng/mlの範囲）であり、異種ビタ
ミンB₁₂（即ち非ラベル化のもの）についてのおよその
濃度は0.45ng/mlであった。

例 １ 緩衝化されたペルオキシモノスルフェートによる血清か
らの⁵⁷Co−B₁₂の遊離 水、200mMリン酸ナトリウムもしくはカリウム（pH7.0）
または200mMクエン酸ナトリウム（pH8.0）中のペルオキ
シモノスルフェート100μｌを、⁵⁷Co−B₁₂を含む血清10
0μに添加した。この混合物を暗中で室温にて15分間
インキュベートした。次いで500mMリン酸ナトリウムま
たはカリウム中の100mM亜硫酸ナトリウム200μを添加
し、還元されなかったペルオキシモノスルフェートを還
元した。暗中で室温にて30分間インキュベートした。ヒ
ト血清アルブミンがコートされた木炭500μを添加
し、そしてその混合物を室温にて15分間インキュベート
した。次にこの混合物を遠心し、デカンテーションし、
そしてペレット水気を切った。次いでペレット中の⁵⁷Co
−B₁₂の量を測定した。ペルオキモノスルフェートは⁵⁷C
o−B₁₂を遊離させることができ、そして木炭は、緩衝化
された試薬では遊離されたB₁₂の75−80％を、そして緩
衝化されていない試薬では88−92％を沈澱させることが
できる。これらの結果は第１表に示されている。緩衝化
されていないペルオキシモノスルフェートは血清を沈澱
させ、そして緩衝化されていない試薬におけるより高い
遊離／沈澱は血清タンパク質の沈澱およびラベルのトラ
ップの作用によるかもしれない。

例 ２ ペルオキシモノスルフェートによる血清からのB₁₂遊離
の時間推移⁵⁷ Co−B₁₂を含む血清100μを、水、200mMリン酸塩（p
H7.0）または200mMクエン酸ナトリウム（pH8.0）中の10
0mMペルオキシモノスルフェート100μと共に、室温に
て様々な時間の間インキュベートした。次いで500mMリ
ン酸ナトリウムまたはカリウム（pH7.0）中100mMの亜硫
酸ナトリウム200μを添加し、そしてその混合物を暗
中で室温にて30分間インキュベートした。次にHSAがコ
ートされた木炭500μを添加し、そしてその混合物を
室温にて15分間インキュベートした。この試料を次に遠
心し、デカンテーションし、水気を切り、そして⁵⁷Co−
B₁₂をカウントした。⁵⁷Co−B₁₂の最大の遊離／回収は室
温にて10分までに達せられた。このレベルは少なくとも
50分までは保持された。これらの結果は第２表に示され
る。

例 ３ 還元剤と次なる抗−B₁₂抗体による結合の比較⁵⁷ Co−B₁₂を含む水200μを還元剤200μと共に室温
にて15分間インキュベートした。２種類の濃度の還元
剤;25mMおよび5mMを使った。ヒト血清アルブミンがコー
トされた木炭または二次抗体沈澱試薬（ポリエチレング
リコール、PEG）を伴う抗−B₁₂モノクローナル抗体500
μを添加し、そしてその混合物を室温にて15分間イン
キュベートした。次にその試料を遠心し、デカンテーシ
ョンし、水気を切り、そしてカウントした。第３表に示
されるように、亜硫酸塩還元剤も非亜硫酸塩還元剤もど
ちらも⁵⁷Co−B₁₂の木炭結合において有意な影響を与え
なかった。亜硫酸塩ベースの還元剤（亜硫酸ナトリウ
ム、異性重亜硫酸ナトリウムおよびヒドロ亜硫酸ナトリ
ウム）は、抗体によるB₁₂の結合を有意に減少させた。

例 ４ ペルオキシモノスルフェートおよびジチオトレイトール
濃度の滴定 水100μおよび200mMリン酸塩（pH7.0）中のペルオキ
シモノスルフェート100μを室温にて15分間インキュ
ベートした。100mMリン酸塩緩衝液、0.01％BSA（pH7.
5）中０−200mMのジチオトレイトール200μを添加
し、そして室温にて10分間インキュベートした。⁵⁷Co−
B₁₂ 50μおよび100mMリン酸塩緩衝液、0.01％BSA（pH
7.5）中の内因子−セファロース接合体の50％スラリー
８μを添加し、そして振とうしながら室温にて60分間
インキュベートした。次いで溶液を遠心し、そしてその
上清300μをカウントした。50mM以下のペルオキシモ
ノスルフェート濃度についてはジチオトレイトールに対
するペルオキシモノスルフェートの比1/1〜1/4が、内因
子−セファロースへのB₁₂の結合を可能にする。しかし
ながら、ペルオキシモノスルフェートがジチオトレイト
ールにより十分に還元されなければ、遊離されそして沈
澱されるB₁₂の率が減少し、このことは内因子−セファ
ロースが遊離されたトレーサーを結合できないことを示
す。これらの結果は第４表に示される。

例 ５ ビタミンB₁₂の遊離および次なる内因子−セファロース
への結合におけるペルオキシモノスルフェートおよびジ
チオトレイトールの影響 種々の濃度の非ラベル化ビタミンB₁₂が添加されている
試料（水、ヒト血清または合成マトリックス）100μ
を、50mMのペルオキシモノスルフェートを含有するかま
たは含有しない200mMのリン酸ナトリウムもしくはカリ
ウム（pH7.0）100μと共に室温にて15分間インキュベ
ートした。0.01％BSAを含み50mMのジチオトレイトール
を含むかまたは含まない100mMのリン酸ナトリウムもし
くはカリウム（pH7.5）200μを添加し、そしてその混
合物を室温にて５分間インキュベートした。⁵⁷Co−B₁₂
50μおよび内因子−セファロースの50％スラリー８μ
を添加し、そしてその混合物を室温にて30分間インキ
ュベートした。次いでこの試料を遠心し、そして上清30
0μをカウントした。その結果を第５表に示す。

未処理の試料とペルオキシモノスルフェートもジチオト
レイトールも両方含む試料との間の差は、ペルオキシモ
ノスルフェートが内在性バインダーからビタミンB₁₂を
遊離させることのできることおよび内因子−セファロー
スが還元系において遊離のビタミンB₁₂を結合できるこ
とを示している。ペルオキシモノスルフェートを含みジ
チオトレイトールを含まない試料は、ペルオキシモノス
ルフェートが内因子−セファロースへのビタミンB₁₂の
結合を妨害することを証明している。ジチオトレイトー
ルを含むかまたは含まないペルオキシモノスルフェート
試料間の類似性は、還元剤がそれらの条件下で内因子−
セファロースへのB₁₂結合を妨害しないことを示す。

例 ６ ペルオキシモノスルフェートとジチオトレイトールでの
前処理後に作成した用量応答曲線 試料（非ラベル化B₁₂を含むヒト血清、非ラベル化B₁₂を
含む合成マトリックスまたは非ラベル化B₁₂を含む対照
標準試料）100μを、200mMリン酸塩緩衝液（pH7.0）
中の50mMペルオキシモノスルフェート100μと共に室
温にて15分間インキュベートした。0.01％BSAを含む100
mMリン酸塩（pH7.5）中の50mMジチオトレイトール200μ
を添加し、そしてその混合物を室温にて10分間インキ
ュベートした。⁵⁷Co−B₁₂ 50μおよび内因子−セファ
ロースの50％スラリー８μを添加し、そしてその混合
物を振とうしながら室温で60分間インキュベートした。
試料を遠心し、そして上清300μをカウントした。第
６表に示されるように、この前処理プロトコールは、血
清に混合したB₁₂を遊離せしめ、そして血清結合タンパ
ンク質を破壊するが、内因子−セファロースによるB₁₂
の結合を損傷しない。合成マトリックスおよび対照標準
溶液は、有意な量の結合タンパク質を含有せず、よって
前処理された試料と前処理されてない試料との間にあま
り差がみられない。

例 ７ ジチオトレイトールによるペルオキシモノスルフェート
の還元および次なる内因子−セファロースによるB₁₂の
結合についての時間推移 100μの試料（水、合成マトリックスまたはヒト血
清）を、200mMリン酸塩緩衝液（pH7.0）中の50mMペルオ
キシモノスルフェート100μと共に室温にて15分間イ
ンキュベートした。0.01％BSAを含む100mMリン酸塩緩衝
液（pH7.5）中の50mMジチオトレイトール200μを添加
し、そして該試料を室温にて種々の時間の間インキュベ
ートした。⁵⁷Co−B₁₂ 50μおよび内因子−セファロー
スの50％スラリー８μを種々の時点で添加し、そして
その混合物を室温にて振とうしながらインキュベートし
た。次いで試料を遠心し、そして上清300μをカウン
トした。第７表に示されるように、ペルオキシモノスル
フェートの還元は明らかに即座におこり、競合的または
連続的プロトコールのために、それぞれ⁵⁷Co−B₁₂トレ
ーサーまたは内因子−セファロースをジチオトレイトー
ルと組み合わせることができることを示している。

第８表に示されるように、B₁₂と内因子−セファロース
との結合反応は、使用条件下で１時間までに完全に到達
する。

本発明の方法は、次なるビタミンB₁₂濃度の測定のため
に血清試料を前処理するための迅速で且つ単純な手段を
提供する。この前処理は、血清中のビタミンB₁₂の測定
のための種々のラジオアッセイまたは非−同位体法の前
に使用することができる。

本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願
は、本発明が属する当業界の技術水術を示すものであ
る。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊
行物または特許出願が特定的に且つ個別的に引例として
組込まれることが指摘されたかのように本明細書に引例
として組込まれる。

今まで本発明を十分に記載してきたが、添付された請求
の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変
更または改良を行い得ることが当業者に明らかであろ
う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−210567（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501008（ＪＰ，Ａ) 米国特許4668620（ＵＳ，Ａ) 米国特許4703001（ＵＳ，Ａ) ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．26．Ｎｏ．２（1980）Ｐ．323, 324

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ビタミンB₁₂の濃度を測定するために血清
   試料を準備する方法において、血清試料を、ペルオキシ
   酸またはその塩から本質上成る酸化剤と接触せしめるこ
   とにより該試料中の内因性血清結合タンパク質からビタ
   ミンB₁₂を遊離せしめることを含んで成る方法。
2. 【請求項２】前記接触に続いて、還元されなかったペル
   オキシ酸を実質的に還元するのに充分な量の還元剤を前
   記酸化された血清試料に添加することを更に含んで成
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記還元剤がジチオスレイトールである、
   請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】前記ペルオキシ酸またはその塩がペルオキ
   シモノスルフェートまたはペルオキシトリフルオロ酢酸
   またはそれらの塩から本質的に成る、請求項１または２
   項に記載の方法。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
   により準備した血清試料を用いることを特徴とするビタ
   ミンB₁₂の濃度の測定方法。
6. 【請求項６】請求項２または３に記載の方法により準備
   した血清試料を用い、且つビタミンB₁₂に対して特異的
   な結合タンパク質を用いることを特徴とするビタミンB
   ₁₂の濃度の測定方法。
7. 【請求項７】ビタミンB₁₂の濃度を測定するために血清
   試料を準備するためのキットであって、別々の容器に、 （ａ）ペルオキシ酸またはその塩から本質上成る酸化
   剤、および （ｂ）還元剤、 を含んで成るキット。
8. 【請求項８】前記還元剤が、ジチオスレイトールである
   請求項７に記載のキット。
9. 【請求項９】前記酸化剤が、ペルチオキシモノスルフェ
   ートまたはペルオキシトリフルオロ酢酸またはそれらの
   塩から本質上成る請求項７に記載のキット。
10. 【請求項１０】ビタミンB₁₂測定キットであって、測定
    のための成分として、 （ａ）ペルオキシ酸またはその塩から本質上成る酸化
    剤、 （ｂ）還元剤、 （ｃ）ｉ）ビタミンB₁₂結合タンパク質、 ii）標識されたビタミンB₁₂トレーサー、および iii）既知濃度のビタミンB₁₂を含んで成る少なくとも１
    つの参照試料、 の少なくとも１つ を含んで成るキット。
11. 【請求項１１】前記結合タンパク質が内因子である、請
    求項10に記載のビタミンB₁₂測定キット。
12. 【請求項１２】前記内因子が固体支持体に結合されてい
    る、請求項11に記載のビタミンB₁₂測定キット。
13. 【請求項１３】前記還元剤がジチオスレイトールである
    請求項10に記載のビタミンB₁₂測定キット。
14. 【請求項１４】前記酸化剤がペルオキシモノスルフェー
    トまたはペルオキシトリフルオロ酢酸またはそれらの塩
    である、請求項10に記載のビタミンB₁₂測定キット。
15. 【請求項１５】前記成分が凍結乾燥されている、請求項
    10〜14のいずれか１項に記載のビタミンB₁₂測定キッ
    ト。