JPH0772731B2 - 酵素の会合を利用した測定法 - Google Patents
酵素の会合を利用した測定法Info
- Publication number
- JPH0772731B2 JPH0772731B2 JP25203886A JP25203886A JPH0772731B2 JP H0772731 B2 JPH0772731 B2 JP H0772731B2 JP 25203886 A JP25203886 A JP 25203886A JP 25203886 A JP25203886 A JP 25203886A JP H0772731 B2 JPH0772731 B2 JP H0772731B2
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- peroxidase
- hemoglobin
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Description
【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、酵素を標識した抗原あるいは抗体を用い、抗
原抗体反応を行わせ、会合の結果生ずる酵素活性の変化
を主として光学的に測定し、それより目的の抗原あるい
は抗体を定量する均一系の分析方法における溶血の影響
の抑制方法に関する。なお、本発明における会合とは物
質が酵素の周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼす程
度に集まることをいう。例えば、生物学的反応である免
疫学的凝集反応あるいは凝集素による凝集反応や化学的
架橋反応による凝集反応をいう。
原抗体反応を行わせ、会合の結果生ずる酵素活性の変化
を主として光学的に測定し、それより目的の抗原あるい
は抗体を定量する均一系の分析方法における溶血の影響
の抑制方法に関する。なお、本発明における会合とは物
質が酵素の周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼす程
度に集まることをいう。例えば、生物学的反応である免
疫学的凝集反応あるいは凝集素による凝集反応や化学的
架橋反応による凝集反応をいう。
「従来の技術」 抗原抗体反応の特異性は、生体成分の測定に古くから利
用されて来た。近年ラジオイムノアッセイ法、エンザイ
ムイムノアッセイ法を始め、ラテックス凝集反応の光学
的分析法などが開発され、免疫学的手段は、微量成分の
定量の大半を担うようになって来た。エンザイムイムノ
アッセイ法の基本原理は、免疫学的反応の特異性を酵素
によって増幅し、検出することにあるが、大別すると、
ポリスチレンビーズやマイクロタイタープレートを用い
る方法と、これらの固相を使用せず、溶液中で反応させ
る均一系分析方法がある。例えば、特開昭58−122459号
公報に詳しく述べられている均一系分析方法は、標的物
質を、その物質に特異的結合性を有する受容体と酵素を
用いて会合反応を行わせ、酵素活性の変化を測定するこ
とにより定量する均一系分析方法と要約される。
用されて来た。近年ラジオイムノアッセイ法、エンザイ
ムイムノアッセイ法を始め、ラテックス凝集反応の光学
的分析法などが開発され、免疫学的手段は、微量成分の
定量の大半を担うようになって来た。エンザイムイムノ
アッセイ法の基本原理は、免疫学的反応の特異性を酵素
によって増幅し、検出することにあるが、大別すると、
ポリスチレンビーズやマイクロタイタープレートを用い
る方法と、これらの固相を使用せず、溶液中で反応させ
る均一系分析方法がある。例えば、特開昭58−122459号
公報に詳しく述べられている均一系分析方法は、標的物
質を、その物質に特異的結合性を有する受容体と酵素を
用いて会合反応を行わせ、酵素活性の変化を測定するこ
とにより定量する均一系分析方法と要約される。
しかしながら、当該分析方法を酵素にペルオキシダーゼ
を用いて実施した時、特に生体試料が溶血している場合
には、血球由来のヘモグロビンがペルオキシダーゼ様活
性を有するため、標的物質に依存した抗原抗体反応とは
無関係に基質を酸化縮合してしまう。この結果溶血検体
では正誤差を含む測定値が得られることにより、標的物
質を正確に測定することができない。従って、溶血の影
響を除去するためには、個々の検体についてブランクを
とる必要があった。検体ブランクの測定は繁雑であり、
また、強溶血検体にいたっては、ブランクの測定を行っ
ても、正確な測定値を得ることができなかった。
を用いて実施した時、特に生体試料が溶血している場合
には、血球由来のヘモグロビンがペルオキシダーゼ様活
性を有するため、標的物質に依存した抗原抗体反応とは
無関係に基質を酸化縮合してしまう。この結果溶血検体
では正誤差を含む測定値が得られることにより、標的物
質を正確に測定することができない。従って、溶血の影
響を除去するためには、個々の検体についてブランクを
とる必要があった。検体ブランクの測定は繁雑であり、
また、強溶血検体にいたっては、ブランクの測定を行っ
ても、正確な測定値を得ることができなかった。
「発明が解決しようとする問題点」 溶血の影響を回避するためには、ヘモグロビンの持つペ
ルオキシダーゼ様活性を抑制しなければならないが、ヘ
モグロビンとペルオキシダーゼは共にヘム蛋白で、活性
部位が類似しているため、ヘモグロビンの抑制剤は、ペ
ルオキシダーゼの抑制剤ともなることから当該分析法へ
の適用は困難であった。
ルオキシダーゼ様活性を抑制しなければならないが、ヘ
モグロビンとペルオキシダーゼは共にヘム蛋白で、活性
部位が類似しているため、ヘモグロビンの抑制剤は、ペ
ルオキシダーゼの抑制剤ともなることから当該分析法へ
の適用は困難であった。
本発明者らは、当該分析法への適用が可能なヘモグロビ
ンの抑制物質を種々検討した結果、生体液中での濃度が
比較的高く、検体を希釈することのできる標的物質の場
合、希釈液中にペルオキシダーゼの基質であるH2O2を加
えると、期待通りの効果が得られることを見出し本発明
に至った。すなわち検体の希釈操作を前処理として利用
しようとするものである。
ンの抑制物質を種々検討した結果、生体液中での濃度が
比較的高く、検体を希釈することのできる標的物質の場
合、希釈液中にペルオキシダーゼの基質であるH2O2を加
えると、期待通りの効果が得られることを見出し本発明
に至った。すなわち検体の希釈操作を前処理として利用
しようとするものである。
「問題点を解決するための手段」 本発明は、標的物質とその物質に特異的結合性を有する
受容体のいずれか一方にペルオキシダーゼを結合させた
ものを用い、会合していない標的物質と受容体ではペル
オキシダーゼ活性が阻害されるような基質の濃度で、標
的物質と受容体との会合反応を行わせ、その結果生ずる
ペルオキシダーゼ活性の変化を基質として過剰の過酸化
水素、水素供与体であるフェノール類、及びフェノール
類に対する酸化縮合剤を用いて測定することによる生体
液中の標的物質を分析定量する均一系分析方法におい
て、生体液をアジ化ナトリウムと過酸化水素を含む希釈
液で前処理することにより溶血の影響を抑制することを
特徴とする酵素の会合を利用した測定法である。
受容体のいずれか一方にペルオキシダーゼを結合させた
ものを用い、会合していない標的物質と受容体ではペル
オキシダーゼ活性が阻害されるような基質の濃度で、標
的物質と受容体との会合反応を行わせ、その結果生ずる
ペルオキシダーゼ活性の変化を基質として過剰の過酸化
水素、水素供与体であるフェノール類、及びフェノール
類に対する酸化縮合剤を用いて測定することによる生体
液中の標的物質を分析定量する均一系分析方法におい
て、生体液をアジ化ナトリウムと過酸化水素を含む希釈
液で前処理することにより溶血の影響を抑制することを
特徴とする酵素の会合を利用した測定法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
溶血に伴ってヘモグロビンとともに生体液中に混入する
物質の１つにカタラーゼがある。カタラーゼは、2H2O2
→2H2O＋O2なる反応を触媒する酵素であるため希釈液中
のH2O2を分解しヘモグロビンへの抑制効果を弱めると同
時にペルオキシダーゼの活性も変化させる可能性があ
る。本発明者らは、カタラーゼの阻害剤であるNaN3を希
釈液に加えることで、H2O2の濃度を安定化することに成
功した。
物質の１つにカタラーゼがある。カタラーゼは、2H2O2
→2H2O＋O2なる反応を触媒する酵素であるため希釈液中
のH2O2を分解しヘモグロビンへの抑制効果を弱めると同
時にペルオキシダーゼの活性も変化させる可能性があ
る。本発明者らは、カタラーゼの阻害剤であるNaN3を希
釈液に加えることで、H2O2の濃度を安定化することに成
功した。
次に本発明の効果を実験データを用いて詳細に説明す
る。
る。
第１図は、ヘモグロビンにH2O2を作用させた場合のヘモ
グロビンの吸収スペクトルの変化を経時的に調べた結果
である。ヘムに特徴的な可視部の吸収が徐々に消失して
おり、ペルオキシダーゼ様活性の抑制は、ヘムの構造変
化によるものと考えられる。
グロビンの吸収スペクトルの変化を経時的に調べた結果
である。ヘムに特徴的な可視部の吸収が徐々に消失して
おり、ペルオキシダーゼ様活性の抑制は、ヘムの構造変
化によるものと考えられる。
第２図は、ヘモグロビン（400mg/dl）のペルオキシダー
ゼ活性を、H2O2処理の有無で、経時的に追跡した結果で
ある。なお、400mg/dlのヘモグロビン溶液をH2O2水溶液
で５倍希釈した。H2O2の濃度に依存したペルオキシダー
ゼ様活性の抑制現象が見られた。
ゼ活性を、H2O2処理の有無で、経時的に追跡した結果で
ある。なお、400mg/dlのヘモグロビン溶液をH2O2水溶液
で５倍希釈した。H2O2の濃度に依存したペルオキシダー
ゼ様活性の抑制現象が見られた。
第３図は、18mMのH2O2を含む希釈液に種々の濃度のNaN3
を添加し、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を調
べたものである。なお、400mg/dlのヘモグロビン溶液を
18mMのH2O2を含む溶液で希釈した。0.1〜0.8mMのNaN3で
カタラーゼのH2O2分解活性は抑制され、H2O2のヘモグロ
ビンに対する効果の維持できることがわかった。NaN3の
濃度によって、より低濃度のH2O2でヘモグロビンが、充
分に抑制される現象も見られた。
を添加し、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を調
べたものである。なお、400mg/dlのヘモグロビン溶液を
18mMのH2O2を含む溶液で希釈した。0.1〜0.8mMのNaN3で
カタラーゼのH2O2分解活性は抑制され、H2O2のヘモグロ
ビンに対する効果の維持できることがわかった。NaN3の
濃度によって、より低濃度のH2O2でヘモグロビンが、充
分に抑制される現象も見られた。
第４図は、H2O2とNaN3の濃度を適当に調整した希釈液で
前処理したヘモグロビン溶液のペルオキシダーゼ様活性
を調べた結果である。この条件下で、ヘモグロビンの活
性は10％以下に低下していた。なお、各濃度のヘモグロ
ビン溶液を2.5mM H2O2、0.4mM NaN3を含む溶液で希釈し
た。
前処理したヘモグロビン溶液のペルオキシダーゼ様活性
を調べた結果である。この条件下で、ヘモグロビンの活
性は10％以下に低下していた。なお、各濃度のヘモグロ
ビン溶液を2.5mM H2O2、0.4mM NaN3を含む溶液で希釈し
た。
本発明は、溶血の影響をNaN3とペルオキシダーゼの基質
であるH2O2の一部を前もって検体に加えておくことで解
決したものである。本発明の適用によって、当該分析法
は検体ごとにブランクをとるという繁雑な操作を省略し
て行うことが可能になった。このことは、簡便さと迅速
性という均一系分析方法の特長をより明確にすると考え
られる。
であるH2O2の一部を前もって検体に加えておくことで解
決したものである。本発明の適用によって、当該分析法
は検体ごとにブランクをとるという繁雑な操作を省略し
て行うことが可能になった。このことは、簡便さと迅速
性という均一系分析方法の特長をより明確にすると考え
られる。
「実施例」 次に実施例をあげ、本発明の効果を具体的に示す。
血清中のFDPの測定における溶血の影響 （試薬）A:0.13mM NaN3と0.75mM H2O2を含む50mMクエン
酸緩衝液（PH5.0） B:ペルオキシダーゼで標識された抗フィブリノーゲン抗
体を含む50mMトリス緩衝液（PH7.9） C:0.75mM4−アミノアンチピリン、25mMフェノール、40m
M H2O2を含む50mMリン酸ナリウム緩衝液（PH7.0） D:5％ホルマリンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（P
H7.0） （操作） 既知濃度のヘモグロビンを添加した血清20μを試
薬A1mlに加え、室温に30分間放置する。
酸緩衝液（PH5.0） B:ペルオキシダーゼで標識された抗フィブリノーゲン抗
体を含む50mMトリス緩衝液（PH7.9） C:0.75mM4−アミノアンチピリン、25mMフェノール、40m
M H2O2を含む50mMリン酸ナリウム緩衝液（PH7.0） D:5％ホルマリンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（P
H7.0） （操作） 既知濃度のヘモグロビンを添加した血清20μを試
薬A1mlに加え、室温に30分間放置する。
希釈血清50μに試薬Ｂを100μ加え37℃で20分
間インキュベーションする。
間インキュベーションする。
試薬Ｃを500μ加え、370℃でさらに10分間インキ
ュベーションする。
ュベーションする。
試薬Ｄを2ml加え、500nmの吸光度を測定する。既知
濃度の標準物質を同様に操作して得られた吸光度から、
血清中のFDP濃度を算出する。
濃度の標準物質を同様に操作して得られた吸光度から、
血清中のFDP濃度を算出する。
（結果） 第５図に示す。NaN3、H2O2を含まないクエン酸緩衝液で
希釈した場合に比べ、溶血の影響は著しく抑制されてい
た。
希釈した場合に比べ、溶血の影響は著しく抑制されてい
た。
「発明の効果」 以上から明らかな如く、本発明の方法によれば資料中の
溶血の影響を受けずに正確な測定結果を得ることができ
る。
溶血の影響を受けずに正確な測定結果を得ることができ
る。
第１図はH2O2処理に伴うヘモグロビンのスペクトル変化
を示すグラフ図であり、第２図はH2O2処理によるヘモグ
ロビンのペルオキシダーゼ活性の変化を示すグラフ図で
あり、第３図はNaN3濃度とヘモグロビンのペルオキシダ
ーゼ様活性を示すグラフ図であり、第４図はH2O2とNaN3
のヘモグロビン抑制効果を示すグラフ図であり、第５図
はFDP測定における溶血の影響を示すグラフ図である。
を示すグラフ図であり、第２図はH2O2処理によるヘモグ
ロビンのペルオキシダーゼ活性の変化を示すグラフ図で
あり、第３図はNaN3濃度とヘモグロビンのペルオキシダ
ーゼ様活性を示すグラフ図であり、第４図はH2O2とNaN3
のヘモグロビン抑制効果を示すグラフ図であり、第５図
はFDP測定における溶血の影響を示すグラフ図である。
Claims (3)
- 【請求項１】標的物質とその物質に特異的結合性を有す
る受容体のいずれか一方にペルオキシダーゼを結合させ
たものを用い、会合していない標的物質と受容体ではペ
ルオキシダーゼ活性が阻害されるような基質の濃度で、
標的物質と受容体との会合反応を行わせ、その結果生ず
るペルオキシダーゼ活性の変化を基質として過剰の過酸
化水素、水素供与体であるフェノール類、及びフェノー
ル類に対する酸化縮合剤を用いて測定することによる生
体液中の標的物質を分析定量する均一系分析方法におい
て、生体液をアジ化ナトリウムと過酸化水素を含む希釈
液で前処理することにより溶血の影響を抑制することを
特徴とする酵素の会合を利用した測定法。 - 【請求項２】希釈液中の過酸化水素の濃度が0.5〜2.5mM
である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - 【請求項３】希釈液中のアジ化ナトリウムの濃度が0.1
〜1mMである特許請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25203886A JPH0772731B2 (ja) | 1986-10-24 | 1986-10-24 | 酵素の会合を利用した測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25203886A JPH0772731B2 (ja) | 1986-10-24 | 1986-10-24 | 酵素の会合を利用した測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63108263A JPS63108263A (ja) | 1988-05-13 |
| JPH0772731B2 true JPH0772731B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=17231710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25203886A Expired - Lifetime JPH0772731B2 (ja) | 1986-10-24 | 1986-10-24 | 酵素の会合を利用した測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0772731B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163164A (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-06 | Konica Corp | 多層分析素子 |
-
1986
- 1986-10-24 JP JP25203886A patent/JPH0772731B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63108263A (ja) | 1988-05-13 |
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