JP2014118406A - Ｏｐｈ活性増強剤 - Google Patents

Abstract

【課題】酸化蛋白質を分解する酵素であるOPHの蛋白質の糖化反応による最終生成物であるAGEsに対する分解作用の存在を示すとともに、その分解作用を活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤を提供することを課題とする。
【解決手段】上記課題を解決するために、バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶を１種類以上含む組み合わせからなり、酸化蛋白質分解酵素（OPH）のAGEs分解作用を１．２倍以上活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤などを提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、酸化蛋白質を分解する生体内酵素である酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：OPH）のAGEs分解作用を活性化させるOPHのAGEs分解活性増強剤、及び、当該OPHのAGEs分解活性増強剤を含有する飲食品や医薬品などに関する。

生体内での蛋白質糖化反応が皮膚老化、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などの加齢による機能低下や疾病に関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより、肌などにくすみが生じることになる。このような加齢により生じる疾病や機能低下をもたらす要因となる糖化反応を阻害するための研究が種々行われている（特許文献１）。

また、加齢による疾病や機能低下をもたらす他の要因として、蛋白質の酸化反応も注目されている。生体内における蛋白質の酸化反応がもたらす細胞や組織への影響としては、例えば、組織コラーゲンなどの加齢変化、アルツハイマー病、白内障、皮膚老化などさまざまな疾患や機能低下が挙げられる。

生体内において蛋白質の酸化反応により生成される酸化蛋白質は、酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：以下、OPHと記す）という生体内酵素により分解除去される。OPHは生体組織中に広く分布し、酸化蛋白質を優先的に分解するセリンプロテアーゼの一種であり、蛋白質のN末端アシル化アミノ酸を遊離する酵素であるアシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino-acid-releasing enzyme：AARE）として知られている。

OPHは加齢とともにその活性が低下してしまう。従って、その活性低下により上記のような皮膚老化や疾病などをもたらすことになる。そこで、疾患や老化を予防するためにOPHの活性を促進させる作用物質についての研究も近年進められている（特許文献２）。

特許第４１９５８４０号公報 国際公開番号ＷＯ２０１１／００４７３３

上記のように、蛋白質の糖化反応と酸化反応は、それぞれに対して研究が行われているもののいずれの反応をも抑制し、あるいは、それらの反応生成物を分解し得る作用物質については明らかにされていない。そこで、酸化蛋白質を分解する酵素であるOPHの蛋白質の糖化反応による最終生成物であるAGEsに対する分解作用の存在を示すとともに、その分解作用を活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、第一の発明として、バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶を１種類以上含む組み合わせからなり、酸化蛋白質分解酵素（OPH）のAGEs分解作用を１．２倍以上活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤を提供する。

第二の発明として、第一の発明に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品を提供する。

本発明により、OPHのAGEs分解活性を増強させるOPHのAGEs分解活性増強剤を提供することが可能となる。

蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定結果を示す図 AGEs分解活性増強率がプラスとなった測定結果を示す図

以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
<実施形態１>
<実施形態１ 概要>

本実施形態は、まず、酸化蛋白質を分解する酵素であるOPHに、糖化蛋白質や糖化最終生成物（AGEs）に対する分解作用が備わることを示す。そして、OPHのAGEs分解作用活性について、コントロール（サンプル無添加）と比較して、増強作用が試験により認められた１０種類の植物の抽出物を含むOPHのAGEs分解活性増強剤を提示する。
<実施形態１ 構成>

本実施形態に係るOPHのAGEs分解活性増強剤は、バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶の抽出物を１種類以上含む組み合わせからなる。ここに挙げられた１０種のサンプルは、後述するOPHのAGEs分解活性増強作用の測定試験を行った１００種を超えるサンプルの中で、サンプルを添加しないコントロールと比較して１．２倍以上のAGEs分解活性増強作用が認められたものである。

本実施形態における植物の抽出物は、植物のどの部位から抽出したものであってもよく、例えば、全草、花、種子、果実、枝、茎、樹皮、根などから抽出したものであってよい。また、抽出物の性状を限定するものではない。以下に、本実施形態で用いられる植物を説明する。

「バナバ茶」Lagerstroemia speciosaは、ミソハギ科サルスベリ属の植物である。

「ルイボス」Aspalathus linearisは、マメ科アスパラトゥス属の植物である。

「甜茶」は、バラ科キイチゴ属のテンヨウケンコウシ（Rubus suavissimus）の葉を原料とする茶である。

「グァバ」Psidium guajavaは、フトモモ科バンジロウ属の植物である。

「緑茶」は、ツバキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）の葉を原料とし、摘み取った茶葉の発酵をさせないものである。

「月見草」Oenothera tetrapteraは、アカバナ科マツヨイグサ属の植物である。

「紅茶」は、茶（Camellia sinensis）の葉を原料とし、摘み取った茶葉を発酵させたものである。

「カモミール」Matricaria recutitaは、キク科シカギク属の植物である。

「ジャスミン」Jasminum officinaleは、モクセイ科ソケイ属の植物である。

「煎茶」は、緑茶のうちとくに露天栽培した茶の葉を原料とするものである。

上述した１０種の植物抽出物の一種又は二種以上の組み合わせからなるOPHのAGEs分解活性増強剤は、これを含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品などとして応用することが可能である。
<実施形態 試験>
<試験１>

本試験では、OPHがAGEsに対する分解作用を有するか否かについて測定試験を行う。本試験を概説すると、蛍光性AGEs、AGEsの一つであるペントシジン、同じくAGEsの一つであるCML（カルボキシメチルリジン）のそれぞれにOPHを添加し、OPHを添加しないそれぞれとの比較を行うことで、OPHの蛍光性AGEsに対する分解作用の有無を確かめるものである。

（１）AGEsの調整

100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4) 500μL、2mol/Lグルコース(Glc) 100μL、40mg/mLヒト血清アルブミン(HSA) 200μL、蒸留水200μLを混合し、GlcとHSAの混合液(Glc-HSA G+)を調製した。次に、100mmol/Lリン酸緩衝液500μL、40mg/mL HSA 200μL、蒸留水300μLを混合し、Glcを含まない溶液(Glc-HSA G-)を調製した。そして各混合液を60℃、40時間インキュベートした。

（２）OPHと糖化蛋白質の反応

インキュベート後のGlc-HSA G+とGlc-HSA G-を使用し、下記の表１のA〜Eの反応液を調製し37℃で90分インキュベートした。OPHとして0.5Uのアシルアミノ酸遊離酵素（AARE； タカラバイオ）を用いた。インキュベート後の反応液には、PCAを100μL加えて遠心分離し、蛋白を沈澱させ上清を除去した。さらに沈殿物にTris-HCl(pH7.4) 350μLを加えて再溶解した。

（３）蛍光性AGEsの測定

再溶解後の反応液A〜Eを96ウェルマイクロプレートに250μL添加し、マイクロプレートリーダーで励起波長370nm、検出波長440nmにおける蛍光を測定した。

（４）ペントシジンの測定

再溶解後の反応試薬A〜Eに6N 塩酸1mLを加え、ブロックインキュベーターで100℃、18時間加水分解した。その後、反応液サンプルを乾固し蒸留水1mLで溶解した．次に、各反応液サンプル500μLをイオン交換カラム(Oasis MCX)に注入し、0.1N 塩酸 3mLを通液後、7% NH3水溶液 4.5mLでペントシジンを溶出した。

ペントシジン溶出液を蒸発乾固し、そこに10%アセトニトリル（CAN）を含む0.2%HFBAを300μL加え溶解した。次いで本サンプルを逆相HPLCにて分析した。

カラムはYMC Triart C18/S-5μm/12nm 150 x 4.6mm使用し、分析条件は流速1.0ml/min、カラム温度40℃、蛍光検出(励起波長335nm，蛍光波長385nm)とした。インジェクション量は50μLとし，溶離液条件はA) 0.2% HFBA, B) ACNとして、20%B (0-9min),100%B (9-17min),のグラジェント分析とした。

（５）CMLの測定

再溶解後の反応試薬A〜E中のCMLを、CircuLex CML/Nε-(carboxymethyl) Lysine ELISA Kit (サイクレックス)を使用して測定した。

（６）OPHによるAGEs分解作用の測定

蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定値は下記式１（OPHを含む蛍光値）及び式２（OPHを含まない蛍光値）より求めた。
（式１）OPH+＝ 反応液A−C−E
（式２）OPH-＝ 反応液B−D

（７）結果

図１は、蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定結果を示すものである。図示するように、いずれにおいても、OPHを含まない「OPH-」よりもOPH を含む「OPH+」の方が低い蛍光値を示していることから、OPHはGlc-HSA G+に含有されるAGEsを分解したものと認められる。
<試験２>

上記試験１において、OPHがAGEsを分解することが認められた。そこで、１００種を超えるサンプルを対象として、以下に詳述するOPHのAGEs分解活性増強作用の測定試験を行った。

（１）サンプルの抽出

各乾燥サンプル3.75gを恒温水槽中で80℃に加温した蒸留水150mL中に加えて1時間インキュベートした。その後、抽出液を4500rpmで15分間遠心分離して上清を回収し、サンプル抽出液とした。

（２）AGEs分解活性増強作用の測定

100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4) 500μL、2mol/Lグルコース(Glc)100μL、40mg/mLヒト血清アルブミン(HSA)200μL、蒸留水200μLを混合し、GlcとHSAの混合液(Glc-HSA G+)を調製した。同様にGlcを添加しない溶液(Glc-HSA G-)を調製した。

この各混合液を60℃、40時間インキュベートして得られた反応液を含む下記の表A〜Dの反応試薬を調製した。調製したA〜Dの反応試薬は37℃、90分インキュベートし、その後70%PCAを100μL加え遠心分離し、反応液中の蛋白を沈澱させた。

沈殿した蛋白質は50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)を加えて溶解して再溶解させた後、反応試薬A〜Dを96ウェルマイクロプレートに250μLずつ添加した。マイクロプレートリーダーで励起波長370nm、検出波長440nmにおけるAGEs由来の蛍光を測定した。AGEs分解活性増強率は反応試薬A〜Dを下記の式３に当てはめて蛍光値から求めた。
（式３）AGEs分解活性増強率（％）＝１００−（反応試薬B-C-D）/（反応試薬A-C-D）×１００

（３）結果

図２は、AGEs分解活性増強率の測定結果のうち、プラスの結果が得られたサンプルのうちとくに２０％以上の増強率が得られたものを示している。

図示するように、バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶について、OPHのAGEsに対する分解作用を２０％以上活性化させることが示された。したがって、この１０種の植物抽出物がOPHのAGEsに対する分解作用をも活性化させることが示された。
<実施形態 効果>

本実施形態により、バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶の抽出物を1種類以上含有させることにより、OPHのAGEs分解を活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤を提供することが可能となる。

Claims (7)

1. バナバ茶、ルイボス、甜茶、グァバ、緑茶、月見草、紅茶、カモミール、ジャスミン、煎茶を１種類以上含む組み合わせからなり、酸化蛋白質分解酵素（OPH）のAGEs分解作用を１．２倍以上活性化するOPHのAGEs分解活性増強剤。
2. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する飲食品。
3. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する健康食品。
4. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する食品添加物。
5. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する医薬品。
6. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する化粧品。
7. 請求項１に記載のOPHのAGEs分解活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する医薬部外品。

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