JP5812464B2 - 標的核酸の分離検出方法、標的核酸分離検出用イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及び標的核酸分離検出用イオン交換クロマトグラフィー用カラム - Google Patents

Description

本発明は、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及び該充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法に関する。

イオン交換クロマトグラフィーは、カラム充填剤が有するイオン交換基と検出対象物質が有するイオン性基との間に働く静電的相互作用を利用して検出対象物質を分離する液体クロマトグラフィーの１つである。
特に、核酸、タンパク質、多糖類等の生体高分子の分離に優れているため、生化学分野、医学分野等で汎用されている。
イオン交換クロマトグラフィーには、アニオン交換クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとがある。アニオン交換クロマトグラフィーは、カチオン性基を有するカラム充填剤を用いて、アニオン性の物質を分離する方法である。カチオン交換クロマトグラフィーは、アニオン性基を有するカラム充填剤を用いて、カチオン性の物質を分離する方法である。

アニオン交換クロマトグラフィーに用いられるカラム充填剤が有するカチオン性基としては、例えば、ジエチルアミノエチル基のような弱カチオン性基、４級アンモニウム基のような強カチオン性基があり、これらのカチオン性基を有するカラム充填剤は市販されており、各種研究分野で使用されている。

近年、様々な遺伝子検査技術が開発されており、核酸等の検出対象物質を、短時間で、かつ高精度に分離検出することが重要になっている。
核酸とは、塩基、糖、リン酸からなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子であり、糖構造の違いによってデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）とに分類される。
例えば、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸をイオン交換クロマトグラフィーにより分離する場合には、該標的核酸が有するリン酸基のマイナス電荷を利用したアニオン交換クロマトグラフィーが用いられており、これらの標的核酸を鎖長別に分離検出できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、検体をセットするだけで結果が得られるため、検出対象物質を簡便に検出することができる。しかし、従来のカラム充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーは、より短時間で検出対象物質を分離検出しようとした場合には分離性能が不充分であるという課題がある。イオン交換クロマトグラフィーの分離性能は、主に、カラム充填剤の表面の特性やカラムサイズに依存する。特に、カラム長を長くすると理論段数の向上に伴って分離性能が向上するが、分離検出に要する時間が長くなったり、カラム圧力が高くなったりする。カラム圧力が高いイオン交換クロマトグラフィーを行うには、耐圧性に優れた装置が必要となるため、装置が高価になったり、装置が大がかりになったりするという問題がある（特許文献１）。

特開２００２−１９４１１７号公報

本発明は、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、短時間かつ高精度に分離検出できるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及びこの充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法を提供することを目的とする。
本発明は、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及び該充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法に関する。

本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーに用いる充填剤として、基材微粒子の表面に、強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する充填剤を用いることにより、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、短時間かつ高精度に分離検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤（以下、単に「充填剤」ともいう）は、基材微粒子の少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する。

上記強カチオン性基は、ｐＨ１から１４の全ての範囲で解離するカチオン性基である。すわなち、強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。
上記強カチオン性基として、好ましくは４級アンモニウム基が挙げられる。４級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基が挙げられる。また、トリアルキルアンモニウム基のカウンターイオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤における強カチオン性基の量は特には限定されないが、好ましい下限は充填剤の乾燥重量１ｇあたり１μｅｑ、好ましい上限は充填剤の乾燥重量１ｇあたり５００μｅｑである。強カチオン性基の量が１μｅｑ／ｇ未満であると、充填剤の検出対象物質に対する保持力が弱くなり、分離性能が不充分になる。強カチオン性基の量が５００μｅｑ／ｇを超えると、充填剤の検出対象物質に対する保持力が強くなるため、検出対象物質を短時間で溶出させ難くなり、分離検出に要する時間が長くなる。

上記弱アニオン性基は、ｐｋａが３以上のアニオン性基である。すなわち、弱アニオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。ｐＨが３を超えると、カルボキシ基等の弱アニオン性基のプロトンは解離し、マイナスの電荷を持つ割合が増える。ｐＨが３未満になると、カルボキシ基等の弱アニオン性基のプロトンが結合した非解離状態の割合が増える。

上記弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシ基が好ましい。

弱アニオン性基を後述する基材微粒子の表面に導入する方法は特には限定されない。例えば、カルボキシ基を基材微粒子の表面に導入する方法としては、カルボキシ基を有する単量体を共重合して基材微粒子とする方法、基材微粒子を構成する単量体中のエステル部を加水分解する方法、基材微粒子をオゾン水処理することによりカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子をオゾンガス処理することによりカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子にプラズマ処理を施しカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子にカルボキシ基を有するシランカップリング剤を反応させる方法、エポキシ基を有する単量体を共重合させて基材微粒子を得た後にエポキシ基の開環によってカルボキシ基を形成する方法等が挙げられる。なかでも、基材微粒子が、疎水性の構造部分、特に炭素−炭素の二重結合を有するものである場合、オゾン水処理によってカルボキシ基を形成する方法が好ましい。

基材微粒子をオゾン処理することにより、基材微粒子の表面にカルボキシ基を形成させる方法について説明する。
オゾンは二重結合との反応性が高く、二重結合と反応したオゾンは、中間体であるオゾナイドを形成し、その後、カルボキシ基等が形成される。

オゾン処理としては、オゾンガス処理、オゾン水処理等が挙げられ、オゾン水処理が好ましい。オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
上記オゾン水を用いることにより、オゾン水中に粒子を分散させるだけで粒子表面を簡便に酸化させることができる。その結果、基材微粒子における疎水性の構造部分が酸化され、カルボキシ基、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成されると考えられる。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾン水を用いて処理することにより、オゾンガスを用いる処理よりも、粒子表面をより均一に酸化させることができ、粒子表面にカルボキシ基をより均一に形成することができるので好ましい。

上記オゾン水における溶存オゾン濃度は特に限定されないが、好ましい下限は２０ｐｐｍである。溶存オゾン濃度が２０ｐｐｍ未満であると、カルボキシ基を形成するのに長時間を必要としたり、カルボキシ基の形成が不充分となって、検出対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができずに分離性能が低下したりすることがある。溶存オゾン濃度のより好ましい下限は５０ｐｐｍである。

上記オゾン水は、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報に記載されているように、水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。

アルカリ条件下においては、基材微粒子の表面に導入されたカルボキシ基はほぼ解離した状態にあり、核酸塩基中の僅かなカチオンとの間に弱いカチオン交換相互作用が生じると考えられる。
また、上記オゾン水によって処理することで、カルボキシ基の他、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成され、これらの親水性基の存在によって充填剤の表面と核酸との間に働く疎水性相互作用が弱まると考えられる。
従って、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合、主たる相互作用である充填剤表面と核酸との間に働くアニオン交換相互作用に加え、上述したように、弱いカチオン交換相互作用が働いたり、疎水性相互作用が弱まったりすることによって分離性能が向上するものと考えられる。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の基材微粒子の表面に導入される上記弱アニオン性基量は、上記強カチオン性基量以下であれば特に限定されない。

上記基材微粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる有機合成高分子系の微粒子、シリカ等の無機系の微粒子等を用いることができるが、有機合成高分子系の微粒子が好ましく、特に、疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子と、該疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなるものがより好ましい。

上記疎水性架橋重合体は、１種の疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体、２種以上の疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
また、必要に応じて、疎水性架橋性単量体及び疎水性非架橋性単量体以外の、反応性基を有する単量体を共重合させてもよい。

上記疎水性架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものが挙げられる。例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステルや、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル又はテトラ（メタ）アクリル酸エステルや、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。尚、（メタ）アクリレートは、アクリレート又はメタクリレートである。

上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、単量体１分子中にビニル基を１個有するものが挙げられる。例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。

上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記疎水性非架橋性単量体との共重合体の場合、疎水性架橋重合体における疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合が１０重量％未満であると、得られるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の耐圧性、耐膨潤性等が低下し、分離性能が低下することがある。

上記イオン交換基を有する親水性重合体は、イオン交換基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上のイオン交換基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含めばよい。即ち、上記イオン交換基を有する親水性重合体を形成させる方法としては、イオン交換基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、イオン交換基を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体とを共重合させる方法等が挙げられる。

上記イオン交換基を有する親水性単量体としては、上記強カチオン性基を有するものが好ましく、４級アンモニウム基を有するものがより好ましい。例えば、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラムの内圧が高くなり分離性能が悪くなることがある。平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり分離性能が悪くなることがある。

ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を制限酵素で処理した核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分析する際の溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。

上記溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡとを含むＴＥ緩衝液、トリスと酢酸とＥＤＴＡとを含むＴＡＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡとを含むＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。

上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。ｐＨがこの範囲にあれば、わずかながら核酸塩基にプラス電荷が存在し、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤の弱アニオン性基との間に弱いカチオン交換相互作用が働くので分離性能が向上すると考えられる。

上記塩化合物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩や、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。

上記溶離液の塩濃度としては、分離検出条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。

核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出方法も本発明の１つである。本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法について以下詳述する。

本発明の分離検出方法が適用可能な標的核酸（検出対象物質）としては、ウイルスの存在や型を判別するためのウイルス由来の核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、遺伝子多型（一塩基多型）を判別するためのヒト由来のＤＮＡ等を例示することができる。

上記、ＤＮＡ又はＲＮＡは、公知の方法によりＤＮＡ又はＲＮＡの抽出、精製の後、必要によりＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等により増幅し、該増幅産物を本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供する。

ウイルスがＲＮＡウイルスである場合等は、抽出、精製したＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応を行い、ＰＣＲ増幅産物を得ることができる。

また、本発明の分離検出方法を用いて遺伝子多型を判別する場合には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法として公知の技術を応用することができる。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ増幅産物中の遺伝子変異部を認識する制限酵素が存在する場合、共通配列部位にプライマーを設定し、その内側、すなわち、ＰＣＲ増幅産物内に多型性をもたせて増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を上記制限酵素で切断し、その断片の長さにより、多型の有無を判定する方法である。制限酵素による切断が起きた場合と起きなかった場合では、生じる断片の数もサイズも異なるので、それに基づいて切断が起きたか否か、ひいては目的の位置の塩基が何であったかを知ることができる。

プライマーによる増幅領域は、制限酵素による切断が起きた場合に生じる２個の断片が、それぞれ本発明のイオン交換クロマトグラフィーで明瞭に検出できるサイズ、好ましくは、小さい方の断片が１ｂｐ以上、さらに好ましくは２０ｂｐ以上となるように設定する。また、生じる２個の断片のサイズの差が、本発明の分離検出方法で明瞭に検出できるように、好ましくは、１ｂｐ以上、さらに好ましくは２０ｂｐ以上になるように設定する。増幅領域のサイズの上限は特にないが、あまりに大きいとＰＣＲの時間もコストもかかり、また、それによる利点もないので、好ましくは、１０００ｂｐ以下である。プライマーの塩基長は、それぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーの塩基長の例としては１５〜３０ｂｐ程度、好ましくは２０〜２５ｂｐ程度である。

ＰＣＲ法による増幅は、１段階で行なってもよいが、感度をより高めるために、第１段階のＰＣＲでより広い範囲の領域を増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を鋳型として、その中に含まれる領域を第２段階のＰＣＲでさらに増幅してもよい（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）。この場合、第２段階のＰＣＲに用いるプライマーは両方とも、第１段階のＰＣＲに用いるプライマーと異なるものであってもよいし、一方のみ異なるプライマーを用い、他方は第１段階のＰＣＲで用いたプライマーと同じものを用いてもよい（ｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）。

ＰＣＲ法自体は公知であり、そのためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。ＰＣＲ法に用いるプライマーの設計やＤＮＡの増幅の条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．），Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，ｐｐ．８．１−８．１２６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１を参照できる。

本発明によれば、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤をカラム充填剤として用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、標的核酸を短時間で精度よく分析できる分離検出方法を提供することができる。

実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて得られたクロマトグラムである。 比較例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて得られたクロマトグラムである。 比較例２の比較用カラムを用いて得られたクロマトグラムである。 実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用い、インフルエンザウイルスＡＨ１型、ＡＨ３型、Ｂ型を分離検出したクロマトグラムである。 実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用い、ＵＧＴ１Ａ１＊６のＷｉｌｄＴｙｐｅとＭｕｔａｎｔを分離検出したクロマトグラムである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（実施例１）
攪拌機付き反応器中、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性のイオン交換基（４級アンモニウム基）を有する単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解し、水溶液とした。この水溶液を上記反応器中にさらに添加し、前記と同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、基材微粒子の表面に４級アンモニウム基を有する重合体粒子を得た。

得られた重合体粒子１０ｇを溶存オゾン濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ」）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。
この操作を２回繰り返して重合体粒子にオゾン水処理を施し、基材微粒子の表面に４級アンモニウム基とカルボキシ基をと有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径を、粒度分布計Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。

（比較例１）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、４級アンモニウム基のみを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径は、実施例１と同様に１０μｍであった。

（比較例２）
比較用カラムとして、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＮＡ−ＳＴＡＴ（東ソー社製、カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ１００ｍｍ、イオン交換基：４級アンモニウム基）を準備した。

＜評価＞
（１）分離性能の確認Ａ
実施例１及び比較例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を、液体クロマトグラフィーシステムのエンプティカラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。
得られたカラムを用いて、以下の条件で分離性能の比較を行った。実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて得られたクロマトグラムを図１に示し、比較例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて得られたクロマトグラムを図２に示した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
第２液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加（ｐＨ７．５）
溶出法：第１液と第２液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間０分から３０分にかけて、第２液の混合比率を直線的に増加させた。
０分（第２液 ０％）→３０分（第２液 １００％）
検体：２０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒマーカー（タカラバイオ社製）
２０ｂｐ、４０ｂｐ、６０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、１８０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐの断片が含まれる。
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

図１と図２との比較から、強カチオン性基と弱アニオン性基とが共存するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用した実施例１の方が、強カチオン性基のみを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用した比較例１より分離性能が優れていることが確認できた。

（２）分離性能の確認Ｂ
比較例２の比較用カラムを用いて、以下の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図３に示した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
第２液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加（ｐＨ７．５）
溶出法：第１液と第２液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間０分から３０分にかけて、第２液の混合比率を直線的に増加させた。
０分（第２液 ７５％）→３０分（第２液 １００％）
検体：２０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒマーカー（タカラバイオ社製）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

図１と図３との比較から、実施例１は、比較例２よりも用いているカラム長さが短いにも関わらず、分離性能が優れていることが分かった。本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用すれば、従来の充填剤を使用した場合に対し、より短いカラム長で、高い分離性能を得ることができることが確認された。

（３）分離性能の確認Ｃ
実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて、以下の条件で、インフルエンザウイルスのＰＣＲ増幅産物に対する分離性能の確認を行った。得られたクロマトグラムを図４に示した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
第３液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを添加（ｐＨ７．５）
溶出法：第１液と第３液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間０分から５分にかけて、第３液の混合比率を直線的に増加させた。
０分（第３液 ６０％）→５分（第３液 １００％）
検体：以下に示す３種類のインフルエンザウイルス株より精製したＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
ＡＨ１型株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）、ＰＣＲ産物４３１ｂｐ
ＡＨ３型株（Ａ／Ｕｒｕｇａｙ／７１６／２００７）、ＰＣＲ産物１１４１ｂｐ
Ｂ型株（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）、ＰＣＲ産物３２９ｂｐ
ＲＮＡの精製には、ＲＮＡ精製用キット（ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いた。
ＲＴ−ＰＣＲには、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いた。
また、ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは、以下の文献に記載されているものを用いた。
ＡＨ１型、Ｂ型・・・感染症学雑誌 第７１巻 第６号
＜ＡＨ１型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ＴＧＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＴ（配列番号２）
＜Ｂ型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡＴＧＡ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴ（配列番号４）
ＡＨ３型・・・インフルエンザ診断マニュアル平成１４年４月版（国立感染研究所発行）
＜ＡＨ３型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＴＴＣ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（配列番号６）
流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
図４に示したように、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いることにより、３種類のＰＣＲ増幅産物のピークは、分離検出時間５分という短時間で高精度に分離することができ、インフルエンザウイルスの型を判別できることが分かった。また、ＰＣＲ原料等に由来するピークから良好に分離することができ、これらのピークの干渉を受けないことも分かった。

（４）分離性能の確認Ｄ
実施例１で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて、以下の条件で、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を行った。得られたクロマトグラムを図５に示した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
第２液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加（ｐＨ７．５）
溶出法：第１液と第２液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間０分から５分にかけて、第２液の混合比率を直線的に増加させた。
０分（第２液 ０％）→５分（第２液 １００％）
検体：ＵＧＴ１Ａ１の配列を組み込んだプラスミドコントロールを用いて、ＵＧＴ１Ａ１＊６領域をＰＣＲ反応により増幅した。次に、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢｓｍＢ１により切断した。
このようにして、ＵＧＴ１Ａ１＊６のＷｉｌｄＴｙｐｅとＭｕｔａｎｔを準備した。
なお、ＰＣＲには、以下のプライマーを使用した。
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ｔｇｇａｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ａａｇａｃａｃｇｃｔｇｃａｃｃａａａｔａａ（配列番号８）
ＰＣＲ増幅産物のサイズ；７０６ｂｐ
また、制限酵素として、以下のものを使用した。
ＢｓｍＢＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
認識部位；
５´・・・ＣＧＴＣＴＣＮ・・・３´
３´・・・ＧＣＡＧＡＧＮＮＮＮＮ・・・５´
ＮはＡ又はＴ又はＣ又はＧを表す。
流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
図５に示したように、ＵＧＴ１Ａ１＊６のＷｉｌｄＴｙｐｅは制限酵素によって切断され、２３５ｂｐと４７１ｂｐの二つのピークが確認された。一方で、ＵＧＴ１Ａ１＊６のＭｕｔａｎｔは制限酵素の認識部位を持たないため切断されず、一つのピーク（７０６ｂｐ）として確認された。この結果から、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いることにより、分離検出時間５分という短時間で一塩基多型を検出できることが分かった。また、ＰＣＲ原料等に由来するピークから良好に分離することができ、これらのピークの干渉を受けないことも分かった。

本発明によれば、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤をカラム充填剤として用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、標的核酸を短時間で精度よく分析できる分離検出方法を提供することができる。

Claims (9)

1. 基材微粒子の表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いる、標的核酸の分離検出方法。
2. 標的核酸は、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、又は核酸の制限酵素断片である、請求項１記載の標的核酸の分離検出方法。
3. 標的核酸は、ウイルス由来又はヒト由来のものである、請求項１又は２記載の標的核酸の分離検出方法。
4. 強カチオン性基は、４級アンモニウム基である、請求項１、２又は３記載の標的核酸の分離検出方法。
5. 弱アニオン性基は、カルボキシ基である、請求項１、２、３又は４記載の標的核酸の分離検出方法。
6. 基材微粒子は、有機合成高分子からなる、請求項１、２、３、４又は５記載の標的核酸の分離検出方法。
7. 強カチオン性基と弱アニオン性基は、それぞれ独立した単量体に由来するものである、請求項１、２、３、４、５又は６記載の標的核酸の分離検出方法。
8. イオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出に用いられるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤であって、基材微粒子の表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する、標的核酸分離検出用イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
9. 請求項８記載の標的核酸分離検出用イオン交換クロマトグラフィー用充填剤が充填された、標的核酸分離検出用イオン交換クロマトグラフィー用カラム。

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