JP2012032375A - 液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法を提供する。
【解決手段】オゾン処理したカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法に関する。

近年、様々な遺伝子検査技術が開発されており、検出対象物質を、短時間で高精度に分離検出することが重要になっている。例えば、検出対象物質が核酸の場合、核酸が有するリン酸基のマイナス電荷を利用したアニオン交換クロマトグラフィー（特許文献１及び特許文献２）、逆相クロマトグラフィー（特許文献３）、ゲルクロマトグラフィー（特許文献４）、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィー（特許文献５）、種々のリガンドを固定したカラム充填剤を用いたアフィニティクロマトグラフィー（特許文献６）等の方法がある。なかでも、アニオン交換クロマトグラフィーは分離性能に優れており、核酸類を鎖長別に分離検出できる。

しかし、従来のカラム充填剤は、検出対象物質を短時間で分離検出する場合の分離性能が不充分である。分離性能は、カラム長を長くすることで向上させることができるが、カラム長を長くすると、分離時間が長くなり、カラム圧力が高くなる。カラム圧力が高くなると、耐圧性の大きな装置が必要となるため、装置が高価になるという問題が生じる。

特表平０９−５０５４０２号公報 特表２００９−５１８６２７号公報 特表２００２−５０６４２５号公報 特開昭６３−２４５６９８号公報 特開平１０−１５３５８９号公報 特開２００６−１２２８５１号公報

本発明は、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法の提供を目的とする。

本発明は、オゾン処理したカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法である。

本発明者らは液体クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤として、オゾン処理したカラム充填剤を用いることにより、核酸を短時間で高精度に分離検出できることを見出した。
この分離性能を向上させる効果は、従来から行われているオゾン処理による非特異吸着の抑制効果とは異なり、核酸の分離検出時において認められる特有の効果である。
以下に本発明を詳述する。

本発明の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法（以下、本発明の分離検出方法ともいう）に用いるカラム充填剤のオゾン処理は、カラム充填剤とオゾンとを接触させることにより行う。カラム充填剤と接触させるオゾンの形態は、オゾンガス、又は、オゾンガスを溶解した水（以下、オゾン水という）が好ましい。より好ましくはオゾン水による処理である。

カラム充填剤とオゾンとを接触させる方法は、例えば、カラム充填剤をオゾン水に浸漬する方法、カラム充填剤をエンプティカラムに充填した後、得られたカラムにオゾン水を通液する方法等が挙げられる。

オゾン水中のオゾン濃度の好ましい下限は２０ｐｐｍである。オゾン濃度が２０ｐｐｍ未満であると、オゾン処理に長時間を要したり、オゾン処理の効果が不充分なため、カラム充填剤の分離性能が悪くなることがある。オゾン濃度のより好ましい下限は５０ｐｐｍである。

オゾン水の製造方法としては、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報に開示されている、原料水に透過膜を介してオゾンガスを溶解させる方法等が挙げられる。また、オゾン処理の際には、特開２００７−１７８４１７号公報に開示されているオゾンによる酸化を促進する方法を併用してもよい。更に、カラム充填剤とオゾンとを接触させる時に、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等のオゾンの分解を促進する方法を併用できる。

オゾン処理するカラム充填剤は、少なくとも表面に強カチオン性基を有することが好ましい。
本明細書において「強カチオン性基」とは、ｐＨ１〜１４の全ての範囲で解離するカチオン性基を意味する。即ち、強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。

強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が好ましい。
４級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。

強カチオン性基量の好ましい下限は、カラム充填剤の乾燥重量１ｇあたり１μｅｑ、好ましい上限は、カラム充填剤の乾燥重量１ｇあたり５００μｅｑである。強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、カラム充填剤の保持力が弱く、分離性能が悪くなることがある。強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、カラム充填剤の保持力が強くなりすぎ、短時間で溶出させることが困難になる。

少なくとも表面に強カチオン性基を有するカラム充填剤は、（１）強カチオン性基を有する単量体を重合させたカラム充填剤、（２）強カチオン性基に変換可能な官能基（以下、反応性基という）を有する単量体を重合させた後、反応性基を強カチオン性基に変換させたカラム充填剤等が好ましい。より好ましくは（１）のカラム充填剤である。

上記（１）のカラム充填剤を構成する強カチオン性基を有する単量体としては、４級アンモニウム基を有する単量体が好ましい。
４級アンモニウム基を有する単量体としては、（メタ）アクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等のアクリル系単量体が挙げられる。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また本明細書において「（メタ）アクリル」とは、「アクリル又はメタクリル」であることを示す。

上記（２）のカラム充填剤を構成する単量体が有する反応性基は、非イオン性の官能基が好ましく、例えば、エステル結合、疎水性基、環状構造基、水酸基、エポキシ基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、エポキシ基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましい。

これらの反応性基を有する単量体としては、例えば、水酸基を有する（メタ）アクリレート類、エポキシ化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化（メタ）アクリレート類、シアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
なお、本明細書において「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」であることを示す。

水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類や、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

エポキシ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。

アルデヒド化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン等が挙げられる。

シアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、シアノ（メタ）アクリレート、エチル−２−シアノアクリレート等が挙げられる。

反応性基を強カチオン性基に変換する方法としては、例えば、反応性基がエポキシ基の場合、エポキシ基を有する重合体粒子を水又は有機溶媒中に分散し、エポキシ基を活性化した後、３級アミン類を反応させる方法等が挙げられる。
反応させる３級アミン類としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、１−メチルピペリジン、１−メチルピロリジン、ピリジン、メチルピリジン類等が挙げられる。

本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤は、強カチオン性基に加えて、弱アニオン性基を少なくとも表面に有することがより好ましい（以下、強カチオン性基及び弱アニオン性基を合わせて、単にイオン交換基ともいう）。
弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシル基が好ましい。

弱アニオン性基量の好ましい下限は、カラム充填剤の乾燥重量１ｇあたり１μｅｑ、好ましい上限は、カラム充填剤の乾燥重量１ｇあたり５００μｅｑである。弱アニオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、弱アニオン性基によるイオン交換反応が弱く、分離性能が悪くなることがある。弱アニオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、弱アニオン性基が、強カチオン性基によるイオン交換反応を阻害し分離性能が悪くなることがある。

少なくとも表面に弱アニオン性基を有するカラム充填剤は、（３）弱アニオン性基を有する単量体を重合させたカラム充填剤、（４）弱アニオン性基に変換可能な官能基を有する単量体を重合させた後、該弱アニオン性基に変換可能な官能基を弱アニオン性基に変換させたカラム充填剤等が好ましい。より好ましくは（３）のカラム充填剤である。

上記（３）のカラム充填剤を構成する弱アニオン性基を有する単量体としては、弱アニオン性基を有するが強カチオン性基を有しない単量体が好ましく、弱アニオン性基としてカルボキシル基を有する単量体がより好ましい。このような単量体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸、メサコン酸、イソクロトン酸、シトラコン酸、β−カルボキシエチルアクリレート等が挙げられる。

上記（４）の弱アニオン性基に変換可能な官能基は、上記（２）の反応性基と同様である。以下、弱アニオン性基に変換可能な官能基も反応性基という場合がある。
反応性基を弱アニオン性基に変換する方法としては、例えば、アミノ基にカルボキシル基を有するシランカップリング剤を反応させる方法、水酸基にハロゲン化酢酸類やアルデヒド化合物を反応させる方法、エポキシ基にカルボキシル基を有する化合物を反応させる方法、エステル基を加水分解する方法、反応性基のエポキシ基を開環反応させる方法、不飽和結合等の疎水性基を紫外線やプラズマ照射等の公知の酸化処理反応によって酸化する方法等が挙げられる。

反応性基が水酸基である場合、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類を、水酸化アルカリ水溶液中で反応させることによりカルボキシル基を導入することができる。

反応性基がアルデヒド基である場合、酸触媒下にてアセタール化反応により水酸基と反応させることにより、カルボキシル交換基を導入することができる。また、トリカルバリル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物と水酸基の脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。

反応性基がエポキシ基である場合、グリコール酸等のカルボン酸化合物を反応させる方法等によりカルボキシル基を導入することができる。

反応性基がアミノ基である場合、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、上述した反応性基がエポキシ基の場合と同様の処理を行うことによりカルボキシル基を導入することができる。

本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤が、少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する場合、強カチオン性基と弱アニオン性基とは、両者とも重合反応により導入されてもよいし、両者とも変換により導入されてもよい。また、それぞれ別々の方法により導入されてもよい。即ち、強カチオン性基が重合反応により導入され、弱アニオン性基が変換による方法により導入されてもよいし、強カチオン性基が変換により導入され、弱アニオン性基が重合反応により導入されてもよい。

本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤は、ポリアクリレート等の有機合成高分子系の架橋重合体粒子や、シリカ等の無機高分子系の架橋重合体粒子に、上記（１）〜（４）等の方法によりイオン交換基を導入した充填剤であることが好ましい。なかでも、有機合成高分子系の架橋重合体粒子が好ましい。

上記架橋重合体粒子は、少なくとも１種の架橋性単量体を重合した架橋重合体粒子、又は、少なくとも１種の架橋性単量体及び少なくとも１種の非架橋性単量体を共重合した架橋重合体粒子が好ましい。

架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類、芳香族系架橋性単量体類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる

ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。

分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

芳香族系架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等が挙げられる。

これらの架橋性単量体は単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。特にアクリル系単量体が好ましい。

架橋重合体粒子を構成する非架橋性単量体としては、上記反応性基を有する単量体、（メタ）アクリル酸アルキル類、芳香族系非架橋性単量体等が挙げられる。
（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
芳香族系非架橋性単量体としては、例えば、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。なかでも、アクリル系単量体が好ましい。

架橋重合体粒子が、架橋性単量体と非架橋性単量体との共重合体からなる場合、該共重合体における架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％である。架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合が１０重量％未満であると、架橋重合体粒子の耐圧性、耐膨潤性が低下し、カラム充填剤として用いた場合の分離性能が悪くなる。架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合のより好ましい下限は２０重量％である。

本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤の平均粒子径の好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満の場合、カラム圧が高くなり分離性能が悪くなることがある。平均粒子径が２０μｍを超える場合、カラム内のデッドボリュームが大きくなり分離性能が悪くなることがある。

本発明の分離検出方法は、ウイルス由来の核酸及びヒト由来の核酸を分離検出できる。例えば、ウイルス由来の核酸を分離検出し、ウイルスの存在や型を判別することができる。また、ヒト由来の核酸を分離検出し、ヒト遺伝子の一塩基多型を含む遺伝子多型を判別することができる。

測定対象の核酸としては、公知の方法により抽出及び精製した核酸、又は、精製した核酸を公知のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等により増幅した増幅産物等が挙げられる。また、これらの核酸やＰＣＲ増幅産物を、制限酵素により切断した制限酵素断片等が挙げられる。

本発明の分離検出方法に用いる溶離液は公知の溶離液を用いることができる。特に、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス及びＥＤＴＡを含むＴＥ緩衝液、トリス、酢酸、及びＥＤＴＡを含むＴＡＥ緩衝液、トリス、ホウ酸、及びＥＤＴＡを含むＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。

溶離液は塩類を含有してもよい。
塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のアルカリ金属のハロゲン化物や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のアルカリ土類金属のハロゲン化物等が挙げられる。また、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。

溶離液のｐＨの好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。ｐＨが５未満であると、充填剤が弱アニオン性基を有する場合、弱アニオン性基の解離度が減少して分離性能が低下する。ｐＨが１０を超えると、クロマトグラムが変形し測定精度が低下する。溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。

溶離液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明によれば、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる分離検出方法を提供できる。

実施例１のカラムを用いて、ＤＮＡラダーマーカーを分離したクロマトグラムである。 実施例３のカラムを用いて、ＤＮＡラダーマーカーを分離したクロマトグラムである。 比較例１のカラムを用いて、ＤＮＡラダーマーカーを分離したクロマトグラムである。 比較例３のカラムを用いて、ＤＮＡラダーマーカーを分離したクロマトグラムである。 実施例２のカラムを用いて、インフルエンザウイルスＡＨ１型、ＡＨ３型、Ｂ型の遺伝子のＰＣＲ増幅産物を分離したクロマトグラムである。 実施例２のカラムを用いて、ＵＧＴ１Ａ１の野生型及び変異型遺伝子のＰＣＲ増幅産物を分離したクロマトグラムである。 比較例４のカラムを用いて、ヒトヘモグロビンを分離したクロマトグラムである。

（実施例１）
実施例１では、強カチオン性基として４級アンモニウム基を有するカラム充填剤を調製した。
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製、４級アンモニウム基を有する単量体）１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１２時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、粒度分布測定装置（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、「Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０」）を用いて測定した結果、１０μｍであった。

得られた架橋重合体粒子１０ｇを、オゾン水製造システム（積水化学工業社製）により調製されたオゾン水（オゾン濃度１００ｐｐｍ）３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ」）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返して、オゾン処理したカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填し、カラムを得た。

（実施例２）
実施例２では、強カチオン性基として４級アンモニウム基を有するカラム充填剤を調製した。
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、５０重量％のメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液２００ｇを反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例１と同様の方法で測定した結果、１０μｍであった。
実施例１と同様にオゾン処理をし、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填し、カラムを得た。

（実施例３）
実施例３では、強カチオン性基として４級アンモニウム基を、弱アニオン性基としてカルボキシル基を有するカラム充填剤を調製した。
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、５０重量％のメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液２００ｇ、及び、２０ｇのメタクリル酸（和光純薬工業社製、カルボキシル基を有する単量体）を反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基及びカルボキシル基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例１と同様の方法で測定した結果、１０μｍであった。
実施例１と同様にオゾン処理をし、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填し、カラムを得た。

（比較例１）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例１と同様の操作を行い、カラムを得た。

（比較例２）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例２と同様の操作を行い、カラムを得た。

（比較例３）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例３と同様の操作を行い、カラムを得た。

＜評価１＞
（１）分離性能の評価１：ＤＮＡラダーマーカーの検出
実施例１〜３、及び、比較例１〜３のカラムを用いて、下記の条件でＤＮＡラダーマーカーを分離検出し、分離性能の比較を行った。
システム ：ＬＣ−２０Ａシステム（島津製作所社製）
溶離液Ａ ：２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ：１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶出条件 ：分離時間０分から３０分にかけて、溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法
０分（溶離液Ａ１００％）→３０分（溶離液Ｂ１００％）
測定試料 ：２０ｂｐＤＮＡラダーマーカー（タカラバイオ社製）
（２０ｂｐ、４０ｂｐ、６０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐの断片が含まれる）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

実施例１で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図１に、実施例３で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図３に、比較例３で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図４に示す。なお、実施例２で得られたカラムを用いた場合は図１と同様のクロマトグラムが得られ、比較例２で得られたカラムを用いた場合は図３と同様のクロマトグラムが得られた。
図１と図３、図２と図４とをそれぞれ比較した結果、オゾン処理したカラム充填剤を用いた場合は、オゾン処理をしなかったカラム充填剤を用いた場合に比べて、より短い分離時間で高い分離性能を示した。特に、オゾン処理によってピーク７〜１２の分離性能が向上した。

（２）分離性能の評価２：インフルエンザウイルスの型判別検出
実施例２で得られたカラムを用いて、下記の条件でインフルエンザウイルスのＰＣＲ増幅産物を分離検出し、ウイルスの型の判別を行った。
システム ：ＬＣ−２０Ａシステム（島津製作所社製）
溶離液Ａ ：２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｃ ：１ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶出条件 ：分離時間０分から５分にかけて、溶離液Ｃの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法
０分（溶離液Ａ４０％、溶離液Ｃ６０％）→５分（溶離液Ｃ１００％）
測定試料 ：下記に示す３種類のインフルエンザウイルス株より精製したＲＮＡの、ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物
・ＡＨ１型株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）、得られたＰＣＲ増幅産物のサイズ：４３１ｂｐ
・ＡＨ３型株（Ａ／Ｕｒｕｇａｙ／７１６／２００７）、得られたＰＣＲ増幅産物のサイズ：１１４１ｂｐ
・Ｂ型株（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）、得られたＰＣＲ増幅産物のサイズ：３２９ｂｐ
・ＲＮＡ精製用キット：ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）
・ＲＴ−ＰＣＲキット：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）
・ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマー：
ＡＨ１型、Ｂ型・・・感染症学雑誌 第７１巻 第６号
＜ＡＨ１型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ｔｇａｇｇｇａｇｃａａｔｔｇａｇｔｔｃａ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ｔｇｃｃｔｃａａａｔａｔｔａｔｔｇｔｇｔ（配列番号２）
＜Ｂ型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ａａｔｃｔｔｃｔｃａｇａｇｇａｔａｔｇａ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ｔｔｇｇｃａｇａｔｇａｇｇｔｇａａｃｔｔ（配列番号４）
ＡＨ３型・・・インフルエンザ診断マニュアル平成１４年４月版（国立感染研究所発行）
＜ＡＨ３型株用プライマー＞
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ａｇｃａａａａｇｃａｇｇｇｇａｔａａｔｔｃ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ｔｇｃｃｔｇａａａｃｃｇｔａｃｃａａｃｃ（配列番号６）
流速 ：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

得られたクロマトグラムを図５に示す。３種類のＰＣＲ増幅産物のピークは約５分間で分離でき、インフルエンザウイルスの型を判別できた。また、ＰＣＲ増幅産物のピークは、ＰＣＲ原料等に由来するピークから良好に分離できた。

（３）分離性能の評価３：一塩基多型の測定
実施例２で得られたカラムを用いて、下記の条件で、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）の野生型遺伝子と変異型遺伝子のＰＣＲ増幅産物を分離検出し、一塩基多型の判別を行った。
システム ：ＬＣ−２０Ａシステム（島津製作所社製）
溶離液Ａ ：２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ：１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶出条件 ：分離時間０分から５分にかけて、溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法
０分（溶離液Ａ１００％）→５分（溶離液Ｂ１００％）
試料 ：ＵＧＴ１Ａ１の野生型遺伝子と変異型遺伝子（野生型遺伝子の一塩基多型：ＵＧＴ１Ａ１＊６）の、変異領域のＰＣＲ増幅産物とその制限酵素断片
・ＰＣＲに用いたプライマー：
５´−３´
Ｆｏｒｗａｒｄ；ｔｇｇａｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ；ａａｇａｃａｃｇｃｔｇｃａｃｃａａａｔａａ（配列番号８）
・ＰＣＲ増幅産物のサイズ：７０６ｂｐ
・使用した制限酵素：ＢｓｍＢＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
認識部位；
５´・・・ｃｇｔｃｔｃｎ・・・３´（配列番号９）
３´・・・ｇｃａｇａｇｎｎｎｎｎ・・・５´（配列番号１０）
（上記ｎは、ａ又はｔ又はｃ又はｇを表す）
流速 ：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

得られたクロマトグラムを図６に示す。ＵＧＴ１Ａ１の野生型遺伝子のＰＣＲ増幅産物を測定した場合は、制限酵素によって切断された２３５ｂｐと４７１ｂｐの二つの断片が検出された。変異型遺伝子（ＵＧＴ１Ａ１＊６）のＰＣＲ増幅産物を測定した場合は、制限酵素の認識部位を持たないために切断されず、一つのピーク（７０６ｂｐ）として検出された。この結果から、測定時間５分で一塩基多型を判別できることが分かった。また、ＰＣＲ増幅産物と制限酵素断片のピークは、ＰＣＲ原料等に由来するピークから良好に分離できた。

以下の比較例４及び比較例５では、分離検出対象が核酸以外の場合において、オゾン処理がカラム充填剤の分離性能に及ぼす効果を確認するため、強アニオン性基以外のイオン交換基を有するカラム充填剤を調製した。

（比較例４）
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、５０重量％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製、スルホン酸基を有する単量体）水溶液２００ｇを反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例１と同様に測定した結果、１０μｍであった。

得られた架橋重合体粒子１０ｇを、実施例１と同様に操作してオゾン処理したカラム充填剤を得た。カラム充填剤を、エンプティカラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填し、カラムを得た。

（比較例５）
比較例４で得られた架橋重合体粒子を、オゾン処理せずに同様のエンプティカラムに充填し、カラムを得た。

＜評価２＞
（１）分離性能の評価４：ヘモグロビン類の検出
比較例４及び比較例５で得られたカラムを用いて、下記の条件でヒト血液中のヘモグロビン類を分離検出し、分離性能の比較を行った。
システム ：ＬＣ−２０Ａシステム（島津製作所社製）
溶離液Ｄ ：３０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｅ ：２２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）
溶出条件 ：溶離液Ｄ１００％から溶離液Ｅ１００％へのステップグラジエント
試料 ：フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１８０倍に溶血希釈したもの
流速 ：１．５ｍＬ／分
検出波長 ：４１５ｎｍ

比較例４で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図７に示す。比較例４で得られたカラムは、４５秒間でヘモグロビンＡ１ｃが良好に分離できた。比較例５で得られたカラムの場合も同様のクロマトグラムが得られた。即ち、オゾン処理による分離性能への影響は認められなかった。

（２）分離性能の評価５：修飾ヘモグロビン類の検出
比較例４及び比較例５で得られたカラム、並びに、分離性能の評価７の測定条件を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類の分離を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血試料に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血試料に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血試料に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。

分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血試料（非修飾品）のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表１に示す。
比較例４及び比較例５で得られたカラムは、ともにΔ値が０．２％以下と小さく、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが分離できた。
分離性能の評価４及び５の結果から、オゾン処理によるカラム充填剤の分離性能の向上効果は、核酸の分離検出時において認められる特有の効果であることが確認できた。

本発明によれば、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる分離検出方法を提供できる。

１ ＤＮＡラダーマーカー（２０ｂｐ）
２ ＤＮＡラダーマーカー（４０ｂｐ）
３ ＤＮＡラダーマーカー（６０ｂｐ）
４ ＤＮＡラダーマーカー（８０ｂｐ）
５ ＤＮＡラダーマーカー（１００ｂｐ）
６ ＤＮＡラダーマーカー（１２０ｂｐ）
７ ＤＮＡラダーマーカー（１４０ｂｐ）
８ ＤＮＡラダーマーカー（１６０ｂｐ）
９ ＤＮＡラダーマーカー（２００ｂｐ）
１０ ＤＮＡラダーマーカー（３００ｂｐ）
１１ ＤＮＡラダーマーカー（４００ｂｐ）
１２ ＤＮＡラダーマーカー（５００ｂｐ）
２１ ＰＣＲ原料に由来する物質
２２ ＡＨ１型株遺伝子のＰＣＲ増幅産物（３２９ｂｐ）
２３ ＡＨ３型株遺伝子のＰＣＲ増幅産物（４３１ｂｐ）
２４ Ｂ型株遺伝子のＰＣＲ増幅産物（１１４３ｂｐ）
３１ ＰＣＲ原料に由来する物質
３２ ＵＧＴ１Ａ１野生型遺伝子のＰＣＲ増幅産物（２３５ｂｐ）
３３ ＵＧＴ１Ａ１野生型遺伝子のＰＣＲ増幅産物（４７１ｂｐ）
３４ ＵＧＴ１Ａ１変異型遺伝子のＰＣＲ増幅産物（７０６ｂｐ）
４１ ヘモグロビンＦ
４２ ヘモグロビンＡ１ｃ
４３ ヘモグロビンＡ０

Claims (6)

1. オゾン処理したカラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
2. カラム充填剤は、少なくとも表面に強カチオン性基を有することを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
3. 強カチオン性基は、４級アンモニウム基であることを特徴とする請求項２記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
4. カラム充填剤は、更に、少なくとも表面に弱アニオン性基を有することを特徴とする請求項２又は３記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
5. 弱アニオン性基は、カルボキシル基であることを特徴とする請求項４記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。
6. カラム充填剤は、架橋重合体粒子からなることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。

Images