JPS61257236A - クロマトグラフイ−分離媒体及び該媒体を用いるクロマトグラフイ−分離方法 - Google Patents

クロマトグラフイ−分離媒体及び該媒体を用いるクロマトグラフイ−分離方法

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JPS61257236A
JPS61257236A JP61065555A JP6555586A JPS61257236A JP S61257236 A JPS61257236 A JP S61257236A JP 61065555 A JP61065555 A JP 61065555A JP 6555586 A JP6555586 A JP 6555586A JP S61257236 A JPS61257236 A JP S61257236A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クロマトグラフィー分離媒体及び該媒体を用
いるクロマトグラフィー分離方法に係り、特にクロマト
グラフィー分離に用いられる固体媒体及び該固体媒体の
充填床を通過させることによる液体試料中の成分の分離
方法に関する。
本発明は、主として少量の試料サイズの蛋白質混合部の
迅速な分析的分離方法を指向するものである。
〔従来の技術及びその問題点〕
イオン交換クロマトグラフィーによる蛋白質混合部の分
離は周知であり、既存の媒体はミリグラム量の蛋白質を
含有する試料の分離を可能とするものであるが、そのた
めに典型的混合部中の全成分を溶出させるのに２０分以
上を必要とする妥協的な設計となっている。
少量サイズの試料を短時間で分離することが益々要求さ
れてきており、このことは、迅速かつ定量的に多数の試
料を分析することを必要とする臨床分野において特に当
てはまる。多くの場合、分析に使用し得る試料の量は非
常に少量であり、少容積かつ迅速分離時間の高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）カラムを用いるのが
適当である。
このようなカラムにおいて固定相として用いられる既存
の材料は、その表面に結合したイオン交換官能基を有す
る多孔性支持体から一般的になり、前記の官能基の主要
部分は空孔内部に存在し、ている。孤立した点電荷及び
短いポリカチオン性又はポリアニオン性連鎖が官能基と
して用いられているが、これらの媒体は大型のカラムに
は好適であるが、迅速な分離が要求される場合には完全
な分離を行うことができない。
ｃ問題点を解決するための手段〕 実質的に非多孔性の不活性固体担体からなり、該担体の
表面には重合体連鎖が結合しており、各連鎖が複数の結
合部位を有する分離媒体を用いることにより、蛋白質混
合部の小体積試料、特に約５００ミクログラム以下のオ
ーダーの蛋白質試料、なかんずく約２００ミクログラム
以下の蛋白質試料を小型カラムを用いて極めて短時間に
しかも高分解姥で分離し得ることを本発明者は今回見い
出した。
従来技術の材料においてはその空孔によってその表面積
を著しく増加させていたが、本発明の媒体はそのような
ことをすることなく複数の蛋白質を個々のバンド（帯）
に分離することを可能とし、これらのバンドを常法によ
り検出することにより極めて短時間に高度に正確な分析
を可能にする。
従って本発明は広範囲の分離機構（手法）及び分離混合
物に対して有用である。
本発明の媒体は固相媒体であり、好ましくはＨＰＬＯ（
高速液体クロマトグラフィー）に使用するに好適なビー
ズ状物質の形態をしている。従来技術のマクロポーラス
媒体やメソポーラス媒体と異なり、本発明の媒体におい
て官能基を担持するベース材料は実質的に非多孔性であ
る。なお「非多孔性」とは本明細書においてはミクロポ
ーラス媒体すなわち小粒子直径、低空孔体積及び小表面
積によって特徴付けられる媒体を含むものとする。
従って、流動層（積動相）が充填床を通過する際の流動
層中の溶質（Ｓｏｌｕｔｅｓ）と固定層との間のクロマ
トグラフィー相互作用は空孔中ではなく固相の外表面上
で実質的に全て起こる。
本発明のベース材料は０．５〜３０ミクロン、好ましく
は０．１°〜１０ミクロンの粒子直径を有する。
窒素吸着−脱着（Ｂ−Ｅ−Ｔ）分析により分析すると本
発明のベース材料は乾燥材料１ｇ当り１００ミクロリツ
トル以下、好ましくは２５ミクロリツトル以下の空孔体
積を有する０本発明で用いられる７ミクロンの平均粒子
直径を有するビーズの場合、Ｂ−Ｅ−Ｔ分析は５．０イ
／ｇ以下、好ましくは１，５ｎ（／ｇ以下の表面積を示
す。ビーズは直径が小さくなるにつれて表面積が大きく
なる。
ゲルｆ過実験のための標品として調製された成分混合物
が担体ベースのミクロポーラス性を示すために用いられ
得る。これらの成分は分子量が１３５０　（ジアノコバ
ラミン）から６７０，０００（チログロブリン）に至る
範囲にある。バイオ−シル（Ｂｉｏ−５ｉｌ）　Ｔ　Ｓ
　Ｋ　−２５０（商標、米国カリフォルニア州すッチモ
ンドに所在するバイオ−ランドラボラトリーズ社（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製〕の如き典
型的なゲルＩ過カラムを通過させた場合に、この蛋白質
混合物は分子サイズの変化に応じて個々のピークに分離
して出て（るが、この混合物を、本発明において用いら
れる担体ベース（誘導体化する前のもの）からなる相応
する大きさの充填床を通過させた場合には分離が起こら
ず全ての成分が単一ピークとして出てくる。このことは
、１３５０以上の分子量を有する成分は担体ベース中を
透過（侵入）しないことを意味する。
本発明の目的のために担体の表面は上述の重合体連鎖と
共有結合し得るか又は共有結合し得る活性部位を与える
ために化学的誘導体化（Ｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｒｉｖａ
ｔｉｚａｔｉｏｎ）　Ｌ／得るものでなければならない
。
従って、裸の担体は、その表面に露出された反応性の基
、例えば水酸基、エポキシド基、カルボキシル基、アシ
ルハライド側鎖又はアルデヒドを有するものを用いるの
が便利である。
ビーズそれ自身は有機材料又は無機材料のいずれでも良
く、を機材材の例として、メタクリレート樹脂、例えば
ポリ　（ヒドロキシプロピルメタクリレート）、ポリ　
（グリシジルメタクリレート）及びこれらの種々の共重
合体があり、これらはエチレングリコールジメタクリレ
ート及びジエチレングリコールジメタクリレートの如き
架橋剤を含むものである。無機材料の例としてガラス及
びシリカがある。
担体ベースは、これに接触する物質に対して不活性な剛
性表面を有し、広いｐＨ範囲に亘ってその状態を保持す
るものが好ましい、担体ベースそれ自身は分離される混
合物中のいかなる物質に対しても結合性を実質的に有さ
す、これによってビーズ表面に結合された重合体連鎖中
の官能基以外のビーズ部分上の非特異的な結合を回避す
るのが更に好ましい。
従って、蛋白質及び核酸の分離においては、担体ベース
は性質が親水性であって、その結果それが誘導体化され
た後に自由表面（Ｆｒｅｅ　５ｕｒｆａｃｅ）、すなわ
ち分析約分Ｍ操作時にキャリア流体に接触する表面は親
水性であるのが好ましい。
ＨＰＬＣに用いる時には、担体ベースは実質的に球形の
ビーズからなるのが好ましい。ビーズの粒子直径はＨＰ
ＬＣシステムにおける逆圧及び流速を考慮して広範囲に
変動させることができるが、多くの場合に、約０．５〜
約３０ミクロン、好ましくは約１〜約１０ミクロンの平
均粒子直径を有するビーズが最良の結果を与える。
ビーズに結合される重合体連鎖は、その各単位が分析さ
れる試料中の成分と相互作用し得る官能基を有する重合
体からなり、該官能基の例として、イオン交換部位、例
えばアニオン性部位及びカチオン性部位の両者並びに特
徴的結合性を有する他の部位、例えば試料成分中の対応
する疏水性部位と相互作用する疏水性部位が挙げられる
。
イオン交換相互作用が好ましく、アニオン性又はカチオ
ン性部位を有する最近公知となった種々の重合体連鎖が
用いられる。その例はポリエチレンイミン及びポリリジ
ンである。これらの連鎖上の活性部位はアニオン性から
カチオン性に又はその反対に転換するために又は結合強
度を増加又は減少させるために更に誘導体化しても良い
。好ましい連鎖は、その活性部位が、種々の方法例えば
カルボキシル基又はスルホン酸誘導体の付加又は窒素の
完全メチル化による第４級アミンの形成によって誘導体
化されたポリエチレンイミンである。
好ましい態様においては重合体連鎖は実質的に分枝して
おり、各単位がほぼ１　（ＩＩの結合部位を有する単位
群から形成される。連鎖の結合性及び結合容量は連鎖の
分子量又は連鎖の担体表面上の濃度を適切に選択するこ
とにより更に変動させることができる。一般に約１００
〜約１００．０００、好ましくは約２５０〜約５，００
０の平均分子量を有する重合体連鎖が最良の結果を与え
る。結合部位の濃度は単位体積当りの当量又はミクロ当
量によって示される、分離媒体の総結合容量によって示
すのが便利である。効果的分離は広範囲の結合容量に亘
って得られる。最良の結果は、クロライド結合容量によ
って示すと、一般に約１０〜約１．０００ミクロ当量／
鴎ｌの範囲において達成され、中でも約３０〜約３５０
ミクロ当量／ｍｌが好ましく、約７０〜約１３０ミクロ
当量／ｍｌが特に好ましい。
本発明は、広範囲の試料混合物に通用されるけれども特
に蛋白質、ペプチド及び核酸の分離に有用である。極め
て少量サイズの試料、特に約５００ミクログラム以下、
好ましくは約２００ミクログラム以下のオーダーの試料
が、本発明の方法によって極めて短時間に、しかも成分
間の高分解能を保持しつつ分離される０分離媒体の好ま
しい形態は容積が約０．１〜約２．０−１好ましくは約
０．２〜約１．５−であるカラムの形の充填床であり、
カラムの長さは最長的２０Ｃ１１であるのが好ましく、
約１．０〜約ｉｏａｍが更に好ましく、約２．０〜約７
゜５ｃｍが最も好ましい。
分離は約０．５〜約１０ａ＋ｌ／分、特に約１．０〜５
゜０−１／分の流速で充填床を通過するキャリア流体を
用いて達成されるのが一般的である。
特に蛋白質分離のための好ましい態様においては、成分
の分離は溶出操作においてｐＨ勾配又は塩勾配を用いる
ことによって促進される。勾配値は分離される成分に依
存して広（変動させ得る。典型的なｐＨ勾配は分離過程
において約４から約１０の範囲であり、一方典型的な塩
勾配は約０．０３〜１．０モル濃度、好ましくは約０．
０５〜約０．５モル濃度の純増加を伴う。多くの場合に
この勾配は約０．５〜約２０分、好ましくは約１分〜約
５分の範囲の時間間隔において達成され、ｐｉ及び／又
は塩濃度は分離が進むにつれて変化する。アニオンを他
のものに置き換えるような塩組成物の斬新的又は段階的
変化もある場合において採用され有益な効果を与える。
以下の実施例は例示目的のためのものであり、いかなる
場合にも本発明を限定又は制限するものではない。
実施例Ｉ Ａ、ビーズ調製 グリシジルメタクリレートモノマーとジエチレングリコ
ールジメタクリレート架橋剤から下記の方法でミクロポ
ーラスポリメタクリレートビーズを調製した。
反応フラスコに２１の蒸留された脱イオン水及び３０．
０ｇ（１，５％）のポリ（ビニルアルコール）（平均分
子量約１８００）を加え、フラスコを４０℃に加熱して
、重合体の全量が溶解するまでこの温度を維持した。こ
の溶液に、ナトリウムドデシルスルフェート（３６，０
ｇ、１．５％）及びダウコーニング社製５４４香消泡剤
（２，０ｇを１８ｍｌの水に溶解したもの）を加えた。
２０４．０　ｇ　（１，４４モル）のグリシジルメタク
リレートを１３６．０　ｇ　（０，５６モル）のジエチ
レングリコールジメタクリレートと混合し、次いで塩基
性アルミナ（バイオ−ラッド社製　ＡＣ−１０樹脂、１
００〜２００メツシユ）のカラム中を通液ｆ遇して上記
モノマー中に存在する重合防止剤（インヒビター）を除
去することにより混合部を調製した。−過後に２．０ｇ
のフリーラジカル（遊離基）開始剤を加え、得られた全
体の混合部を上記のポリ　（ビニルアルコール）溶液に
加えた。
生じた混合物を３０分間４０℃で８０　Ｏｒ、ｐ、ｍ。
で攪拌し、次いで温度を２時間の間隔に亘って７８℃に
上昇させ、この温度に１０時間保った。次いで混合物を
室温に冷却し、脱イオン水で希釈した。生成重合体ビー
ズを遠心分離により捕集し、水中に再懸濁させ、３０分
間室温で攪拌し、遠心分離、再懸濁、攪拌した後再び遠
心分離した。生じた水で湿潤したケーキをメタノール中
に懸濁し３０分間攪拌した後、遠心分離し、この最後の
一連の操作を２回繰り返した。得られたメタノールで湿
潤したケーキをアセトンで２回洗浄しくケーキに対して
アセトンを２倍体積量それぞれ使用しり）　、５００ｓ
＋１の乾燥エーテルで２回洗浄した。
最後にフィルターケーキを１時間空気乾燥し次いで４０
℃で一晩真空乾燥した。得られたビーズはその平均粒子
直径が７．５ミクロンであり、そのＢ−Ｅ−Ｔ分析は１
゜ＯＯｎ？／ｇの表面積と１０．５ミクロリットル／ｇ
の空孔体積を示した。
Ｂ、誘導体化 上で得られたビーズに、ポリエチレンイミンを下記のよ
うにして結合させた。
１００ｇのビーズのメタノール湿潤ケーキを４００ｍｌ
のポリエチレンイミン溶液（平均分子量約１８００のポ
リエチレンイミン１００ｇを３００−１のメタノールに
溶解したもの）中に懸濁させ、懸濁液を１６時間４０℃
で振とうし、次いでメタノールで希釈し、遠心分離して
傾しゃ（デカンテーション）した、ビーズをメタノール
中に再懸濁させ、再び遠心分離して傾しゃした。上澄を
捨て、ビーズを０．５規定のＨＣｌ中の懸濁を２度行っ
て洗浄し、次いで遠心分離及び傾しゃを行った。同様の
方法によって、次いでビーズを一過された脱イオン水を
用いて４回洗浄した。
結合剤としてクロライドイオンを用いて結合容量を測定
した。この測定は、塩化水素での平衡化によりクロライ
ドイオンで部位を飽和させ、次いで水洗し、その後濃硝
酸銀を用いて０．５規定のナイトレート（硝酸塩）イオ
ンでクロライドイオンを置き換え、次いで置き換えられ
たクロライドイオンをＡｇＮＯ３でに２Ｃｒ０４終点ま
で滴定することからなる。
上述の方法によってビーズ１ｍｌ当り９０±１０ミクロ
当量のクロライド結合容量を有するビーズが得られた。
下記の試験のために、異なるクロライド結合容量を有す
る一連の５種のビーズが、反応混合物中のポリエチレン
イミンの濃度を変えることにより調製された。これらの
容量は、それぞれ３６．７４．９５．１３３及び２０３
ミクロ当量／ｓ＋１であった。
Ｃ，クロマトグラフィー分離 種々の誘導体化ビーズを用いて分離するためにヘモグロ
ビンＡ、Ｆ、Ｓ及びＣの混合物を鋼製した。なおヘモグ
ロビンの比率は以下の通りである。
ヘモグロビンＡ□４１±３％ ＃　　Ｆ−−２３±２％ 〃　　５ｃｍ３、０±１％ ＃　　Ｃ−１６±２％ ５種のビーズを、内径４．６ｍｍ、長さ３〇−曽の円筒
カラム中に個別に充填した。直線的に増加する塩勾配で
パンファーＣＩｉ街）溶液をカラムに供給するために混
合装置を付帯させた。用いられたバッファーはいずれも
１０ｍＭのトリスクロライド（ｐＨ８，５）−であり、
ＮａＣ１含有量は５分間でＯＭから０．１Ｍに上昇する
０分離は２０ミクロリツトル（４０ミクログラム）の試
料サイズで１．０ｍｌＺ分のバッファー流速で行われた
。
結果は、８ミクロリツトルのセルを有する紫外検出器（
Ｕ■ディテクター）の応答を記録したピークを示す第１
ａ図〜第１ｅ図に示されている。
充填物のクロライド結合容量は以下の通りであった。
第１ａ図　　３６ミクロ当ｉｌ／ｌ１ｌｌ第１ｂ図　　
７４ 第１Ｃ図　　９５ 第１ｄ図　１３３　　　〃 第１ｅ図　２０３ 実施例２ この例は、異なる長さのカラムについてその溶出時間及
び分離性を比較したものである。
７４ミクロ当量／ｌａ　Ｉのクロライド結合容量を有す
る、実施例１で使用されたと同一の単一カラムと、低デ
ッドボリュームコネクターによって直列に連結された一
対の上と同一のカラムとを用いて実施例１で用いたと同
一のヘモグロビン混合物（試料サイズ２０ミクロリツト
ル）を分離した。キャリア流体中の塩勾配は下記の２種
のバッファー溶液を使用することにより達成された。
バフファーＡ：１６ｍＭ）リスクロライド、ｐＨ８，５ バッファーＢ：２０ｍＭトリスクロライド＋０．２　Ｍ
塩化ナトリウム、ｐＨ８，５ 勾配プログラムは、注入後９分までの期間は０〜１５％
バッファー８１次いで注入後９〜１５分の期間は１５〜
４０％バッファーＢからなる。
実施例１と同様にして検出を行い、その結果を第２ａ図
（単一カラム）及び第２ｂ図（二重カラム）に示した。
ヘモグロビンのピーク及び保持時間が各実験について与
えられる。第２ａ図及び第２ｂ図のチャートより、長い
カラムの方が分析時間は長くかかるが、良好なピーク分
解能とバンド幅を与えることが示された。
実施例３ 本例は本発明の分離媒体と既存の分離媒体とを比較し前
者が後者に勝ることを示すためのものである。本発明の
分離媒体として、実施例２で調製したものと同一のもの
を用い、既存の分離媒体として、米国カリフォルニア州
すンタクララに所在するブラウンリー　ラボラトリーズ
社（ＢｒｏｗｎｌｅｅＬａｂｓ　Ｉｎｃ、）製シンクロ
パック（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ）　Ａ　Ｘ−３００を用
いた。この商品は表面に結合したポリエチレンイミンを
有する多孔性シリカ担体からなり、平均粒子直径が約１
０ミクロン、平均空孔直径が約３０ＯＡであり、ピクリ
ン酸結合容量が６５６ミクロモル／ｇ（約８５０ミクロ
当量／ｓｌのクロライド結合容量に相当する）であった
。
各ケースにおいて径が４．６　ｍｍで長さが３０Ｉｌｌ
ＩＯカラムと２０ミクロリツトルの試料体積量を用い、
キャリア流体流速は３つの異なる値に設定した。
結果は第３ａ図〜第３ｒ図に示すが、これらのうち第３
ａｌ！ｌ、第３ｂ図及び第３ｃ図はキャリア流体流速が
それぞれ０．５．１．０及び２．０ｍｌ／分である場合
の本発明の誘導体化ビーズの使用例を示し、第３ｄ図、
第３ｅ図及び第３ｆ図は、上と同一の３種のキャリア流
体流速におけるシンクロパンクＡＸ−３００ビーズの使
用例を示す。実施例２のバッファー溶液が用いられ、そ
の勾配プログラムは下記の通りである。
第３ａ図及び第３ｄ図＝７分間でθ〜７０％バッファー
Ｂ 第３ｂ図及び第３ｅ図：５分間で０〜５０％バッファー
Ｂ 第３Ｃ図及び第３ｆ図：３分間でＯ〜４０％バッファー
Ｂ この結果より、非多孔性ビーズの方が全ての流速、特に
高流速において分解能、バンド幅及び感度にすぐれてい
ることが判明した。
実施例４ 本例は、マウス腹水液中に存在するＩｇＧの分析に使用
した場合における本発明の分離媒体と他の既存の分離媒
体とを比較し、前者が後者に勝ることを示すためのもの
である０本発明の分離媒体として、実施例２で用いたと
同一のものが用いられ、また比較媒体として、米国ニュ
ーシャーシー州フィリップスバーグ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ
ｂｕｒｇ）に所在するＪ、　Ｔ、ベーカー社（Ｂａｋｅ
ｒ）製ベーカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）が用いら
れた。この商品はその表面にアニオン交換基を結合させ
た多孔性シリカ担体であって、その平均粒子直径は約５
ミクロンである。
本発明の媒体のために径が４．６　ａｍで長さが３０、
、のカラムが用いられ、一方ベーカーボンドヵラムは既
に製造業者によって媒体が充填されている径が４．６　
ａｈａで長さが２５０ｍ５の分析用カラムであった。各
ケースにおいて２０ミクロリツトルの試料量を用いた。
非多孔性ビーズの試験においては、バッファーＡは１６
ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）であり、バッファーＢは２０
ｍＭ）リス＋０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）で
あって、勾配プログラムは１゜０ｍｌ／分の流速におい
て２０分間でバッファーＢを０％から１００％に上昇さ
せた。一方ベーカーボンドの試験においては、バッファ
ーＡはＩｏｎＭリン酸カリウム（ｐＨ６，８）であり、
バッファーＢは５００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６，４
）であって、勾配プログラムは１．０ｍｌ／分の流速に
おいて６０分間でバッファーＢを０％から２５％に上昇
させた。
非多孔性ビーズ試験の検出器によるピークを第４ａ図（
各ピークに付された数字は保持時間を示す）に示し、一
方、ベーカーボンドによる比較試験のそれを第４ｂ図に
示した。非多孔性ビーズは比較品に比べはるかに短い時
間で質的に同等の分析結果を与えることが判明した。
実施例５ 本例は実施例２の分離媒体と同一の分離媒体を用いるオ
プアルブミンと牛血清アルブミンの混合部の分離例を示
す、直径が４．６　ｓａ＋で長さが３０Ｉｌ１ｍのカラ
ムを用い、６５〜６５０ミクログラムの範囲の４１ｉｉ
の試料サイズの蛋白質混合物について行った。バッファ
ーＡは１０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）であり、バッファ
ーＢは１０ｍＭトリス＋０．５Ｍ塩化ナトリウムであっ
た。勾配プログラムは流速１．０ｍｌ／分において１５
分間でバッファーＢを０％から１００％に上昇させた。
結果は第５ａ図〜第５ｄ図に示す、なお、試料サイズは
下記の通りである。
第５ａ図　　　　６５ミクログラム 第５ｂ図　　　１３０　　〃 第５ｃ図　　２６０　　〃 第５ｄ図　　６５０　　〃 なお、塩勾配及び保持時間は示された通りである。効果
的分離は１５分以内に行われ、またビークのブロード化
は試料が約２５０ミクログラムを越えると起こることが
判明した。
実施例６ 本例はポリエチレンイミンで誘導体化されたポリ　（ヒ
ドロキシプロピルメタクリレート）ビーズの調製及び使
用例を示す。
Ａ、ビーズ調製 反応フラスコに２！の蒸留された脱イオン水及び３０．
０ｇ（１；５％）のゲルバトール（Ｇｅｌｖａｔｏｌ■
）２０〜３０（米国ミズリー州セントルイスに所在する
モンサンド　インダストリアル　ケミカル社製ポリビニ
ルアルコール）を加え、このフラスコを４０℃に加熱し
、重合体の全量が溶解するまでこの温度に維持した。ビ
ロリン酸ナトリウム（４，０ｇ、０．２％）を次いで加
えた。
１５０．０　ｇ　（１，’０４モル）のヒドロキシプロ
ピルメタクリレートと５０．０ｇ（０，２５モル）のエ
チレングリコールジメタクリレートを混合することによ
り混合物を調製した。なお、上記のヒドロキシプロピル
メタクリレートは７２％の２−ヒドロキシプロピルメタ
クリレートと２８％の１−メチル−２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレートの混合物であった。混合物を塩基性ア
ルミナ（バイオ−ラッド社製ＡＧ−１０樹脂、１００−
２００メツシユ）のカラムに通液してＩ遇し、８０ｇの
シクロヘキサノールに溶解した０、８ｇのラウロイルパ
ーオキシドを加え、この混合物を上で得られたポリ　（
ビニルアルコール）混合物と混合した。
得られた混合物を４０℃において、８００ｒ、ｐ。
−０で３０分間攪拌し、次いで２時間かけて温度を７８
℃に上昇させ、１０時間その状態に保った。
混合物を次に室温に冷却し、脱イオン水で希釈した。得
られたビーズを遠心分離によって捕集し、次いで水に再
ｆｉ濁、攪拌、遠心分離、再懸濁、攪拌及び遠心分離の
一連の操作を行った。
得られたケーキをメタノール中に懸濁させて攪拌し、次
いで遠心分離、再懸濁、攪拌及び遠心分離の一連の操作
を行った後、メタノールで２回、乾燥エーテルで２回洗
浄した。ｆ過ケーキを最終的に空気乾燥し、次いで４０
℃で一晩真空乾燥した。得られたビーズはその平均粒子
直径が１０ミクロンであり、Ｂ−Ｅ−Ｔ分析によって表
面積が１．１６ｎｆ／ｇであり、空孔体積が５．０ミク
ロリットル／ｇであることが判明した。
Ｂ、誘導体化 ４０ｇ量のビーズを乾燥アセトンで洗浄し、アセトン中
に懸濁させて体積１００ｍｌにした。′再結晶されたｐ
−）ルエンスルホニルクロライド（５０ｇ）及び乾燥さ
れた蒸留ピリジン（５０ｍｌ）を加え、反応フラスコを
密栓して６０℃で一晩振とうした。ビーズを遠心分離し
、アセトンで２回洗浄して過剰のｐ−）ルエンスルホニ
ルクロライド及びピリジンを除去し、次いで１００ｍｌ
の水中に再懸濁させた。水に溶解した８２ｇのポリエチ
レンイミン（平均分子ｉｌｌ　８００）を含む１７５ｍ
ｌ溶液を加え、反応フラスコを４０℃で２日間振とうし
た。得られたビーズは６２ミクロ当量／ｍｌのクロライ
ド結合容量を有していた。
Ｃ，クロマトグラフィー分離 実施例１で用いたと同一のヘモグロビンＡＳＦ。
Ｓ及びＣの混合物を用いた。試料サイズは１０ｔクロリ
ツトルであった。
ビーズを直径０’、４ｃ＋ｎ、長さ２５ｃ＋ｓのカラム
に充填し、実施例１と同様にバッファー混合装置をセッ
トしてカラムを通過するバッファーの流速を１゜０−１
／分にし、バッファーに０．０１０Ｍ）リスクムライド
（ｐｉｔ　８．０　）を含有させ、塩化ナトリウム含量
を分離開始から２〜２０分間の期間でＯＭから０．１５
Ｍに上昇させた。結果は第６１！ｌに示す。
第６図は検出器における４１５ｎｍでの吸収度を時間の
関数として示すものであり、主要ピークは左から右の順
に下記の如く固定された（かっこ内の値は保持時間であ
る）。
ヘモグロビンＣ（７，５分） Ｓ　　　（８，６分） Ａ　　（１０，２分） Ｆ　　（１３，３分） 実施例７ 本例は実施例１で調製された担体のサクシニル化による
カチオン交換担体の調製及び使用例を示すものである。
ポリエチレンイミンで誘導化されたポリ　（グリシジル
メタクリレート）ビーズを実施例１のＡ及びＢで述べた
方法で調製した。そのクロライド結合容量は９０ミクロ
当量／ｌｓ　ｌであった。ビーズを０．５規定の塩酸で
２回洗浄し、次いで水で数回洗浄した。ビーズを次いで
水中に再懸濁させ、ｐＨを６．０に調節した。
１０倍モル渇刺量（クロライド交換容量に対して）のコ
ハク酸無水物を、攪拌下に３等分量に分けて加え、Ｎａ
ＯＨを加えてｐＨを６．０に維持した。
この反応は２時間行われた。サクシニル化度はクロライ
ド交換容量を測定することによりチェック褒れ、クロラ
イド交換容量が１５ミクロ当量／ｍｌを越える場合には
サクシニル化を継続した。
得られたビーズを、１１．９％のヘモグロビンＡＩｃを
含有する赤血球へモリゼートからヘモグロビンＡＨｃを
分離するために用いた。直径４．６　ｍｍ、長さ３．０
　ｃｍ＋のカラム及び１．５ｍｌ／分の流速で流動する
０、０１０Ｍビス−トリスバッファー（ｐＨ６，３）を
用い、塩化ナトリウムを１０分間でＯＭから０．０５Ｍ
に上昇させた。試料サイズは２０ミクロリンドルであっ
た。検出は、４１５ｎｓにおける吸収度を測定すること
により行い、その結果を第７図に示す。第７図における
２つのピークはヘモグロビンＡＨｃ　（保持時間３．３
６分）及びヘモグロビンＡ　　（４，４０分）とそれぞ
れ固定された。
実施例８ 本例は本発明の分離媒体を定量分析に使用した例を示す
ものである。
６０％のヘモグロビンＡと４０％のヘモグロビンＣとを
含有するサンプルを調製し、次いで順次希釈して上記の
２種の蛋白質の濃度の異なる一連の溶液群を得た。各溶
液の所定量（２０ミクロリツトル）を、実施例２で述べ
たと同一のカラム（単一カラム）に繰り返し注入して、
カラムを出たピークを４１５ｎｓにおける吸収度によっ
て検出し、ピーク面積を検出器出力の電子積分法（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｉｎｔｅｇｒａＨｏｎ）によって求
めた。
第８ａ図及び第８ｂ図は、積分針によって画かれたピー
ク面積を、個別にヘモグロビンＡ及びヘモグロビンＣに
対して注入された蛋白質の量に対してプロットしたもの
であり、各図は別の一連の希釈系をそれぞれ示している
。その結果の直線性は、これらの蛋白質の定量的なピー
クによる再現（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）が試験された全範囲
、すなわち注入蛋白質量２〜１００ミクログラムに亘っ
て極めてすぐれた状態で達成されることを示している。
上の記載は例示目的のためになされたものであり、この
記載以外の数多くの改良、改変も本発明に包含されるこ
とは当業者が容易に理解するところである。
【図面の簡単な説明】
第１ａ図〜第１ｓ図は、単位体積当りの結合部位の数が
それぞれ異なるがいずれも本発明に含まれる一連の分離
媒体を用いたヘモグロビン分離例を示すクロマトグラフ
ィー図であり、 第２ａ図及び第２ｂ図は、媒体を充填するカラムの長さ
が異なる以外は第１ａ図〜第１ｅ図に示されたと同一タ
イプの分離例を示すり・ロマトグラフィー図であり、 第３ａ図〜第３ｒ図は、本発明に含まれる非多孔性媒体
と既存の多孔性媒体とをいくつかのキャリア流体流速で
比較した、第１ａ図〜第１ｅ図に示されたと同一タイプ
の分離例を示すクロマトグラフィー図であり、 第４ａ図及び第４ｂ図は、本発明に含まれる分離媒体と
既存の市販媒体とを比較した、マウス腹水液の分離例を
示すクロマトグラフィー図であり９、第５ａ図〜第５ｄ
図は、本発明に含まれる分離媒体を用いて、異なる試料
サイズで牛血清アルブミンからオブフルブミンを分離し
た例を示すクロマトグラフィー図であり、 第６図は、本発明に含まれる他の分離媒体を用いて行っ
た、第１ａ図〜第１ｅ図に示したと同一混合物の分離例
を示すクロマトグラフィー図であり、 第７図は、本発明に含まれる更に他の分離媒体を用いて
行った、赤血球へモリゼートの分離例を示すクロマトグ
ラフィー図であり、 第８ａ図及び第８ｂ図は、本発明に含まれる分離媒体を
用いて定量分析を行うことが可能であることを示すグラ
フ図である。

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）実質的に非多孔性の不活性固体担体からなり、該
    担体の表面には、重合体連鎖が共有結合によって結合し
    ており、各連鎖が複数の結合部位を有することを特徴と
    するクロマトグラフィー分離媒体。
  2. （２）前記の結合部位がアニオン性部位、カチオン性部
    位及び疎水性部位からなる群から選択される、特許請求
    の範囲第（１）項に記載のクロマトグラフィー分離媒体
    。
  3. （３）前記の担体の自由表面が親水性である、特許請求
    の範囲第（１）項に記載のクロマトグラフィー分離媒体
    。
  4. （４）前記の担体がポリ（ヒドロキシプロピルメタクリ
    レート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、
    ポリ（グリシジルメタクリレート）及びその誘導体から
    なる群から選択される一員からなり、これらはジエチレ
    ングリコールジメタクリレート及びエチレングリコール
    ジメタクリレートからなる群から選択される架橋剤を含
    む、特許請求の範囲第（１）項に記載のクロマトグラフ
    ィー分離媒体。
  5. （５）前記の担体が約０．５〜約３０ミクロンの平均直
    径を有する実質的に球形のビーズからなる、特許請求の
    範囲第（１）項に記載のクロマトグラフィー分離媒体。
  6. （６）前記の担体が約１．０〜約１０ミクロンの平均直
    径を有する実質的に球形のビーズからなる、特許請求の
    範囲第（５）項に記載のクロマトグラフィー分離媒体。
  7. （７）前記の重合体連鎖の平均分子量が約１００〜約１
    ００，０００である、特許請求の範囲第（１）項に記載
    のクロマトグラフィー分離媒体。
  8. （８）前記の重合体連鎖の平均分子量が約２５０〜約５
    ，０００である、特許請求の範囲第（７）項に記載のク
    ロマトグラフィー分離媒体。
  9. （９）前記の重合体連鎖が実質的に分枝しており、その
    各単位がほぼ１個の結合部位を有する、特許請求の範囲
    第（１）項に記載のクロマトグラフィー分離媒体。
  10. （１０）前記の結合部位がアニオン交換部位であり、前
    記の重合体連鎖が総クロマトグラフィー分離媒体に基づ
    いて約１０〜約１，０００ミクロ当量／ｍｌのクロライ
    ド結合容量を有する、特許請求の範囲第（１）項に記載
    のクロマトグラフィー分離媒体。
  11. （１１）前記の結合部位がアニオン交換部位であり、前
    記の重合体連鎖が総クロマトグラフィー分離媒体に基づ
    いて約３０〜約３５０ミクロ当量／ｍｌのクロライド結
    合容量を有する、特許請求の範囲第（１０）項に記載の
    クロマトグラフィー分離媒体。
  12. （１２）前記の結合部位がアニオン交換部位であり、前
    記の重合体連鎖が総クロマトグラフィー分離媒体に基づ
    いて約７０〜約１３０ミクロ当量／ｍｌのクロライド結
    合容量を有する、特許請求の範囲第（１１）項に記載の
    クロマトグラフィー分離媒体。
  13. （１３）前記の重合体連鎖がポリエチレンイミン、ポリ
    リジン、アスパラギン酸の重合体及びこれらの誘導体か
    らなる群から選択される、特許請求の範囲第（１）項に
    記載のクロマトグラフィー分離媒体。
  14. （１４）前記の重合体連鎖がポリエチレンイミン並びに
    その活性部位をカルボキシル部分、スルホネート部分及
    び第４級アンモニウム部分からなる群から選択される一
    員に変換させたポリエチレンイミンからなる群から選択
    される、特許請求の範囲第（１）項に記載のクロマトグ
    ラフィー分離媒体。
  15. （１５）架橋されたポリ（ヒドロキシプロピルメタクリ
    レート）及び架橋されたポリ（グリシジルメタクリレー
    ト）からなる群から選択される、実質的に非多孔性の不
    活性固体担体からなり、該担体の表面には、各連鎖当り
    約２５０〜約５，０００の平均分子量を有するポリエチ
    レンイミン連鎖が、クロマトグラフィー分離媒体に約７
    ０〜約１３０ミクロ当量／ｍｌのクロライド結合容量を
    与えるような量だけ結合しており、前記の担体が約１〜
    約１０ミクロンの平均直径を有する実質的に球形のビー
    ズの形態をしていることを特徴とするクロマトグラフィ
    ー分離媒体。
  16. （１６）特許請求の範囲第（１）項に記載されたクロマ
    トグラフィー分離媒体の充填床を有し、長さが最高約２
    ０ｃｍであるクロマトグラフィー分離カラム。
  17. （１７）特許請求の範囲第（１）項に記載されたクロマ
    トグラフィー分離媒体の充填床を有し、長さが約１．０
    〜約１０ｃｍであるクロマトグラフィー分離カラム。
  18. （１８）特許請求の範囲第（１）項に記載されたクロマ
    トグラフィー分離媒体の充填床を有し、長さが約２．０
    〜約７．５ｃｍであるクロマトグラフィー分離カラム。
  19. （１９）架橋されたポリ（ヒドロキシプロピルメタクリ
    レート）及び架橋されたポリ（グリシジルメタクリレー
    ト）からなる群から選択される、実質的に非多孔性の不
    活性固体担体を含む充填床を有し、前記の不活性担体の
    表面には、各連鎖当り約２５０〜約５，０００の平均分
    子量を有するポリエチレンイミン連鎖が、クロマトグラ
    フィー分離媒体に約７０〜約１３０ミクロ当量／ｍｌの
    クロライド結合容量を与えるような量だけ結合しており
    、前記の担体が約１〜約１０ミクロンの平均直径を有す
    る実質的に球形のビーズの形態をしており、カラム長さ
    が約２．０〜約５．０ｃｍであることを特徴とするクロ
    マトグラフィー分離カラム。
  20. （２０）（ａ）実質的に非多孔性の不活性固体担体から
    なり、該担体の表面には、重合体連鎖が結合しており、
    各連鎖が複数の結合部位を有する分離媒体を充填した床
    中に成分の混合部を通過させて各成分を実質的に個別の
    バンドに分離し、 （ｂ）該バンドを、これが充填床を出た時に検出するこ
    とを特徴とする、成分の混合部から成分を検出する方法
    。
  21. （２１）前記の充填床が約０．１〜約２．０ｃｍ＾３の
    体積を有するカラムからなり、前記の混合部の試料サイ
    ズが約５００ミクログラム以下であり、前記の成分が蛋
    白質、ペプチド及び核酸からなる群から選択される、特
    許請求の範囲第（２０）項に記載の方法。
  22. （２２）前記の充填床が約０．２〜約１．５ｃｍ＾３の
    体積を有するカラムからなり、前記の混合部の試料サイ
    ズが約２００ミクログラム以下であり、前記の成分が蛋
    白質、ペプチド及び核酸からなる群から選択される、特
    許請求の範囲第（２１）項に記載の方法。
  23. （２３）前記の充填床が、長さが最長約２０ｃｍのカラ
    ムからなり、前記の混合部の試料サイズが約５００ミク
    ログラム以下である、特許請求の範囲第（２０）項に記
    載の方法。
  24. （２４）前記の充填床が、長さが約１．０〜約１０ｃｍ
    のカラムからなり、前記の混合部の試料サイズが約５０
    ０ミクログラム以下である、特許請求の範囲第（２３）
    項に記載の方法。
  25. （２５）前記の充填床が、長さが約２．０〜約７．５ｃ
    ｍのカラムからなり、前記の混合部の試料サイズが約２
    ００ミクログラム以下である、特許請求の範囲第（２４
    ）項に記載の方法。
  26. （２６）不活性キャリア流体を約０．５〜約１０ｍｌ／
    分の流速で前記の充填床中を通過させることにより、前
    記の工程（ａ）を実施する、特許請求の範囲（２０）項
    に記載の方法。
  27. （２７）不活性キャリア流体を約１．０〜約５ｍｌ／分
    の流速で前記の充填床中を通過させることにより、前記
    の工程（ａ）を実施する、特許請求の範囲（２６）項に
    記載の方法。
  28. （２８）塩濃度、塩組成及びｐＨからなる群から選択さ
    れる前記のキャリア流体のパラメーターを、工程（ａ）
    において連続的に変動させる、特許請求の範囲（２０）
    項に記載の方法。
  29. （２９）前記のキャリア流体が、工程（ａ）の過程にお
    いて連続して増加する濃度の塩を溶解含有し、塩のモル
    濃度における純増加が約０．０３〜約１．０である、特
    許請求の範囲第（２０）項に記載の方法。
  30. （３０）前記のキャリア流体が、工程（ａ）の過程にお
    いて連続して増加する濃度の塩を溶解含有し、塩のモル
    濃度における純増加が約０．０５〜約０．５である、特
    許請求の範囲第（２９）項に記載の方法。
  31. （３１）試料サイズが約２００ミクログラム以下の蛋白
    質混合部から蛋白質を検出する方法において、（ａ）実
    質的に非多孔性の不活性固体担体からなり、該担体の表
    面には、重合体連鎖が結合しており、各連鎖は複数の結
    合部位を有する分離媒体を充填した、体積が約０．２〜
    約１．５ｃｍ＾３、長さが約１．０〜約１０ｃｍの充填
    床中に、約１〜約５分間でモル濃度の純増加が約０．１
    〜約０．５となるように連続して増加する濃度の塩を溶
    解含有する不活性キャリア流体を約１〜約５ｍｌ／分の
    流速で流すことにより、前記の蛋白質混合部を前記の充
    填床中を通過させて蛋白質を実質的に個別のバンドに分
    離し、（ｂ）該バンドを、これが充填床を出た時に検出
    することを特徴とする、蛋白質混合部から蛋白質を検出
    する方法。
  32. （３２）前記の不活性担体が平均直径が約０．５〜約５
    ０ミクロンの実質的に球形のビーズからなる特許請求の
    範囲（２０）項に記載の方法。
  33. （３３）前記の重合体連鎖が、ポリエチレンイミン並び
    にその活性部位をカルボキシル部分、スルホネート部分
    及び第４級アンモニウム部分からなる群から選択される
    一員に転換させたポリエチレンイミンからなる群から選
    択される、特許請求の範囲第（２０）項に記載の方法。
  34. （３４）前記の結合部位がアニオン交換部位であり、前
    記の重合体連鎖が総クロマトグラフィー分離媒体に基づ
    いて約１０〜約１，０００ミクロ当量／ｍｌのクロライ
    ド結合容量を有する、特許請求の範囲第（２０）項に記
    載の方法。
  35. （３５）試料サイズが約２００ミクログラム以下の蛋白
    質混合物から蛋白質を検出する方法において、（ａ）実
    質的に非多孔性であって、約１．０〜約１０ミクロンの
    平均直径を有する実質的に球形のビーズの形態の不活性
    固体担体からなり、該担体の表面には、各連鎖当り約２
    ５０〜約５，０００の平均分子量を有するポリエチレン
    イミン鎖が、クロマトグラフィー分離媒体に約７０〜約
    １３０ミクロ当量／ｍｌのクロライド結合容量を与える
    ような量だけ結合している分離媒体を充填した、体積が
    約０．２〜約１．５ｃｍ＾３、長さが約２．０〜約７．
    ５ｃｍの充填床中に、約１〜約５分間でモル濃度の純増
    加が約０．０５〜約０．５となるように連続して増加す
    る濃度の塩を溶解含有する不活性キャリア流体を約１．
    ０〜約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、前記の蛋白
    質混合部を前記の充填床中を通過させて蛋白質を個別の
    バンドに分離し、 （ｂ）該バンドを、これが充填床を出た時に検出するこ
    とを特徴とする、蛋白質混合部から蛋白質を検出する方
    法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012032375A (ja) * 2010-07-01 2012-02-16 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法
JP2017110224A (ja) * 2011-08-22 2017-06-22 アルゲンラボ グローバル リミテッドＡｒｇｅｎｌａｂ Ｇｌｏｂａｌ Ｌｔｄ． 抗微生物性アイオノマー組成物およびその使用
JP2017211352A (ja) * 2016-05-27 2017-11-30 日立化成テクノサービス株式会社 分離材及びカラム
WO2020225964A1 (ja) * 2019-05-09 2020-11-12 昭和電工マテリアルズ株式会社 吸着材粒子、吸着材粒子を製造する方法、基材粒子、充填カラム、及び、希土類元素を回収する方法
WO2020251000A1 (ja) * 2019-06-13 2020-12-17 昭和電工マテリアルズ株式会社 吸着材粒子、基材粒子、充填カラム、及び、希土類元素を回収する方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990009832A1 (en) * 1989-02-21 1990-09-07 Eastman Kodak Company High performance affinity chromatography column comprising non-porous, monodisperse polymeric packing material
JP2619537B2 (ja) * 1989-09-18 1997-06-11 株式会社日立製作所 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム
DE19962577A1 (de) 1999-12-23 2001-07-12 Tittgen Biotechnologie Dr Chromatographiematerial und Verfahren unter Verwendung desselben
EP1192963A4 (en) * 2000-04-05 2004-08-25 Toray Industries ADSORBENTS FOR PROTEINS OF THE HIGH MOBILITY PROTEIN AND PILLAR GROUP FOR CLEANING BODY LIQUIDS
JP5715325B2 (ja) 2005-12-13 2015-05-07 エクステラ・メディカル・コーポレーション 血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法
WO2008155683A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Firmenich Sa Malodor counteracting compositions and method for their use
ES2861359T3 (es) 2009-12-01 2021-10-06 Exthera Medical Corp Dispositivo para eliminar citoquinas de la sangre con polisacáridos inmovilizados en superficie
WO2012112724A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Exthera Medical, Llc Device and method for removal of blood-borne pathogens, toxins and inflammatory cytokines
DK2861273T3 (da) 2012-06-13 2017-11-27 Exthera Medical Corp Anvendelse af heparin og kulhydrater til behandling af cancer.
EP3620218A1 (en) 2013-06-24 2020-03-11 ExThera Medical Corporation Blood filtration system containing mannose coated substrate
CA2928866C (en) 2013-11-08 2021-11-09 Exthera Medical Corporation Methods for diagnosing infectious diseases using adsorption media
DE15782250T1 (de) 2014-04-24 2017-08-10 Exthera Medical Corporation Verfahren zur Entfernung von Bakterien aus Blut unter Verwendung einer hohen Durchflussrate
CN106714669B (zh) 2014-09-22 2021-05-14 艾克塞拉医疗公司 可穿戴的血液灌流装置
US11911551B2 (en) 2016-03-02 2024-02-27 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
WO2017151797A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4936396A (ja) * 1972-05-27 1974-04-04
JPS4987393A (ja) * 1972-08-30 1974-08-21
JPS5245239A (en) * 1975-07-24 1977-04-09 Jii Wainesu Konrii Automatic information processor
JPS52150093A (en) * 1976-06-07 1977-12-13 Sekisui Chemical Co Ltd Hydrophiltc filler for liquid chromatograph
JPS5390991A (en) * 1977-01-19 1978-08-10 Ceskoslovenska Akademie Ved Glycidyl esterrbased polar high polymer sorption agent for gas or liquid chromatography
JPS54103396A (en) * 1978-01-31 1979-08-14 Sekisui Chemical Co Ltd Bulking agent for liquid chromatograph
JPS5599068A (en) * 1979-01-24 1980-07-28 Sekisui Chem Co Ltd Filler for liquid chromatography

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE357622B (ja) * 1969-12-22 1973-07-02 Exploaterings Ab Tbf
DE3071140D1 (en) * 1979-06-22 1985-11-07 Seikisui Chemical Co Ltd Filler for liquid chromatography, method for separating water-soluble substances using said filler and use of said filler in separating water-soluble biochemical substances
US4384954A (en) * 1980-04-16 1983-05-24 Kuraray Co., Ltd. Column for adsorption of blood proteins
US4468330A (en) * 1981-04-27 1984-08-28 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Filler for liquid chromatography useful for separating a hemoglobin variant in blood

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4936396A (ja) * 1972-05-27 1974-04-04
JPS4987393A (ja) * 1972-08-30 1974-08-21
JPS5245239A (en) * 1975-07-24 1977-04-09 Jii Wainesu Konrii Automatic information processor
JPS52150093A (en) * 1976-06-07 1977-12-13 Sekisui Chemical Co Ltd Hydrophiltc filler for liquid chromatograph
JPS5390991A (en) * 1977-01-19 1978-08-10 Ceskoslovenska Akademie Ved Glycidyl esterrbased polar high polymer sorption agent for gas or liquid chromatography
JPS54103396A (en) * 1978-01-31 1979-08-14 Sekisui Chemical Co Ltd Bulking agent for liquid chromatograph
JPS5599068A (en) * 1979-01-24 1980-07-28 Sekisui Chem Co Ltd Filler for liquid chromatography

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012032375A (ja) * 2010-07-01 2012-02-16 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法
JP2017110224A (ja) * 2011-08-22 2017-06-22 アルゲンラボ グローバル リミテッドＡｒｇｅｎｌａｂ Ｇｌｏｂａｌ Ｌｔｄ． 抗微生物性アイオノマー組成物およびその使用
JP2017211352A (ja) * 2016-05-27 2017-11-30 日立化成テクノサービス株式会社 分離材及びカラム
WO2020225964A1 (ja) * 2019-05-09 2020-11-12 昭和電工マテリアルズ株式会社 吸着材粒子、吸着材粒子を製造する方法、基材粒子、充填カラム、及び、希土類元素を回収する方法
CN113840652A (zh) * 2019-05-09 2021-12-24 昭和电工材料株式会社 吸附材料粒子、制造吸附材料粒子的方法、基材粒子、填充柱及回收稀土元素的方法
WO2020251000A1 (ja) * 2019-06-13 2020-12-17 昭和電工マテリアルズ株式会社 吸着材粒子、基材粒子、充填カラム、及び、希土類元素を回収する方法

Also Published As

Publication number Publication date
GB8607241D0 (en) 1986-04-30
DE3609021A1 (de) 1986-09-25
GB2172812A (en) 1986-10-01
CA1265116A (en) 1990-01-30
GB2172812B (en) 1989-01-11

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