JPH09505402A - 生物液体中の荷電オリゴヌクレオチド類の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物液体中に荷電ヌクレオチド間結合したオリゴヌクレオチド類の検出、定量方法。この方法では、生物液体を４０℃〜６５℃にて、該試料中のオリゴヌクレオチド類を樹脂に吸着させるに充分な時間樹脂に接触させる。該吸着したオリゴヌクレオチド類を、塩濃度約１Ｍ〜２.５Ｍ、ｐＨ約６.５〜７.５を有するバッファにて約４０℃〜６５℃で脱着させる。その放出されたオリゴヌクレオチド類を検出および定量する。

Description

【発明の詳細な説明】 生物液体中の荷電オリゴヌクレオチト類の検出方法発明の背景 本発明は核酸の検出に関する。より詳しくは、生物液体中に存在する荷電核酸 配列の検出および定量に関する。 細胞中に存在する特定の核酸配列の検出は一般に知られている。サウザーン（ J．Mol．Biol．（1975）98 503-517）は、ＤＮＡフラグメント中の特定の配列を 、「ブロッティング」を用いるゲル電気泳動により分離し、または、ＤＮＡフラ グメントをメンブランに移行させ、ついで放射性プローブで変性ＤＮＡフラグメ ントをハイブリダイズし、オートラジオグラフにより検出することを教示してい る。この方法は細胞または組織から抽出したＲＮＡ分子の検出にも適用されてい る。さらに最近では、より速い定量的な“ドット−ブロッティング”法が開発さ れ、組織または細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの迅速な検出がなされている。 最近、いわゆるアンチセンス技法によって治療用剤または遺伝子発現調節剤と しての合成オリゴヌクレオチドの開発に多大の注目がなされるようになっている 。これらの薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド類と呼ばれ、ワトソン−ク リックまたはホグスタインのベースペア形成ルールによりターゲットの一本鎖核 酸分子に結合し、それによて、種々のメカニズム、すなわち、正常な翻訳または 転写に必要な因子の結合を妨げ；ｍＲＮＡターゲットの場合には、ＲＮａｓｅ Ｈによるメッセージの酵素分解を起こさせ；あるいはアンチセンスオリゴヌクレ オチドに直接結合している反応性基を介してターゲットを破壊するなどによって ターゲットの機能を壊す作用を有する。 アンチセンスオリゴヌクレオチド類は、ＨＩＶ−１およびその他のウイルス類 の発現を特別に阻害するものとされている（Agrawal（1992）Trends in Biotech nology 10: 152-158; Agrawal et al．in Gene Regulation: Biology of Antise nse RNA and DNA（Erickson and Izant，eds.）Raven Press Ltd.，New York（1 992）pp．273-283); Matsukura et al．in Prospects for Antisense Nucleic A cid Therapy of Cancer and AIDS，Wiley-Liss，Inc．（1992）pp．159-178; お よび Agrawal（1991）in Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy for Cancer and AIDS，（Wickstrom，ed.）Liss，New York，pp．145-148 を参照） 。例えば、ゲノムＨＩＶ−１ リボ核酸（ＲＮＡ）の部分に相補的な配列を持つ アンチセンスオリゴヌクレオチドは初期感染細胞におけるウイルス複製を阻害す る（Zamecnik et al．（1986）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）83: 4143-4147; Goodchild et al．（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85: 5507-5511） 。 アンチセンス剤としてのそれらの特性をさらに改良するために、化学的に修飾 したヌクレアーゼ抵抗性類縁体が開発され、それらは組織培養でのＨＩＶ−１複 製を阻害する効果がある（Sarin et al．(1988)Proc．Natl．Λcad．Sci．(USA)85 : 7448-7451; Agrawal et al.（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85: 7 079-7083; Matsukura et al．（1988）Gene 72: 343-347）。 これらの類縁体は、急性感染（Agrawal etal．（1989）Proc．Natl．Acad．Sc i（USA）86: 7790-7794）および慢性的感染セルライン〔Agrawal et al．(1991) in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA，（Erickson et al.，eds.）R aven Press，New York，pp．273-284; Vickers et al．（1991）Nucleic Acids Res．19: 3359-3368; Matsukura et al.（1989）Proc．Natl.Acad．Sci．（USA ）86: 4244-4248; Agrawal et al.（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85: 7079-7083)〕の両方でＨＩＶ−１複製の阻害を示すヌクレアーゼ抵抗性のホス ホロチオエイトヌクレオチド間の結合を有するオリゴヌクレオチド類を含む。 アンチセンス療法を有効にするには、オリゴヌクレオチドを被検体に導入し、 処置すべき特定の組織に到達させる必要がある。したがって、それらオリゴヌク レオチド類を体液または組織中で検出し得ることが必要になってくる。 テムサマニら〔Temsamani et al.，Anal．Biochem．214(in press)〕は、体液 または組織試料から蛋白分解され消化されたオリゴヌクレオチドを抽出する方法 を開発している。全核酸はその抽出試料から沈澱され、ハイブリダイゼーション メンブランに移行され、そこで、被検体に投与されたオリゴヌクレオチドに相補 的な標識オリゴヌクレオチドに特定の条件下にハイブリダイズされる。ハイブリ ダイズされた標識オリゴヌクレオチドの存在は標準的な方法で検出される。 放射性標識オリゴヌクレオチドは動物に投与され、その体液および組織内への 分布がオリゴヌクレオチドの抽出、ついでオートラジオグラフにより確認される 。（Agrawal et al．(1991）Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）88: 7579-7599 を 参照）しかし、実際上は、これらの方法はヒトの患者で使われる可能性はない。 不幸にして、体液または組織中に存在する特定の非標識核酸配列を検出する種 々の技術は大きなＤＮＡやＲＮＡ分子のようなヌクレオチド類にのみ応用されて いる。アンチセンスオリゴヌクレオチド類は、サイズが小さい故に、非特異的結 合または背景、結合の不存在、非検出または偽陰性等にかかわる特別な問題があ る。このように、体液や組織などの生物液体中に存在する特定の合成オリゴヌク レオチドの配列を検出するための方法の開発が必要である。発明の概要 ＤＮＡやＲＮＡは、一定の実験条件のもとでは蛋白質やポリペプチドよりもア ニオン交換樹脂により強固に付着することが知られている。加えて、ホスホジエ ステル含有分子よりもより高く荷電された局地性除去した（例えば、分子の局部 に有効に荷電した）核酸類はそのようなホスホジエステル含有分子よりもアニオ ン交換樹脂に対してより高い親和性を有することが見い出されている。これは、 この種の分子上に有効な電荷がホスホジエステル含有分子のものより少ないため にその安定性が増加することによる。これらの発見は、本発明の開発に利用され た。 最も広い態様において、本発明は、生物液体中の荷電オリゴヌクレオチド類の 検出および定量方法を提供するものである。本明細書で用いられる、「荷電オリ ゴヌクレオチド」とはＤＮＡおよびＲＮＡならびにＤＮＡおよびＲＮＡの両方を 含むハイブリッド核酸、各種糖、ホスフェート、または塩基修飾を有する核酸、 荷電ヌクレオチド間結合を有する核酸を含む。本発明の好ましい態様では、オリ ゴヌクレオチド類縁体が検査される生物液体には、血清、血漿、尿、精液、涙液 、唾液、脳脊髄液、汗、滑液、粘膜分泌液、植物抽出液、バクテリア、真菌、動 物細胞、および組織を含む。「組織」とは、リンパ組織、肝臓、腎臓、脳、腸、 平滑筋、横紋筋、心筋、上皮、表皮、その他のあらゆる器官を構成するものを含 む。 本発明のある態様では、この方法は、樹脂と接触させる前に液体試料を濾過また は沈澱させることも含む。 本発明の方法は、生物液体試料を、試料中のオリゴヌクレオチドが樹脂に吸着 されるに充分な時間アニオン交換樹脂と接触させる工程を含む。しかして、その オリゴヌクレオチド類は、塩濃度約１Ｍ〜２.５Ｍ、ｐＨ約６.５〜７.５のバッ ファで樹脂から脱着される。その吸着および脱着共に約４０℃〜６５℃にて行う 。ついで樹脂から放出されたオリゴヌクレオチド類を検出する。 本発明の好ましい態様では、生物液体試料をアニオン交換樹脂と接触させる。 第４級アルキルアミン化合物のような強アニオン交換樹脂が本発明の一態様にお いて用いられる。ここで用いる「強アニオン交換樹脂」とは、その荷電活性部位 が装填物の表面に共有結合で結合しており、強くイオン特性を発揮し、それによ って分子が樹脂と接触し、最初にその表面に結合しているイオン基と合体してい る反対イオンを置換することにより保持される。 他の態様においては、生物試料を、ジエチルアミノエチルやポリエチレンイミ ンのような弱アニオン交換樹脂と接触させる前に、ｐＨ約６.５〜９のバッファ 溶液と混合する。ここで用いられる「弱アニオン交換樹脂」とは、荷電活性部位 が第４級アルキルアミン類よりも弱いイオン特性を発揮する樹脂を含むものであ る。ある態様では、このバッファは塩濃度が約１００ｍＭ〜３００ｍＭで、好ま しくは約２５０ｍＭを有する。 本発明の他の態様においては、樹脂に吸着されたオリゴヌクレオチドをソフト アニオンを含むバッファで溶離させる。ここで用いる「ソフトアニオン」とはそ の大きいサイズの電子殻による拡散陰電荷を有する荷電分子種または原子種を意 味する。ソフトアニオンを含む塩の有用な例は、臭化物、塩化物、およびチオシ アニドである。好ましい塩は、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化カリウム、塩 化カリウム、臭化アンモニウム、および塩化アンモニウムである。 本発明の好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは２Ｍ塩を含むバッファに より樹脂から溶出される。別法として、脱着に速い塩勾配を用いてもよい。ここ で用いる「速い塩勾配」とは、一方の極限濃度から他方の極限濃度への流れが約 ３分以内にある勾配を意味する。 本発明の接触および脱着工程は、生物試料を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰ ＬＣ）にかけて行われる。別法として、その試料を固相抽出法にかける方法で、 そこでは、例えば自動でも加圧でもないカラム中で樹脂に荷電オリゴヌクレオチ ドを吸着させ、ついでその樹脂を前記塩バッファにて洗浄してオリゴヌクレオチ ドを溶出する。 いずれの場合も、樹脂から放出されたオリゴヌクレオチドの検出は、本発明の ある態様では、２６０ｎｍのＵＶ吸収をモニターしながら行われる。他の態様で は、そのオリゴヌクレオチドをレーザー誘導蛍光法および他の分光分析法によっ て検出する。さらに他の態様では、検出マーカーを含有する相補的オリゴヌクレ オチドを溶出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ついで、それをマーカー の性質によって適した方法で検出する。好ましいマーカーは、放射性化合物、蛍 光化合物、化学発光化合物、ビオチン、および検出し得る反応生成物を有する酵 素などが挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチド類の検出は本発明のある態 様では定量的に行われる。 本発明による方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法またはその臨床試 験が行われている患者の組織または体液中、さらにはオリゴヌクレオチドの生体 分布や薬力学の前臨床実験に用いる動物の組織および体液中のオリゴヌクレオチ ドの検出に有用である。図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的、それらの種々の別態様、ならびに本発明自体に ついては下記の説明を添付の図面と共に読めばより完全に理解されるであろう。 図１Ａは、血清蛋白質および立体排除クロマトグラフィで分離したオリゴヌク レオチド類縁体の２１０ｎｍでのＵＶ吸収と時間との関係を示すクロマトグラム である。 図１Ｂは、立体排除クロマトグラフィカラムを通して単一広域ピークとして移 動した蛋白質ＥｃｏＳＳＢの、２１０ｎｍでのＵＶ吸収と時間との関係を示すク ロマトグラムである。 図１Ｃは、立体排除クロマトグラフィカラムを通して単一広域ピークとして移 動したホスホジエステル結合ＤＮＡの、２１０ｎｍでのＵＶ吸収と時間との関係 を示すクロマトグラムである。 図１Ｄは、立体排除のクロマトグラフィカラムを通して付加物として移動した ホスホジエステル結合ＤＮＡと蛋白質ＥｃｏＳＳＢの、２１０ｎｍでのＵＶ吸収 と時間との関係を示すクロマトグラムである。 図１Ｅは、立体排除のクロマトグラフィカラムを通して付加物および非結合Ｄ ＮＡの両方として移動した過剰のホスホジエステル結合ＤＮＡと蛋白質ＥｃｏＳ ＳＢの、２１０ｎｍでのＵＶ吸収と時間との関係を示すクロマトグラムである。 図２Ａは、オリゴヌクレオチド類縁体を静脈注射１４日後に採取した猿血清試 料のＡ₂₇₀でのクロマトグラムである。 図２Ｂは、ヒト血清中の５ｐｐｍオリゴヌクレオチド類縁体標準品の２７０ｎ ｍにおけるＵＶ吸収と時間との関係を示すクロマトグラムである。 図３は、５０℃、ｐＨ７.０におけるオリゴヌクレオチド類縁体の検出と回収 の直線領域のスポットを示す。好ましい態様の詳細な説明 生物液体および組織中の荷電オリゴヌクレオチド類縁体の濃度および／または 存在を決定する新規かつ有効な方法が発明され、それは迅速、有効かつ安価であ る。この方法は、試料当たり数分以内で定量的データを提供でき、また分析に先 立って動物試料の処理が必要である。 この方法の科学的根拠は、荷電オリゴヌクレオチド類縁体の生物液体中の蛋白 質への結合が比較的弱いことに依存している。例えば、血清蛋白質と結合してい る荷電オリゴヌクレオチドを立体排除クロマトグラフィに付すと（そこではサイ ズによって分子が分離される）、２つの主要種が解離する（図１Ａを参照）。血 清蛋白質はより重く（左２ピーク）、そのためオリゴヌクレオチド類縁体（左ピ ーク）よりもゆっくり流れる。 これらの結果から、もしオリゴヌクレオチドと蛋白質とが互いに結合しないか あるいはきわめて弱い結合で付加物を形成し、カラム中を移動し同時に溶出され るものと考えられる（図１Ｄを参照。そこでは、ホスホジエステル結合蛋白質１ 部にＤＮＡ１部が単一ピークとして移行している）。蛋白質１部に対して少なく とも３部のホスホジエステル結合ＤＮＡを流すと、図１Ｅに示すとおり、より軽 いＤＮＡピークが形成し始める。これらの結果より、プロティナーゼＫはオリゴ ヌクレオチド類縁体の高回収のためには必要でないことがわかる（図１Ｂ−１Ｅ に示されるＥｃｏＳＳｂ−Ｐｄ(Ｔ)₂₀結合研究にみられるように。そこでは該蛋 白質−ＤＮＡ結合はきわめて強力である）。 本発明の方法は、また、そのような類縁体のアニオン交換樹脂に対する比較的 強い結合に依存している。例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合して いるデオキシリボヌクレオチド類は、ホスホジエステル結合デオキシリボヌクレ オチド類よりもアニオン交換樹脂に対してずっと高い親和性を持っている。この 違いは、ホスホジエステル非架橋酸素上のより高い荷電密度によるものである。 硫黄はより非局地性で、そのため、その荷電密度はより低い。この理論は、ホス ホロチオエート類のより高い酸性度およびそれらのテトラアルキルアンモニウム リガンドに対するより強いイオン結合によって支持される。 同様に、ホスホジエステル酸素よりもより強いまたはより弱い荷電密度を持っ た基幹結合を有する他の荷電オリゴヌクレオチド類はこの方法でモニターし得る 。そのようなオリゴヌクレオチド類もまた本発明に含まれるが、それらはホスホ ロジチオエート類に限られるものではない。 この方法の他の利点は、酸化による元の荷電オリゴヌクレオチド類縁体への変 化も検出し得ることである。例えば、ホスホロチオエートの場合、１つの硫黄基 が酸素で置換されても保持時間に劇的な変化が生じる。従来の方法ではオリゴヌ クレオチドの酸化の程度の変化に関する情報を提供されていなかった。 本発明によって試験できる生物液体は、アンチセンスまたは遺伝子治療を含む 数多の目的でオリゴヌクレオチド類縁体で処置をした生物、培養物、または組織 からのいかなる試料をも含む。生物液体の例としては、血清、血漿、尿、精液、 生殖液、涙液、汗、粘膜分泌液、脳脊髄液、滑液、および唾液などの体液を含む 。そのような液体は通常の医学的方法にて生体から採取される。 本発明方法でモニターできる他の生物液体としては、植物バクテリア、動物、 真菌類の細胞のような細胞抽出物も含む。細胞抽出液は公知の方法、例えば細胞 膜（植物および真菌胞子の場合は細胞壁）を、機械的または酵素的に分離または 破壊させ、ついで特定のものから、例えば、分画遠心分離によってその抽出物を 分離する（Current Protocols in Molecular Biology（1991）2 2.2 を参照）。 生体組織中のオリゴヌクレオチド類縁体もこの方法でモニターできる。組織は前 述したとおり抽出液としてモニターされる。 荷電オリゴヌクレオチド類縁体は生物液体の蛋白質に有意には結合しないため 、オリゴヌクレオチド含有生物液体をアニオン樹脂中またはそれを通して直接注 入することは定量的に可能である。しかしながら、大きな凝集物や特定の物質を 除くために分析に供する前にその液体試料を濾過する必要がある。有用なフィル ターは、０.２μｍセルローストリアセテート膜であり、試験すべき試料のアリ コートをシリンジを通して強制的に通すことができる。セルローストリアセテー ト膜からのオリゴヌクレオチド類縁体の回収は、濾過前後の試料のピーク帯を比 較することにより行われている。ピーク帯が変わらずに残っていれば、フィルタ ーに対するＤＮＡの損失はなかったことを示す。 本発明の方法においては、そのように収得、調製された生物液体をアニオン交 換樹脂に接触させる。実験条件下では、核酸は、試験される生物液体中の蛋白質 、炭水化物、その他の成分よりも樹脂に対してより強く結合する。加えて、ホス ホジエステル結合オリゴヌクレオチド類よりも高く荷電された荷電オリゴヌクレ オチド類縁体はそのようなホスホジエステル結合オリゴヌクレオチド類よりも樹 脂に対してより強く結合する。有用な樹脂の一例は、第４級アルキルアミンのよ うな強アニオン交換樹脂であって、ダイオネックス社（Dionex Corp.，カリフォ ルニア州、サニーベイル；13μm Dionex Nucleopak PA-100）またはパーセプテ ィブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosystems，マサチューセッツ州、ケン ブリッジ）などを含む多くのクロマトグラフ業者から商業的に入手可能である。 他の有用な樹脂は、ジエチルアミノエチルまたはポリエチレンイミン等の弱ア ニオン交換樹脂である。しかしながら、もしそのような弱アニオン交換樹脂を使 う必要があるときは、試験すべき生物液体試料のｐＨをバッファにてｐＨ約６. ９〜７.０に調節して液体試料の最終ｐＨが同じ（ｐＨ６.０〜７.０）になるよ うにする。この目的のために有用なバッファとしては、トリス−ＨＣｌバッファ 、燐酸バッファ、酢酸バッファ、いずれもｐＨ６.０〜７.０が挙げられる。 生物液体試料は、試料中の荷電オリゴヌクレオチド類が陽荷電された樹脂に吸 着されるのに充分な時間樹脂に接触させる。この工程は約４０℃〜６５℃にて行 うのが好ましい。より高温では蛋白質の沈澱が生じ、より低い温度ではカラムを 通す効果が低下する。樹脂との接触は吸着が早くかつ容易に行われるようにする 。すべての非吸着物質は洗浄除去するか、または、その中に望ましいオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体が含まれる場合にはさらに分析および 定量用に保存される。吸着されたオリゴヌクレオチド類縁体は、塩濃度約１Ｍ〜 ２.５Ｍ、ｐＨ約６.５〜７.５のバッファにて、温度約４０℃〜６５℃にて、樹 脂から脱着される。このバッファは臭化物、塩化物またはチオシアナイド等のソ フトアニオンを含むのが好ましい。そのようなソフトアニオンを含有する好まし い塩は、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化カリウム、塩化カリウム、臭化アン モニウム、および塩化アンモニウムを含む。このような塩を約２Ｍの濃度で含有 するバッファが特に有用である。 接触および脱着工程は種々の手段で行われ、クロマトグラフィおよび固相抽出 法はその代表例である。 １つの有用なクロマトグラフィ法は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ） である。ＨＰＬＣを用いた本発明の方法は、例えば、選択したアニオン交換樹脂 を充填した２０×２ｍｍ（内径）のステンレス製保護カラムを用いて行われる。 そのカラムのいずれか１端に樹脂保持用に２μｍチタンフリットを設置する。こ の分析用カラムは、ピーク形状や保存時間に受け入れられないような損失なしに １００μｌ以上の生物液体を反復注入して使用することができるため総じて安価 である。有機溶媒は一般に蛋白質の変性や沈澱の原因となるため、完全に水性の 移動相を用いる。それはまた廃棄物処理の費用も抑える効果もある。ＨＰＬＣ系 カラム区画の温度調節や高圧勾配ミキサーの混合容量または勾配ラグ（例えば４ ２０μｌ）を最小にする必要がある。 液体試料はＨＰＬＣカラムに直接注入する。アニオン交換樹脂に弱く結合する 蛋白質および天然核酸類は低濃度の塩（例えば２５０ｍＭＨＢｒ）を樹脂に流す ことにより除かれる。荷電類縁体およびその代謝物はついでカラムから溶出され 、ある種の検出手段にてその濃度が決定される。例えば、樹脂から脱着されたオ リゴヌクレオチド類縁体は分光光度計または他の種々の波長検出計を用いて２７ ０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出される。検出応答を、測定される生物液体中 の既知濃度の類縁体（添加）を用いて検量する。このＨＰＬＣ法を以下に具体的 に例示する。 バッファおよび血清に加えたオリゴヌクレオチド類縁体の標準品について、試 料当たり５分の処理量のＨＰＬＣによって分析する。猿にオリゴヌクレオチド類 縁体を注射したのち異なった時間に採取した血漿アリコート試料の凍結品を融解 させ、濾過し、２５０ｍＭＬｉＢｒ、ｐＨ７.０にて０.７ｍｌ／分の速度で０. ５分間で第４級アミン樹脂中に注入し、ついで２分間で２０００ｍＭＬｉＢｒと し、１分間保持する。流速を２倍とし、そのバッファ組成物を２５０ｍＭＬｉＢ ｒに戻す。１分後、その流速を０.７ｍｌ／分に戻し、次の試料を注入する。そ の代表的な結果を添付の図面に示す。図２Ａは、オリゴヌクレオチド類縁体２５ ｍｇ／ｋｇを注射した猿からの血漿を注射１５分後に採取した試料のものである 。図２Ｂは、ヒト血清に添加した５ｐｐｍ標準オリゴヌクレオチド類縁体のデー タである。静脈注射（４ｍｇ／ｍｌ類縁体溶液１０ｍｌを１０分間で注射）また は皮下注射（２０ｍｇ／ｍｌ類縁体溶液を５〜１０分間注射）した猿から採取し た血漿についての実験結果を表１Ａ、表１Ｂおよび表２に要約する。 血清からのオリゴヌクレオチド類縁体の回収率は、バッファと血清中での標準 曲線を作り、検出応答の勾配と注射した濃度を比較して求められる。それは図３ に示され、処理量が５分／試料でバッファのデータを四角、血清のデータを丸印 で示している。これらの勾配溶出条件での標準曲線は２００部／ビリオン（ｐｐ ｂ）から２００部／ミリオン（ｐｐｍ）までは直線であり、この範囲では類縁体 の回収率は極めて高いことを示している。さらに、血清およびバッファからの類 縁体の回収率はこれらの条件下では実質的に同一である（例えば、図２Ａに示す 標準曲線の勾配は重複している）。これらのデータは、血清中に加えられた標準 類縁体は猿血清中にすでに存在していた類縁体と近似した挙動をすることを示し ている。２つのバイオアベイラビリティ研究から得られたデータによれば、濾過 血清または尿の１００μｌアリコートは、正確に定量的濃度として１００ｐｐｂ の低い濃度の類縁体とすることが要求される。直線領域の検出には検出限度が約 ２００ｐｐｍである。しかしながら、狭い口径のカラムは５０ｐｐｍ以上の濃度 でオーバーロードとなる様子である（非正規分布のピーク形状となる）。このよ うに、２０ｐｐｍより高い試料では２５ｍＭトリスバッファ（ｐＨ７）で希釈し てから分析する。標準曲線から読み取られる濃度に希釈係数を掛けて当初の試料 濃度を得る。より多量を注射でき、オンライン式の事前濃度現象（preconcentra tion phenomena）を利用してきわめて低濃度の検出限界を達成することもできる 。本システムのための検出濃度限界は５０ｎｇ／ｍｌ（多分２００μｌ注射）で ある。 別法として、オリゴヌクレオチド類縁体は、相補性オリゴヌクレオチドプロー ブにハイブリダイズさせることによって検出および定量ができ、そのプローブは 、例えば³²Ｐや³⁵Ｓ等の放射性元素、あるいはローダミンやフルオレッセインな どの蛍光化合物、化学発光ラベル、ビオチンまたは酵素のような他の通常の標識 によって標識される（米国特許出願番号０８／００２７８６、０８／０５６３６ ３を参照）。 簡単に示すと、そのような標識を直接該相補性オリゴヌクレオチドプローブに 挿入する。ハイブリダイゼーションや洗浄条件はモニターされるべきオリゴヌク レオチド類縁体の型によって決定される。例えば、オリゴヌクレオチドホスホジ エステルやホスホロチオエートなどのイオン性ヌクレオチド間結合を有するオリ ゴヌクレオチド類は、６×ＳＳＣでインキュベーション、３７℃で３〜１６時間 のハイブリダイゼーション、ついで室温にて６×ＳＳＣで５〜１０分間洗浄２回 が、６２％Ｇ＋Ｃ含有２５−ｍｅｒプローブを用いて、５６％Ｇ＋Ｃ含有２５− ｍｅｒオリゴヌクレオチドの検出に好適である。より高厳密性（stringencies） がある場合には、同様のターゲットのオリゴヌクレオチドは検出できない。一方 、より低い厳密性の場合には、骨核ハイブリダイゼーションのシグナルがあいま いになる。非イオン性の改変ヌクレオチド間結合または低いＧ＋Ｃ含量を有する オリゴヌクレオチド類には、より低い厳密性（例えば、より低い温度、より高い 塩濃度）が好ましい。より長いオリゴヌクレオチド類またはより高いＧ＋Ｃ含量 またはＲＮＡ成分を有するオリゴヌクレオチド類には、厳密度を上げる（例えば 、より高温度、より低い塩濃度、および／またはホルムアミドなどの水素結合競 合物の存在）が好ましい。融点と各種改変ヌクレオチド間結合との間の関係はよ く知られている（例えば、米国特許第５，１４９，７９８号の図９を参照）。洗 浄後、その膜を乾燥し、通常の方法、例えば蛍光検出、β−線発光検出、化学発 光検出、またはオートラジオグラフィ等の手段にてその信号を検出する。 本発明の接触および脱着工程も固相抽出技術で行ってもよい。このオフライン 方法は流通チューブまたはカラムに樹脂を充填し、溶出バッファでそれを洗浄し 、ついで生物液体試料をそれに直接接触させて吸着させる工程を含む。不要の弱 く保持されている物質を、試料溶液より大きいがオリゴヌクレオチド類縁体の分 離に必要なよりは弱い塩濃度を有するバッファで洗い出す。そのオリゴヌクレオ チド類縁体は、前述したように、適当な溶出バッファにて樹脂から分離される（ Supelco Guide to Solid Phase Extraction，2d Ed.，Bellefonte，PA，Form 97 857B を参照）。 本発明を実施するための好ましい態様を、以下の実施例で示すが、本発明の範 囲はこれらに限定されるものではなく、同様の結果をもたらす変法も用いられ得 る。実施例 １．オリゴヌクレオチド類縁体の調製 この動物実験で用いたオリゴヌクレオチド類縁体標準品は、ＨＩＶ−１ゲノム の全長ヌクレオチド３２４−３４８（配列番号１）のｇａｇ領域に相補的な２５ −ｍｅｒホスホロチオエートである。このオリゴヌクレオチドは、多くの荷電オ リゴヌクレオチド類縁体の合成法総論にみられるような、トリエステル法、亜燐 酸トリエステル類の硫黄による酸化、標準アミダイト法、アミダイト法の変法の Ｈ−燐酸塩の単一工程での硫酸化変法、またはＨ−燐酸塩法の変法（Uhlmann et al．（1990）Chem．Rev．90 543-585 を参照）等の公知の合成プロトコールに したがって製造される。 そのオリゴヌクレオチドを半プレパラティブＨＰＬＣにかけ、トリエチルアン モニウムアセテートバッファにより１０〜６０％アセトニトリル勾配にてＣ１８ カラム（Millipore，マセチューセット、ミリフォード）で脱塩する。そのオリ ゴヌクレオチドを凍結乾燥し、２０ｍＭトリス、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.５） １ｍｌで希釈する。この原体溶液のアリコートをＡ２６７にてＵＶ吸収を読みと り、読んだ光学密度（ＯＤ）に４０.８μｇ／ＯＤを掛けて濃度（ｐｐｍ）を与 える。この原体溶液の希釈（および他の系統的希釈）を直接血清また他の体液で 行う。 ２．動物におけるバイオアベイラビリティの研究 試験物質を大人のあかげざるに頭部または伏在静脈中にカテーテルを介して 投与する（もし伏在静脈が使われていたら、動脈または静脈記録部位と反対側の 静脈に投与）。その注入は、ハーバード注入ポンプ（マセチューセツ、ケンブリ ッジ）を用いて行う。試料を、投与容量が０.４２ｍｌ／分以下となるように計 算した濃度にコントロール物に溶解する。注入に先立って、カテーテルを余分の 投与物質で満たしておき、確実にその動物が適量の投与を受けられるようにする 。各動物には１回の投与を行う。 ２種類のタイプの研究を行い、あかげざるへのオリゴヌクレオチド類縁体の投 与経路を変え、またオリゴヌクレオチド類縁体のバイオアベイラビリティを評価 した。第一のタイプの研究は、静脈投与をゆっくり（１２０分間で）と速く（１ ０分間）行って、オリゴヌクレオチド類縁体のバイオアベイラビリティの違いを 調べた。第二のタイプの研究は、速い静脈投与（１０分間）と皮下投与（５〜１ ０秒間）とによるオリゴヌクレオチド類縁体のバイオアベイラビリティの違いを 調べた。 試験物質を、表３に示すように、１〜４群の各動物に１０分間で、また５〜８ 群の各動物には１２０分間で投与した。 明らかな毒症状が現れたとき投与を中止する。毒性が現れる最大投与量および 効果を示さない最小投与量を調べるために、他の群に速い注入および遅い注入の 両方で投与する。 生物液体試料を採取する。試験血清または血漿試料のために、ヘパリン化試験 管に血液を採り、遠心して血漿から血球を分離する。さらに、尿、唾液、粘膜分 泌液、涙液、脳脊髄液、生殖液、滑液および精液を採取し、後の試験用に凍結す る。 ３．標準品および試料の調製 標準品は以下のように調製する。２０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ７）１ｍｌに 試料４ｍｇを溶かして、試料オリゴヌクレオチド類縁体の原体溶液を調製する。 ＤＮＡ含量を２６７〜２７０ｎｍにて光学分光法で測定する。この試料を１〜２ ＯＤの吸光度を有するように定量的に希釈する。その吸光度に４０.８μｇ／Ｏ Ｄおよび希釈係数を掛けて濃度ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）を得る。この原体溶液のア リコートを、プールしたヒト血清、血漿、唾液、粘膜分泌液、涙液、精液、滑液 、脳脊髄液、尿または細胞抽出試料に、試料オリゴヌクレオチド類縁体の予想さ れる生物液体濃度を包括する濃度で添加する。予想される濃度は生物体に投与さ れたオリゴヌクレオチド類縁体の量を越えることはない。 凍結した生物液体試料を自然に融解させ、分析を行うまで４℃で保存する。試 料（約１ｍｌ）を渦動させて均質にし、使い捨て注射針から０.２μｍセルロー ストリアセテートフィルターを通して標識した１.５ｍｌエッペンドルフ管に入 れる。これらの試料を、ＨＰＬＣ分析のために室温にて一列に並べる。このとき 、濾過した血清、血漿、尿、唾液、精液、涙液、または他の生物液体試料の１０ ０μｌアリコートが、２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチド類縁体が１００ｐｐｂの 低濃度で正確に定量するために必要である。直線域での検出には約５０ｐｐｍが 検出限界である。２０ｐｐｍより濃い試料は通常トリスバッファにて希釈し、再 度流す。非常に低濃度の検出限界を達成するにはより大量の試料を注入し、オン ライン式の事前濃度現象を利用することができる。５０ｐｐｍを越えるオリゴヌ クレオチド類縁体濃度の試料は２０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ７）にて定量的に 希 釈し、再分析する。約１ｐｐｍの濃度の試料オリゴヌクレオチド類縁体を含む血 清では、試料２５μｌをＨＰＬＣに注入する。１ｐｐｍ以下の血清試料では１０ ０μｌを注入する。 ４．ＨＰＬＣ 内径２０×２ｍｍの手充填：ステンレス製分析用カード付カラム（Upchurch S cientific 製、ワシントン、オーク・ハーバー）に、１３μｍの固定相樹脂〔Di onex Nucleopak PA-100(カリフォルニア、サーベイル)〕を２μｍのチタンフリ ッドで挟んで充填をする。このカラムを、５０℃の一定温度に保つ。移動相カラ ムバッファは（Ａ）２５０ｍＭトリス−ＨＢｒ（ｐＨ７）および（Ｂ）２ＭＬｉ Ｂｒ、２５ｍＭトリス−ＨＢｒ（ｐＨ７）である。両バッファを０.４５μｍナ イロン膜で濾過する。 このシステムへの適合性を決めるために、水ブランク、生物液体ブランク、お よび特定の生物液体中のオリゴヌクレオチド類縁体を試料と共に定期的に流す。 これらの標準品について検出応答とオリゴヌクレオチド類縁体の濃度との関係の 標準曲線を描き、そのシステムへの適合性のマーカーとして使用する。代表的な 分析系はつぎの通りである。（１）ブランク、（２）生物液体ブランク、（３） オリゴヌクレオチド標準品（例えば、チェック窓用３種の濃度のもの）、（４） １０個試料、（５）オリゴヌクレオチド類縁体標準品（チェック窓用の３種の濃 度のもの）、（６）水ブランク、（７）１０個の試料、および（８）オリゴヌク レオチド類縁体標準品（チェック窓用３種の濃度のもの）。 その試料を当初移動相組成物（２５０ｍＭＬｉＢｒ、ｐＨ７）中に０.７ｍｌ ／分の速度で５０℃にて０.５分間注入し、２分間で２ＭＬｉＢｒとし、１分間 保持する。流速を２倍とし、移動相組成物を１.５ｍｌ／分、１分間で２５０ｍ ＭＬｉＢｒに戻す。最後に、流速を０.７ｍｌ／分に落し、次の試料を注入する 。この方式を用いて、試料を５分毎に分析できる（図２Ａおよび２Ｂを参照）。 カラムを置き換えるべきかどうかを決めるために、標準品の保持時間をモニタ ーする。その保持時間はカラムへの注入回数で変わる。保持変化が０.２分／３. ６分となったとき（それは、通常、圧力増加に付随して生じる）、カラムを交換 する。 ５．ＵＶ吸収による検出および定量 試料濃度は外部の標準曲線によって決定する。２７０ｎｍでのＵＶ吸収を標準 品中のオリゴヌクレオチド類縁体の濃度に対してプロットする。小さい四角で示 す回帰線を得る。このシステムに適合させるために最小相関係数０.９９が要求 される。もし、これが適合しない場合は、標準品を再度調製し、再分析する。ヌ クレオチド類縁体の標準溶液は毎日新しく調製し、分析期間中室温で保存する。 ６．標識オリゴヌクレオチドプローブによる検出 放射線標識オリゴヌクレオチドプローブを調製するために、試料中に注入した オリゴヌクレオチドまたは血液、尿または組織試料中に添加するために使用した オリゴヌクレオチドに相補性のオリゴヌクレオチドを、１００μｇオリゴヌクレ オチド（５μｌ）、３μｌ〔ｒ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ミリモル、１ ０ｍＣｉ／ｍｌ）、１μｌ １０×キナーゼバッファ、および１μｌＴ₄ポリヌ クレオチドキナーゼ（８〜１０ units／μｌ）を含む反応液中で３７℃、３０分 間、５'末端に³²Ｐで標識し、６５℃で３分間加熱する。標識したオリゴヌクレ オチドを０.４Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃで沈澱させ、水５０μｌに再懸濁させる。 別法として、非放射性化学発光プローブを、ゲニアス（Genius）５^TMオリゴヌ クレオチドテイリングキット（Tailing Kit）（ベーリンガーマンハイム製）を 用いて、その製造者の指示書に従って、調製する。オリゴヌクレオチド１μｌの ３'末尾に、ターミナルトランスフェラーゼの存在下に、ジゴキシゲニン−１１ −ｄｄｕＴＰ／ｄＡＴＰ（ＤＩＧ−１１−ｄｄｕＴＰ／ｄＡＴＰ）を付ける。そ の反応液２０μｌには、４μｌの５ｘ反応バッファ（１Ｍ・カコジル酸カリウム 、１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、１.２５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２５℃でｐ Ｈ６.６）、４μｌの２５ｍＭ塩化コバルト、１００ピコモルのオリゴヌクレオ チド、１μｌの１ＭＤＩＧ−１１−ｄｄｕＴＰ（２,３'−ジデオキシウリジン− ５'−トリスホスフェートがジゴキシゲニンに１１原子のスペーサー腕を介して 結合したもの）、および５０単位のターミナルトランスフェラーゼを含んでいる 。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートし、氷上に置く。この反応液に 、 ２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン１μｌおよび２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）１ μｌを加え、それに０.１容量の４Ｍ塩化リチウムおよび２.５容量の冷エタノー ルを加えて沈澱させ、ついで混合し、−７０℃で３０分間インキュベートする。 そのオリゴヌクレオチドをペレット化し、そのペレットを７０％エタノールで洗 浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０−８.０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ ＳＤＳ ３０μｌ中に再懸濁させる。 ナイロン膜（Zeta Probe^TM、バイオラド製）およびワッツマン ３ＭＭ紙各１ 片を１０ｘＳＳＣに湿らせる。湿したワッツマン紙を点吸取装置（Minifold II^{T M} 、シュロイチャー＆シュエル製）に入れ、湿したナイロン膜をそのワッツマン 紙の上に置く。その装置に複数ウェルのふたをのせて締め、ついで真空装置につ なぐ。そのウェルを２０ｘＳＳＣ １００μｌで洗い、実施例１で調製した試料 を１０μｌＴＥ＋４０ｍｌ ２０ｘＳＳＧにてウェルに加える。そのウェルを２ ０ｘＳＳＣ １００μｌですすぐ。ついで真空を止め、ナイロン膜を取る。その ナイロン膜に、その表面から１０ｃｍの距離にて短波（Ｌ３００ｎｍ）ＵＶ線で １０分間照射して核酸をその膜に架橋させる。 その膜をハイブリダイゼーションバッファ（１Ｍ ＮａＣｌ／１％ＳＤＳ／１ ０％硫酸デキストランおよび１５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）１０ｍｌで３７℃に て１〜３時間プレハイブリダイズさせる。そのハイブリダイゼーション溶液中の 膜に、最終濃度３μｇ／ｍｌの非標識相補性オリゴヌクレオチド（５×１０⁵ｃ ｐｍ／ｍｌ；最終濃度２５０μｇ／ｍｌのプローブ）にて希釈した標識オリゴヌ クレオチドプローブを加え、３７℃にて３〜１６時間インキュベーションを続け る。その膜を６ｘＳＳＣにて２回洗浄（各５〜１０分間）し、ついで室温で乾燥 する。 その膜に特異的に結合したプローブを以下のようにして検出する。その膜をＸ 線フィルムに曝らし、現像し、走査密度計にかけ、それを、膜に直接吸着させて いた既知量のオリゴヌクレオチド試料と比較する。 これらの結果から、本発明の方法は、体液または組織中に３ｎｇ／ｍｌ程度の 低濃度で存在するオリゴヌクレオチド類の検出も可能であることがわかる。さら に、本発明の方法は、体液または組織中に存在するオリゴヌクレオチド類の定量 にも使用し得る。均等物 当業者は、上記の特定の物質および方法に均等な多くのものについても常套手 段、実験で確認できるであろう。そのような均等物も本発明の範囲に含まれ、以 下の特許請求の範囲でカバーされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/34 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）生物液体試料をイオン交換樹脂と４０℃〜６５℃にて試料中のオリゴ ヌクレオチド類が樹脂に吸着するのに充分な時間接触させ、 （ｂ）塩濃度約１Ｍ〜２.５Ｍ、ｐＨ値約６.５〜７.５のバッファにて、約４ ０℃〜６５℃で、その樹脂からオリゴヌクレオチド類を脱着溶出させ、 （ｃ）樹脂から放出されたオリゴヌクレオチドを検出する 工程からなることを特徴とする、生物液体中に荷電ヌクレオチド間結合されてい るオリゴヌクレオチド類の検出方法。 ２．該接触工程（ａ）が、血清、血漿、尿、精液、生殖液、涙液、唾液、脳脊髄 液、汗、細胞抽出液、および組織抽出液から選ばれる生物液体試料を樹脂と接触 させることからなる請求項１の方法。 ３．該接触工程（ａ）が、生物液体試料をアニオン交換樹脂と接触させることか らなる請求項１の方法。 ４．該接触工程（ａ）が、生物液体試料を強アニオン交換樹脂と接触させること からなる請求項３の方法。 ５．該強アニオン交換樹脂が第４級アルキルアミンからなる請求項４の方法。 ６．該接触工程（ａ）が、さらに該試料をｐＨ約６.０〜７.０のバッファと接触 させ、ついでその混合物を弱アニオン交換樹脂と接触させることからなる請求項 ３の方法。 ７．該接触工程（ａ）が、さらに該試料を塩濃度約１００ｍＭ〜３００ｍＭのバ ッファと混合することからなる請求項３の方法。 ８．該弱アニオン交換樹脂が、ジエチルアミノエチルおよびポリエチレンイミン からなる群から選ばれる請求項６の方法。 ９．該バッファが約２５０ｍＭの塩濃度からなる請求項７の方法。 １０．該接触工程（ａ）の前に、該生物液体試料を濾過する工程を付加する請求 項１の方法。 １１．該溶出工程（ｂ）が、ソフトアニオンを含有するバッファにて樹脂からオ リゴヌクレオチド類を溶出することからなる請求項３の方法。 １２．該溶出工程（ｂ）が、臭化物、塩化物およびチオシアナイドからなる群か ら選ばれるソフトアニオンを含有するバッファにて樹脂からオリゴヌクレオチド 類を溶出させることからなる請求項１１の方法。 １３．該バッファが、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化物、塩化物、およびチ オシアナイド、臭化カリウム、塩化カリウム、臭化アンモニウム、および塩化ア ンモニウムからなる群から選ばれる塩を含む請求項１２の方法。 １４．該溶出工程（ｂ）が、２Ｍ塩を含むバッファにより樹脂からオリゴヌクレ オチド類を溶出させることからなる請求項３の方法。 １５．該溶出工程（ｂ）が、速い塩勾配にて樹脂からオリゴヌクレオチド類を溶 出することからなる請求項３の方法。 １６．該接触工程（ａ）と脱着工程（ｂ）とを、該試料を高速液体クロマトグラ フィに付して行う請求項１の方法。 １７．該接触工程（ａ）と脱着工程（ｂ）とを、該試料を固相抽出に付して行う 請求項１の方法。 １８．該検出工程（ｃ）が、オリゴヌクレオチド類を２７０ｎｍでのＵＶ吸収に よって検出することからなる請求項１の方法。 １９．該検出工程（ｃ）が、オリゴヌクレオチド類をレーザー誘導蛍光により検 出することからなる請求項１の方法。 ２０．該検出工程（ｃ）が、該溶出オリゴヌクレオチド類に、検出し得るマーカ ーを含む相補性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされ ないオリゴヌクレオチド類を除き、ついでハイブリダイズされた相補性オリゴヌ クレオチド類上のマーカーを検出することからなる請求項１の方法。 ２１．該マーカーが、放射性化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、ビオチンお よび酵素からなる群から得たばれる請求項１９の方法。 ２２．（ａ）生物液体試料をアニオン交換樹脂と、約４０℃〜６５℃にて、該試 料中のオリゴヌクレオチド類を樹脂に吸着させるに充分な時間、接触させ、 （ｂ）塩濃度約１Ｍ〜２.５Ｍ、ｐＨ約６.５〜７.５を有するバッファにて、 約４０℃〜６５℃の温度でオリゴヌクレオチド類を樹脂から脱着溶出させ、 （ｃ）該樹脂から放出されたオリゴヌクレオチドを検出し、 （ｄ）該検出したオリゴヌクレオチドを定量する 工程からなることを特徴とする生物液体中に陰性荷電したヌクレオチド間結合し ているオリゴヌクレオチド類の検出方法。