JP4594467B2 - 常磁性粒子を用いた核酸の精製とその操作方法 - Google Patents
常磁性粒子を用いた核酸の精製とその操作方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
多くの分子生物学的手法にとっては、核酸をはじめとする細胞成分を扱うことが必要不可欠である。このような手法として、核酸の配列決定、核酸ハイブリッド形成による特殊核酸配列の直接検出と核酸配列増幅法等がある。
【０００２】
【従来の技術】
高純度二本鎖プラスミド（ｄｓ）ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、アガロースゲル精製ＤＮＡフラグメント及びＲＮＡの調製と精製は、分子生物学においては非常に重要である。核酸の精製方法は、簡単かつ迅速で、さらに、できるだけ付加的な試料操作を少なくするのが理想的である。このような方法で作成された核酸は、形質転換、制限分析、リティゲーション或いは配列決定に適する。これらの特徴をすべて備えた方法は、研究と診断用実施機具の目標でもある、核酸試料調製の自動化にとって非常に魅力的な方法である。
【０００３】
粗アルコール沈殿（crude alcohol precipitates）からプラスミドＤＮＡを作成するのは労力を必要とする作業で、通常では、CsCl勾配法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、又はリボヌクレアーゼ、蛋白分解酵素Ｋとアルコール沈殿工程の繰り返しを利用することが多い。これらの方法では、CsClと他の塩、臭化エチジウムとアルコールを除去するために下流の工程において大変な試料調製作業を必要とする。ＤＮＡフラグメントの精製に上記のいずれかの方法を用いる場合にも同様のことがいえる。更に、これらの方法の問題点は、微少の陰電荷細胞成分がＤＮＡと共に精製されることで、このように、ＤＮＡが好ましくない汚染にされる可能性がある。
【０００４】
また、固相法を用いて核酸を精製することもできる。従来の固相抽出法は表面を利用して行われているが、この方法によると（１）溶出中に核酸分子を簡単に戻せるようにデザインした表面ゆえに、十分な量の核酸分子をひきつけて保持することができないか、あるいは、（２）核酸分子を過度に表面に接着させることにより、溶出中の核酸分子の回収を妨げる問題がある。固相抽出法に用いた際このような問題を起こす従来の金属表面としては、ガラスとセライト等のある種のシリカ表面が挙げられる。
【０００５】
通常では、毒性を有し、苛性又は高価もしくはその両方である高濃度のカオトロープ又はアルコールの利用によってのみ、核酸をこのような表面に十分に結合させることができる。例えば、ＤＮＡは、カオトロープの存在下で、破砕したガラス粉末とガラス繊維フィルターに結合することが知られている。通常、カオトロープ性イオンは、アルコールで洗い流され、ＤＮＡは低濃度の塩溶液または水で溶出される。ここで重要なのは、ＲＮＡと蛋白質が結合しないことである。しかしながら、破砕したガラス粉末を使用した場合の重大な欠点は、結合能力が低いことである。
【０００６】
更に、ガラス粉末は、回収量が一定していないこと、ほう酸塩緩衝液と非相溶性であること、大きなＤＮＡに傷をつける傾向があること等の欠点を有している。同様に、ガラス繊維フィルターもまた、その非孔質表面はＤＮＡ結合能力が低いという欠点を有する。シリカゲルとガラスビーズ等の他のシリカは、ＤＮＡの結合と回収には適していない。現在、ＤＮＡの固相抽出のための固相と言えば、Bio-Rad Laboratories社のPrep-A-GeneTMに見られるようなセライトである。破砕したガラス粉末と同様に、ＤＮＡをセライトに十分結合させるためには高濃度のカオトロープが必要である。
【０００７】
しかし、欧州特許公報第EP0512767号、同第EP0585660号、米国特許第5,674,997号と欧州特許公報第EP0832897号等の参考文献によると、シリカ系物質を水和物により、場合によっては、シリカ系物質に結合したＤＮＡを溶出するための高濃度のカオトロープの必要性がなくなっる。
【０００８】
多くのＤＮＡの精製方法が存在する。例えば、米国特許第4,923,978号には、蛋白質とＤＮＡの溶液をヒドロキシル化した支持体に通過させ、蛋白質が支持体に結合して、ＤＮＡを溶出させるＤＮＡの精製方法が開示されている。米国特許第4,935,342号には、ＤＮＡを陰イオン交換体に選択的に結合させて次に溶出させる方法が開示されている。また、米国特許第4,946,952号には、ＤＮＡを水溶性ケトンにより析出させて単離する方法が開示されている。また、カオトロープと透析したＤＮＡを用いるＤＮＡの精製法が米国特許第4,900,677号に開示されている。
【０００９】
Boomらによる米国特許第5,234,809号とLittleらによる米国特許第5,075,430号に証明されているように、珪藻もまた核酸の精製に用いられている。
更に、核酸の精製に用いられている方法としては、特別仕様の常磁性粒子に結合させる方法がある。例えば、この方法が紹介されている欧州特許公報第EP0446260B1号と米国特許第5,512,439号（Hornesら）等の文献に、粒子直径標準偏差が5％未満である単分散の超常磁性粒子について記載されている。各粒子が、複数のオリゴヌクレオチドの分子を保持し、各オリゴヌクレオチドは目的とする核酸分子のプローブとして働く領域を有している。
【００１０】
米国特許第4,672,040号（Josephson）と米国特許第4,695,393号（Whiteheadら）には、ある種の分子を分離するシステムに使用するための磁気応答性を有する粒子が記載されている。この粒子は金属酸化物のコアをもち、安定したシリコーン被覆を周りにほどこしたもので、その被覆に有機分子又は生物分子もしくはその両方が結合するものである。
米国特許第3,970,518号（Giaever）には、細胞集団の混合物から特定の細胞集団を選び分離する方法が記載されている。この方法は、細胞集団を選ぶための抗体によって被覆された磁気微粒子を使用する。
【００１１】
米国特許第4,141,687号（Forrestら）には、流体試料の分析のための自動装置と方法が記載されている。この装置は試薬を粒状物質に結合させるのに用いられている。この粒状物質は磁性を有し、試薬は反応混合物における反応にかかわる物質である。
米国特許第4,230,685号（Senyeiら）には、細胞の磁気分離方法が記載されている。この方法は抗体が結合するブドウ球菌蛋白質Ａによって被覆された磁気的応答性を有する微小球を利用するものである。
【００１２】
米国特許第4,774,265号（Ugelstadら）には、磁気高分子粒子の製造方法が記載されている。この粒子は鉄塩溶液で処理したコンパクト又は多孔性の高分子粒子である。
米国特許第5,232,782号（Charmot）には、磁化可能な充填剤のコアと架橋有機ポリシロキサンのシェルからなる“コアシェル”微小体が記載されている。
【００１３】
米国特許第5,395,688号（Wangら）には、磁気応答性金属酸化物を含有するポリマーの層で均一に被覆した高分子コアを有する磁気応答性蛍光高分子粒子が記載されている。
米国特許第5,491,068号と米国特許第5,695,946号（Benjaminら）には、特定の抗体を表面に固定した磁気ビーズを用いて細菌の存在を検知する分析方法が記載されている。
【００１４】
米国特許第5,536,644号（Ullmanら）には、粒子分離法が記載されている。この方法は表面官能基を有し、必要に応じてさらに表面被覆をした磁気粒子を使用する。
欧州特許公報第EP0444120B1号（Hornesら）には、目的とするＲＮＡ又はＤＮＡの検出方法が記載されている。この方法では、目的とするＲＮＡ又はＤＮＡと結合できる一本鎖５'−結合ＤＮＡプローブをもつ磁気粒子を使用する。
【００１５】
国際公報第WO96/18731号（Deggerdalら）には、粒状固体支持体と陰イオン洗剤を用いて試料から核酸を単離する方法が記載されいてる。
米国特許第5,705,628号（Hawkins）には、官能基被覆表面を有する磁気粒子を用いたＤＮＡの精製と単離方法が記載されている。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
核酸の精製と操作のために、より効果的かつ効率的な方法を提供するため、本発明は核酸分子と可逆的に結合できる有用な組成物に関する。本組成物は酸性環境中にある常磁性粒子を含んでなる。本発明は、核酸分子と可逆的に結合できるこの組成物を利用する方法とこの組成物をパッケージしたキットとを含む。
【００１７】
【課題を解決する手段】
本発明は新規な組成物に関する。詳しくは、酸性溶液即ち、pHが約7.0未満の溶液中にある常磁性の粒子である組成物に関する。
出願人等は、酸性環境では、国際公開公報第WO96/18731号に記載されているような陰イオン洗剤を必要とせずに、常磁性粒子が核酸分子と可逆的に結合できることを発見した。特定の理論に束縛されたくはないが、出願人は、酸性環境が組成物の鉄部分の陽性を増加させ、それにより陰性である核酸分子の燐酸塩部分とこの組成物との結合能が増大すると考えている。
【００１８】
本明細書で使用する常磁性粒子という語は、磁場におかれた場合磁気モーメントを生じる粒子を言う。それゆえに、このような常磁性粒子は、このような磁場におかれると、その磁場の作用のもとで動くことができる。このような動きは、結合した核酸分子を試料加工法の別の態様又は他の操作に向けて動かすのに有用である。このように、常磁性磁気粒子に結合した核酸分子を、磁力を加えることによって直接的な接触を最小限におさえつつ、異なった場所に動かし、異なった試薬又は異なった条件もしくはその両方に暴露することができる。
【００１９】
出願人は、本発明で有用な常磁性粒子は複雑な構造を必要としないことも発見した。本発明では鉄粒子が好ましく、この鉄は水性環境において溶解度の低い水酸化第二鉄、磁性酸化鉄等の酸化鉄の形であれば足りる。また、硫化鉄、塩化鉄等の鉄粒子も、本明細書で述べる条件下の核酸を結合抽出するのに適している。
同様に、本発明においては常磁性粒子の形は重要ではない。例えば、球形、立方体、楕円、カプセル形、錠剤形、漠然としたランダム形等の種々の形が可能である。また、その形が一定であっても、一定でなくてもよい。常磁性粒子の形が何であれ、最大幅の部分の直径が通常約0.5ミクロン〜約20ミクロンの範囲であればよい。
【００２０】
核酸分子を常磁性粒子と効果的に可逆的結合させる酸性環境は、種々の手段により提供可能である。例えば、常磁性粒子を酸性溶液に加えたり、酸性溶液を粒子に加えたりすることにより提供することができる。また、常磁性粒子の置かれている溶液または環境を塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸等の酸性化剤を加えて酸性化することが好ましい。
常磁性粒子がおかれている環境のpHが約7.0未満である場合、この粒子は核酸分子と可逆的に結合する。更に、出願人は常磁性粒子の核酸結合能力はpHの減少とともに増大することを発見した。
【００２１】
本発明の常磁性粒子のための酸性環境により、国際公開公報第WO96/18731号を始めとするいくつかの参考文献に述べられているような洗剤の必要性を排除することが可能になったと考えられる。特定の理論に固執するつもりはないが、出願人は、洗剤は本発明に不必要であると考える。それは、本発明の酸性溶液が、試料中の他の物質、例えば核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤よりも、陽性である常磁性粒子の陰性核酸分子への結合を優先的に促進するからである。一方、国際公開公報第WO96/18731号等の参考文献に記載されているような洗剤の用途は、核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤を可溶化することにより、これら阻害剤が核酸分子の常磁性粒子への結合を妨害しないようにするためのものである。
【００２２】
上述のように、酸性環境においては、酸化第二鉄粒子にような陽性の常磁性粒子は陰性の核酸分子に結合する。それにより、同じ環境にある核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤等他の物質から結合した核酸分子を分離させることができる。このような分離は、遠心分離、濾過あるいは磁力の付加等の当業者の既知の手段により達成されうる。
【００２３】
結合した核酸分子は、適当な緩衝液中に溶出され、例えば、ハイブリッド反応あるいは増幅反応等の次の操作に付される。このような溶出は、結合している核酸と共に常磁性粒子の環境を加熱すること又はこのような環境のpHを増加させることもしくはその両方により達成される。常磁性粒子からの核酸の溶出を助ける薬剤としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、或いは、陰性の核酸が常磁性粒子から離れるのに十分な程度にその環境のpHを増加させるための化合物等の塩基性溶液が挙げられる。
【００２４】
【実施例】
次の実施例は本文中に記載された本発明の具体的な態様を示すものである。同業者には明らかなように、種々の変更と改良が可能であり、これらは記載された本発明の範囲内で考えられる。
【００２５】
実施例１
核酸の酸化鉄との結合
本実施例は、核酸の酸化鉄との結合を核酸のジルコニアとの結合と比較するために三つの目標投入レベル（target input level）で行われる。
本実施例で用いた材料は次の通りである。
−トラコーマクラミジア試料
−リン酸塩緩衝液
−BDプローブTecTMETシステム用試料緩衝液
−酸化鉄水和物FeO(OH)粒子（30メッシュ＝300〜1200ミクロン）
−酸化ジルコニア水和物
−グリシンＨＣｌ
−トラコーマクラミジアプライミングとBDプローブTecTMETシステム用増幅用ウェル
−エチルアルコール
【００２６】
本実施例は次の操作手順に従って行なった。
5,000基本体（Elementary Bodies:EB）/mL、1,000基本体（EB）/mL、500基本体（EB）/mLと0基本体（EB）/mLのトラコーマクラミジア溶液を、それぞれリン酸塩緩衝液で作成し、各（トラコーマクラミジアの）接種量（spike level）毎の溶液を12本2.0mLの遠心管に移した。これらの遠心管を105℃で30分間加熱した。重力によって脱イオン水（DiH2O）で洗浄した酸化鉄水和物粒子を、一本遠心管あたり10mgになるように、各トラコーマクラミジア接種量の溶液を６本の遠心管に計量分配した。
【００２７】
ジルコニア水和物粒子を各トラコーマクラミジア接種量を含有する３本の遠心管に一本あたり10mg計量分配した。3本各接種量の遠心管には粒子を加えなかった。上述の遠心管それぞれに3Mのグリシン−ＨＣｌを30μlの計量分配し、これらの管を30分間転倒型ロッカー（end over end rocker）に置いた。各接種量の3本の酸化鉄の遠心管、ジルコニア水和物の遠心管、及び、粒子無添加の遠心管を遠心して分離し、次に、遠心管あたり1mlの95％のETOHで一回、遠心管あたり1mlの脱イオン水で一回洗浄して、遠心管あたり1mlの試料緩衝液で懸濁させた。
【００２８】
酸化鉄を含有する別の3本遠心管は、磁石を管に隣接して置くことにより磁気によって分離させ、試料を抽出し、次に遠心管あたり1.0mlのETOHで洗浄した。溶液を磁気によって3分間分離し、1.0mlの脱イオン水を各遠心管に加えた。溶液を3分間磁気的に分離し、各遠心管に試料緩衝液を加えた。遠心管を105℃で30分間加熱して、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。BDプローブTecTMETシステムは既に開示されているシステムで、核酸目的分子の均質増幅及びリアルタイム検出のための半自動化システムである。
【００２９】
本実施例の結果を表１にまとめた。
【表１】
【００３０】
上述の結果から次の考察が得られる。
MOTA値（測定時間内の個々の測定単位の合計）は、陽性に対するカットオフ量を1000MOTAと設定した内部Becton Dickinson蛍光単位である。磁気によって分離した酸化鉄はジルコニア水和物粒子と同じ陽性を示した。粒子を添加していない遠心管は5,000EB／ml量でもキャリーオーバーはなかった。この実験により、酸化鉄水和物は酸性条件のもとで、ＤＮＡと結合することがわかった。
【００３１】
実施例２
水酸化カリウムを用いた場合の二本鎖ＤＮＡの酸化鉄粒子からの溶出と変性
本実施例は加熱せずに水酸化カリウム（KOH）のみを用いてＤＮＡの溶出及び変性が可能どうかを調べるために行われた。さらに、試料はどの中和／試料緩衝液が最適MOTA値を示すかどうかも調べた。
【００３２】
本実施例で用いた材料は次の通りであった。
−70mMのKOH溶液
−100mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（20％のDMSO、18％のグリセロール、0.06％のプロクリン、0.013mMのTween20と60mMのKPO4）
−200mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−トラコーマクラミジア試料緩衝液（10％のDMSO、9％のグリセロール、0.03％のプロクリン、0.0065mMのTween20と30mMのKPO4）
−ジルコニア水和物粒子
−酸化鉄水和物粒子
−トラコーマクラミジア試料
−95％のエチルアルコール（ETOH）
−リン酸塩緩衝液
【００３３】
本実施例は次に示す操作手順に従い行なった。
1,000EB／mlと5,000EB／mlのトラコーマクラミジア溶液をそれぞれリン酸塩緩衝液に作成し、各接種量毎に用意した32本の2ml遠心管に、1遠心管あたり1.0mlの溶液を計量分配した。酸化鉄水和物を1遠心管あたり10mgづつ、16本の各接種量の遠心管に計量分配し、次に各遠心管に60μlの3MグリシンＨＣｌを添加した。ジルコニア水和物粒子を、1遠心管あたり10mgづつ、16本の各接種量の遠心管に計量分配し、次に各遠心管に30μlの3MグリシンＨＣｌを添加した。これらの管を30分間転倒型回転器（end over end rotator）に保持した。酸化鉄のはいった遠心管を磁気的に分離させ、1.0mlのETOH次に1.0mlの脱イオン水で洗浄した。
【００３４】
ジルコニア粒子の入った遠心管を、1mlのETOHの後に1mlの脱イオン水で1回づつ遠心洗浄した。粒子の種類及び接種量が異なる12本の遠心管それぞれに、500μlの70mMのKOHを15分間かけて添加した。その12本の遠心管のうち、種類と接種量が同じ粒子の4本の遠心管に各管あたり500μlの100mMの2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（ｗ／リン酸塩）を加え、さらに種類と接種量が同じ粒子の4本の遠心管に各管あたり500μlの200mMの2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（ｗ／リン酸塩）を加え、残りの4本に試料緩衝液を1.0ml添加した。各種類、各接種量、各緩衝液の2本の遠心管を5分間沸騰水浴に置いた。その後すぐに、試料液をトラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。
【００３５】
本実施例の結果を表２にまとめた。
【表２】
【００３６】
上記の結果から次の考察が得られる。
上記の結果により、KOHのみを加えた酸化鉄水和物と酸化ジルコニア水和物粒子（w/o加熱）からＤＮＡは溶出及び変性可能であり、最適MOTA値を示した中和緩衝液は200と300mMのビシン2X中和緩衝液で有ることがわかった。
【００３７】
実施例３
酸化鉄水和物を用いた尿試料からの核酸の抽出
本実施例は、トラコーマクラミジアを接種した尿試料からその核酸を抽出するために低いpH溶液にある酸化鉄水和物を用いることが可能かどうか調べるために行なった。
【００３８】
本実施例で用いた材料は次の通りであった。
−尿試料
−トラコーマクラミジア試料
−試料緩衝液
−ジルコニア水和物粒子
−酸化鉄水和物粒子
−95％エチルアルコール（ETOH）
−グリシンＨＣｌ
−BDプローブTecTMETシステム用トラコーマクラミジアプライマーとウェル増幅ウェル
【００３９】
本実施例は次の操作手順に従い行われた。
10個の尿試料それぞれを2mlづつ3個に分け、その尿試料に1,000EB／ml、2,500EB／mlと5,000EB／mlのトラコーマクラミジア試料を接種した。得られた尿試料を1.0mlに分けて、2mlの遠心管に入れた。次に、10mgの酸化鉄水和物粒子を各試料の各摂取量の遠心管に計量分配した。各酸化鉄の遠心管に3MのグリシンＨＣｌを60μl添加した。この遠心管を30分間、転倒型回転器に保持した。別に、10mgのジルコニア水和物粒子を各試料の各摂取量の遠心管に計量分配した。各ジルコニア水和物の遠心管に3MのグリシンＨＣｌを30μl添加した。この遠心管を30分間、転倒型回転器に保持した。ジルコニア水和物粒子の入った遠心管を1mlのETOH次に、1mlの脱イオン水をもちいて10,000gで遠心洗浄した。この遠心管を1.0mlの試料緩衝液で再懸濁した。酸化鉄粒子の入った遠心管は磁気的に分離し、次に、1mlのETOHの後に1.0mlの脱イオン水をもちいて洗浄した。この遠心管を1.0mlの試料緩衝液で再懸濁した。各遠心管の試料液を5分間沸騰させ、次にトラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。
【００４０】
本実施例の結果を表３にまとめた。
【表３】
【００４１】
上記の結果から次の考察が得られる。
ジルコニア水和物粒子、酸化鉄水和物粒子のいずれかの場合とも同じレベルで検出される陽性率は低下する。このことは、2種の粒子が同様の性能を有していることを示している。pH値が低い環境にある酸化鉄は、尿素試料からＤＮＡを抽出することが可能であることを示した。
【００４２】
実施例４
酸化鉄水和物を用いた、血漿試料からの核酸の抽出
本実施例は、トラコーマクラミジアが接種された血漿試料からトラコーマクラミジアの核酸を抽出するために、低いpH値の溶液にある酸化鉄水和物を用いることが出来るかどうかを調べるために行われた。更に、本実施例は、酸化鉄水和物粒子を用いた血漿ＤＮＡ抽出方法とジルコニア水和物粒子を用いた血漿ＤＮＡ抽出方法を比較するために行われた。
【００４３】
本実施例に用いた材料は次の通りである。
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−酸化鉄水和物粒子
−酸化ジルコニア水和物粒子
−グアニジンイセチオン酸塩（Guanidine isothiocynate）
−トラコーマクラミジア保存試料
−トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−内部増幅コントロール（IAC）BDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−150mMのKOH
−血漿試料
−95％エチルアルコール
【００４４】
本実施例は次の操作手順に従って行われた。
酸化鉄操作手順
40mgの酸化鉄水和物粒子の入った8本の2ml遠心管に、1mlの脱イオン水を添加した。2組の血漿試料に、9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μlの濃度のトラコーマクラミジア試料を接種した。次に、各接種済み血漿試料300μlを、上記の酸化鉄水和物粒子の入った遠心管に添加して、遠心管を105℃で30分間加熱した。80μlの氷酢酸を各遠心管に添加し、この遠心管を転倒型回転器に30分間置いた。次に遠心管を磁気管ラックに置き、処理試料液を除去した。遠心管を磁気によって分離し、次に1.0mlの25mMの酢酸で2回洗浄した。500μlの150mMのKOHで15分間、ＤＮＡを酸化鉄水和物から溶出した。得られた溶液を300mMの2X試料緩衝液500μlで中和した。試料を沸騰水浴に5分間置き、次にBDプローブTecTMETトラコーマクラミジアシステムで増幅した。
【００４５】
ジルコニア水和物操作手順
上述の酸化鉄の操作手順で用いたのと同じ、2組の血漿試料それぞれを、2.0mlの遠心管4本に一本あたり300μlづつ計量分配した。各遠心管に5モルのグアニジンイセチオン酸塩（GITC）を700μlづつ添加した。各試料の4本の遠心管に9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μl濃度でトラコーマクラミジア標本を接種し、室温で15分間保持した。10mgの酸化ジルコニア粒子と30μlの3MグリシンＨＣｌを結合させて酸化ジルコニア粒子スラリーを生成し、得られたスラリー30μlを各遠心管に添加して、転倒型回転器に30分間置いた。次に遠心管を10,000gで3.0分間遠心分離にかけ、上清を除去し、各遠心管に2MのGITCを1.0ml添加した。遠心管を10,000gで30分間遠心分離し、上清を除去して、各遠心管に、80％のエチルアルコール／20％の50mMTris緩衝液を1.0ml加え、次に遠心管を更に2回、10,000gで3.0分間遠心洗浄し、上清を抽出し、1.0mlの脱イオン水を添加してた。ＤＮＡは150mMのKOH／300mMのビシン2X試料緩衝液1.0mlで溶出した。得られた試料を沸騰水浴に5分間置いた後、3,200gでポップ遠心し、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００４６】
内部増幅制御手順
試料緩衝液に9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μlのトラコーマクラミジア試料を接種した。得られた試料を沸騰水浴上に5分間置き、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００４７】
本実施例の結果を表４にまとめた。
【表４】
上述の結果から次の考察が導き出される。
MOTA陽性率値1,000を用いて、酸化鉄水和物は3,000EB／300μlまでの血漿試料からＤＮＡを抽出することが可能であった。
【００４８】
実施例５
磁性酸化鉄（ Fe 3 O 4 ）を用いた核酸の捕獲
本実施例は、中性と酸性結合条件において、二種類の核酸捕獲粒子、すなわち水酸化第二鉄（酸化第二鉄水和物）及び磁性酸化鉄を比較するように行われた。
本実施例で用いられた材料は次の通りである。
−リン酸塩緩衝液
−水酸化第二鉄（FeO(OH)）粒子
−磁性酸化鉄（Fe3O4）粒子
−トラコーマクラミジア試料
−トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−内部増幅コントロール（IAC）BDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−酢酸
−150mMのKOH
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
【００４９】
本実施例は次の操作手順に従って行われた。
水酸化第二鉄（FeO(OH)）粒子は、30〜50メッシュの材料を乳鉢と乳棒を用いて微粉状に磨砕して得た。得られた粉末を4分間水溶液に沈殿させた。上清を抽出し、さらに15分間沈殿させた。ペレット化した沈殿物を磁気によって分離し、脱イオン水で磁気によって洗浄した。次に得られた物質を20μm濾紙で濾過し、一晩37℃で乾燥した。得られた物質60μgを480μlの脱イオン水を含む管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。同様に、乾燥した（FeO(OH)）240μgを480μlの脱イオン水を含む管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。
【００５０】
更に、60μgのFe3O4（325番のふるいを88〜92％通過するような大きさにしたもの）を480μlの脱イオン水の入った管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。別のスラリーを乾燥した240mgのFe3O4を480μlの脱イオン水の入った管に移して作成した。このスラリーを6本の2ml遠心管に移した。リン酸塩緩衝液においてトラコーマクラミジア溶液を0 EB／ml、1,000EB／mlと4,000EB／mlに調製した。各濃度のトラコーマクラミジア溶液を各種粒子の入っている2本の管に計量して小分けした。管を105℃で30分間加熱した。各種粒子の入った管の一本に80μlの酢酸を加え、管を転倒型ロッカー（end over end rocker）に30分間保持した。次にこれらの管を磁気によって分離し、1回あたり1.0mlの25mMの酢酸で2回洗浄した。各管にあたって、500μlの150mMのKOHを15分間添加し、500μlの300mMのビシン2X試料緩衝液を各管に添加して、沸騰水浴上に5分間置いた。処理後の試料液は、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００５１】
本実施例の結果を表５にまとめる。
【表５】
【００５２】
上述の結果から次の考察が導き出される。
MOTA陽性率値1,000を用いて、Fe3O4は1,000EB／mlのレベルまで核酸を抽出でき、これは、FeO(OH)の抽出力に匹敵する。マイナス酸の量が、より低い1,000EB／mlにおける陽性値とMOTA値に否定的な影響を与えた。
以上の実施例は、ここに記載した本願発明の代表的な実施態様に過ぎない。当分野の当業者にとって、多くの変更と改良が可能であることは明白なものであるが、それもまた本発明に係る発明の範囲内に属するものであろう。
【発明の属する技術分野】
多くの分子生物学的手法にとっては、核酸をはじめとする細胞成分を扱うことが必要不可欠である。このような手法として、核酸の配列決定、核酸ハイブリッド形成による特殊核酸配列の直接検出と核酸配列増幅法等がある。
【０００２】
【従来の技術】
高純度二本鎖プラスミド（ｄｓ）ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、アガロースゲル精製ＤＮＡフラグメント及びＲＮＡの調製と精製は、分子生物学においては非常に重要である。核酸の精製方法は、簡単かつ迅速で、さらに、できるだけ付加的な試料操作を少なくするのが理想的である。このような方法で作成された核酸は、形質転換、制限分析、リティゲーション或いは配列決定に適する。これらの特徴をすべて備えた方法は、研究と診断用実施機具の目標でもある、核酸試料調製の自動化にとって非常に魅力的な方法である。
【０００３】
粗アルコール沈殿（crude alcohol precipitates）からプラスミドＤＮＡを作成するのは労力を必要とする作業で、通常では、CsCl勾配法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、又はリボヌクレアーゼ、蛋白分解酵素Ｋとアルコール沈殿工程の繰り返しを利用することが多い。これらの方法では、CsClと他の塩、臭化エチジウムとアルコールを除去するために下流の工程において大変な試料調製作業を必要とする。ＤＮＡフラグメントの精製に上記のいずれかの方法を用いる場合にも同様のことがいえる。更に、これらの方法の問題点は、微少の陰電荷細胞成分がＤＮＡと共に精製されることで、このように、ＤＮＡが好ましくない汚染にされる可能性がある。
【０００４】
また、固相法を用いて核酸を精製することもできる。従来の固相抽出法は表面を利用して行われているが、この方法によると（１）溶出中に核酸分子を簡単に戻せるようにデザインした表面ゆえに、十分な量の核酸分子をひきつけて保持することができないか、あるいは、（２）核酸分子を過度に表面に接着させることにより、溶出中の核酸分子の回収を妨げる問題がある。固相抽出法に用いた際このような問題を起こす従来の金属表面としては、ガラスとセライト等のある種のシリカ表面が挙げられる。
【０００５】
通常では、毒性を有し、苛性又は高価もしくはその両方である高濃度のカオトロープ又はアルコールの利用によってのみ、核酸をこのような表面に十分に結合させることができる。例えば、ＤＮＡは、カオトロープの存在下で、破砕したガラス粉末とガラス繊維フィルターに結合することが知られている。通常、カオトロープ性イオンは、アルコールで洗い流され、ＤＮＡは低濃度の塩溶液または水で溶出される。ここで重要なのは、ＲＮＡと蛋白質が結合しないことである。しかしながら、破砕したガラス粉末を使用した場合の重大な欠点は、結合能力が低いことである。
【０００６】
更に、ガラス粉末は、回収量が一定していないこと、ほう酸塩緩衝液と非相溶性であること、大きなＤＮＡに傷をつける傾向があること等の欠点を有している。同様に、ガラス繊維フィルターもまた、その非孔質表面はＤＮＡ結合能力が低いという欠点を有する。シリカゲルとガラスビーズ等の他のシリカは、ＤＮＡの結合と回収には適していない。現在、ＤＮＡの固相抽出のための固相と言えば、Bio-Rad Laboratories社のPrep-A-GeneTMに見られるようなセライトである。破砕したガラス粉末と同様に、ＤＮＡをセライトに十分結合させるためには高濃度のカオトロープが必要である。
【０００７】
しかし、欧州特許公報第EP0512767号、同第EP0585660号、米国特許第5,674,997号と欧州特許公報第EP0832897号等の参考文献によると、シリカ系物質を水和物により、場合によっては、シリカ系物質に結合したＤＮＡを溶出するための高濃度のカオトロープの必要性がなくなっる。
【０００８】
多くのＤＮＡの精製方法が存在する。例えば、米国特許第4,923,978号には、蛋白質とＤＮＡの溶液をヒドロキシル化した支持体に通過させ、蛋白質が支持体に結合して、ＤＮＡを溶出させるＤＮＡの精製方法が開示されている。米国特許第4,935,342号には、ＤＮＡを陰イオン交換体に選択的に結合させて次に溶出させる方法が開示されている。また、米国特許第4,946,952号には、ＤＮＡを水溶性ケトンにより析出させて単離する方法が開示されている。また、カオトロープと透析したＤＮＡを用いるＤＮＡの精製法が米国特許第4,900,677号に開示されている。
【０００９】
Boomらによる米国特許第5,234,809号とLittleらによる米国特許第5,075,430号に証明されているように、珪藻もまた核酸の精製に用いられている。
更に、核酸の精製に用いられている方法としては、特別仕様の常磁性粒子に結合させる方法がある。例えば、この方法が紹介されている欧州特許公報第EP0446260B1号と米国特許第5,512,439号（Hornesら）等の文献に、粒子直径標準偏差が5％未満である単分散の超常磁性粒子について記載されている。各粒子が、複数のオリゴヌクレオチドの分子を保持し、各オリゴヌクレオチドは目的とする核酸分子のプローブとして働く領域を有している。
【００１０】
米国特許第4,672,040号（Josephson）と米国特許第4,695,393号（Whiteheadら）には、ある種の分子を分離するシステムに使用するための磁気応答性を有する粒子が記載されている。この粒子は金属酸化物のコアをもち、安定したシリコーン被覆を周りにほどこしたもので、その被覆に有機分子又は生物分子もしくはその両方が結合するものである。
米国特許第3,970,518号（Giaever）には、細胞集団の混合物から特定の細胞集団を選び分離する方法が記載されている。この方法は、細胞集団を選ぶための抗体によって被覆された磁気微粒子を使用する。
【００１１】
米国特許第4,141,687号（Forrestら）には、流体試料の分析のための自動装置と方法が記載されている。この装置は試薬を粒状物質に結合させるのに用いられている。この粒状物質は磁性を有し、試薬は反応混合物における反応にかかわる物質である。
米国特許第4,230,685号（Senyeiら）には、細胞の磁気分離方法が記載されている。この方法は抗体が結合するブドウ球菌蛋白質Ａによって被覆された磁気的応答性を有する微小球を利用するものである。
【００１２】
米国特許第4,774,265号（Ugelstadら）には、磁気高分子粒子の製造方法が記載されている。この粒子は鉄塩溶液で処理したコンパクト又は多孔性の高分子粒子である。
米国特許第5,232,782号（Charmot）には、磁化可能な充填剤のコアと架橋有機ポリシロキサンのシェルからなる“コアシェル”微小体が記載されている。
【００１３】
米国特許第5,395,688号（Wangら）には、磁気応答性金属酸化物を含有するポリマーの層で均一に被覆した高分子コアを有する磁気応答性蛍光高分子粒子が記載されている。
米国特許第5,491,068号と米国特許第5,695,946号（Benjaminら）には、特定の抗体を表面に固定した磁気ビーズを用いて細菌の存在を検知する分析方法が記載されている。
【００１４】
米国特許第5,536,644号（Ullmanら）には、粒子分離法が記載されている。この方法は表面官能基を有し、必要に応じてさらに表面被覆をした磁気粒子を使用する。
欧州特許公報第EP0444120B1号（Hornesら）には、目的とするＲＮＡ又はＤＮＡの検出方法が記載されている。この方法では、目的とするＲＮＡ又はＤＮＡと結合できる一本鎖５'−結合ＤＮＡプローブをもつ磁気粒子を使用する。
【００１５】
国際公報第WO96/18731号（Deggerdalら）には、粒状固体支持体と陰イオン洗剤を用いて試料から核酸を単離する方法が記載されいてる。
米国特許第5,705,628号（Hawkins）には、官能基被覆表面を有する磁気粒子を用いたＤＮＡの精製と単離方法が記載されている。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
核酸の精製と操作のために、より効果的かつ効率的な方法を提供するため、本発明は核酸分子と可逆的に結合できる有用な組成物に関する。本組成物は酸性環境中にある常磁性粒子を含んでなる。本発明は、核酸分子と可逆的に結合できるこの組成物を利用する方法とこの組成物をパッケージしたキットとを含む。
【００１７】
【課題を解決する手段】
本発明は新規な組成物に関する。詳しくは、酸性溶液即ち、pHが約7.0未満の溶液中にある常磁性の粒子である組成物に関する。
出願人等は、酸性環境では、国際公開公報第WO96/18731号に記載されているような陰イオン洗剤を必要とせずに、常磁性粒子が核酸分子と可逆的に結合できることを発見した。特定の理論に束縛されたくはないが、出願人は、酸性環境が組成物の鉄部分の陽性を増加させ、それにより陰性である核酸分子の燐酸塩部分とこの組成物との結合能が増大すると考えている。
【００１８】
本明細書で使用する常磁性粒子という語は、磁場におかれた場合磁気モーメントを生じる粒子を言う。それゆえに、このような常磁性粒子は、このような磁場におかれると、その磁場の作用のもとで動くことができる。このような動きは、結合した核酸分子を試料加工法の別の態様又は他の操作に向けて動かすのに有用である。このように、常磁性磁気粒子に結合した核酸分子を、磁力を加えることによって直接的な接触を最小限におさえつつ、異なった場所に動かし、異なった試薬又は異なった条件もしくはその両方に暴露することができる。
【００１９】
出願人は、本発明で有用な常磁性粒子は複雑な構造を必要としないことも発見した。本発明では鉄粒子が好ましく、この鉄は水性環境において溶解度の低い水酸化第二鉄、磁性酸化鉄等の酸化鉄の形であれば足りる。また、硫化鉄、塩化鉄等の鉄粒子も、本明細書で述べる条件下の核酸を結合抽出するのに適している。
同様に、本発明においては常磁性粒子の形は重要ではない。例えば、球形、立方体、楕円、カプセル形、錠剤形、漠然としたランダム形等の種々の形が可能である。また、その形が一定であっても、一定でなくてもよい。常磁性粒子の形が何であれ、最大幅の部分の直径が通常約0.5ミクロン〜約20ミクロンの範囲であればよい。
【００２０】
核酸分子を常磁性粒子と効果的に可逆的結合させる酸性環境は、種々の手段により提供可能である。例えば、常磁性粒子を酸性溶液に加えたり、酸性溶液を粒子に加えたりすることにより提供することができる。また、常磁性粒子の置かれている溶液または環境を塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸等の酸性化剤を加えて酸性化することが好ましい。
常磁性粒子がおかれている環境のpHが約7.0未満である場合、この粒子は核酸分子と可逆的に結合する。更に、出願人は常磁性粒子の核酸結合能力はpHの減少とともに増大することを発見した。
【００２１】
本発明の常磁性粒子のための酸性環境により、国際公開公報第WO96/18731号を始めとするいくつかの参考文献に述べられているような洗剤の必要性を排除することが可能になったと考えられる。特定の理論に固執するつもりはないが、出願人は、洗剤は本発明に不必要であると考える。それは、本発明の酸性溶液が、試料中の他の物質、例えば核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤よりも、陽性である常磁性粒子の陰性核酸分子への結合を優先的に促進するからである。一方、国際公開公報第WO96/18731号等の参考文献に記載されているような洗剤の用途は、核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤を可溶化することにより、これら阻害剤が核酸分子の常磁性粒子への結合を妨害しないようにするためのものである。
【００２２】
上述のように、酸性環境においては、酸化第二鉄粒子にような陽性の常磁性粒子は陰性の核酸分子に結合する。それにより、同じ環境にある核酸ハイブリッド形成剤と増幅阻害剤等他の物質から結合した核酸分子を分離させることができる。このような分離は、遠心分離、濾過あるいは磁力の付加等の当業者の既知の手段により達成されうる。
【００２３】
結合した核酸分子は、適当な緩衝液中に溶出され、例えば、ハイブリッド反応あるいは増幅反応等の次の操作に付される。このような溶出は、結合している核酸と共に常磁性粒子の環境を加熱すること又はこのような環境のpHを増加させることもしくはその両方により達成される。常磁性粒子からの核酸の溶出を助ける薬剤としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、或いは、陰性の核酸が常磁性粒子から離れるのに十分な程度にその環境のpHを増加させるための化合物等の塩基性溶液が挙げられる。
【００２４】
【実施例】
次の実施例は本文中に記載された本発明の具体的な態様を示すものである。同業者には明らかなように、種々の変更と改良が可能であり、これらは記載された本発明の範囲内で考えられる。
【００２５】
実施例１
核酸の酸化鉄との結合
本実施例は、核酸の酸化鉄との結合を核酸のジルコニアとの結合と比較するために三つの目標投入レベル（target input level）で行われる。
本実施例で用いた材料は次の通りである。
−トラコーマクラミジア試料
−リン酸塩緩衝液
−BDプローブTecTMETシステム用試料緩衝液
−酸化鉄水和物FeO(OH)粒子（30メッシュ＝300〜1200ミクロン）
−酸化ジルコニア水和物
−グリシンＨＣｌ
−トラコーマクラミジアプライミングとBDプローブTecTMETシステム用増幅用ウェル
−エチルアルコール
【００２６】
本実施例は次の操作手順に従って行なった。
5,000基本体（Elementary Bodies:EB）/mL、1,000基本体（EB）/mL、500基本体（EB）/mLと0基本体（EB）/mLのトラコーマクラミジア溶液を、それぞれリン酸塩緩衝液で作成し、各（トラコーマクラミジアの）接種量（spike level）毎の溶液を12本2.0mLの遠心管に移した。これらの遠心管を105℃で30分間加熱した。重力によって脱イオン水（DiH2O）で洗浄した酸化鉄水和物粒子を、一本遠心管あたり10mgになるように、各トラコーマクラミジア接種量の溶液を６本の遠心管に計量分配した。
【００２７】
ジルコニア水和物粒子を各トラコーマクラミジア接種量を含有する３本の遠心管に一本あたり10mg計量分配した。3本各接種量の遠心管には粒子を加えなかった。上述の遠心管それぞれに3Mのグリシン−ＨＣｌを30μlの計量分配し、これらの管を30分間転倒型ロッカー（end over end rocker）に置いた。各接種量の3本の酸化鉄の遠心管、ジルコニア水和物の遠心管、及び、粒子無添加の遠心管を遠心して分離し、次に、遠心管あたり1mlの95％のETOHで一回、遠心管あたり1mlの脱イオン水で一回洗浄して、遠心管あたり1mlの試料緩衝液で懸濁させた。
【００２８】
酸化鉄を含有する別の3本遠心管は、磁石を管に隣接して置くことにより磁気によって分離させ、試料を抽出し、次に遠心管あたり1.0mlのETOHで洗浄した。溶液を磁気によって3分間分離し、1.0mlの脱イオン水を各遠心管に加えた。溶液を3分間磁気的に分離し、各遠心管に試料緩衝液を加えた。遠心管を105℃で30分間加熱して、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。BDプローブTecTMETシステムは既に開示されているシステムで、核酸目的分子の均質増幅及びリアルタイム検出のための半自動化システムである。
【００２９】
本実施例の結果を表１にまとめた。
【表１】
上述の結果から次の考察が得られる。
MOTA値（測定時間内の個々の測定単位の合計）は、陽性に対するカットオフ量を1000MOTAと設定した内部Becton Dickinson蛍光単位である。磁気によって分離した酸化鉄はジルコニア水和物粒子と同じ陽性を示した。粒子を添加していない遠心管は5,000EB／ml量でもキャリーオーバーはなかった。この実験により、酸化鉄水和物は酸性条件のもとで、ＤＮＡと結合することがわかった。
【００３１】
実施例２
水酸化カリウムを用いた場合の二本鎖ＤＮＡの酸化鉄粒子からの溶出と変性
本実施例は加熱せずに水酸化カリウム（KOH）のみを用いてＤＮＡの溶出及び変性が可能どうかを調べるために行われた。さらに、試料はどの中和／試料緩衝液が最適MOTA値を示すかどうかも調べた。
【００３２】
本実施例で用いた材料は次の通りであった。
−70mMのKOH溶液
−100mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（20％のDMSO、18％のグリセロール、0.06％のプロクリン、0.013mMのTween20と60mMのKPO4）
−200mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−トラコーマクラミジア試料緩衝液（10％のDMSO、9％のグリセロール、0.03％のプロクリン、0.0065mMのTween20と30mMのKPO4）
−ジルコニア水和物粒子
−酸化鉄水和物粒子
−トラコーマクラミジア試料
−95％のエチルアルコール（ETOH）
−リン酸塩緩衝液
【００３３】
本実施例は次に示す操作手順に従い行なった。
1,000EB／mlと5,000EB／mlのトラコーマクラミジア溶液をそれぞれリン酸塩緩衝液に作成し、各接種量毎に用意した32本の2ml遠心管に、1遠心管あたり1.0mlの溶液を計量分配した。酸化鉄水和物を1遠心管あたり10mgづつ、16本の各接種量の遠心管に計量分配し、次に各遠心管に60μlの3MグリシンＨＣｌを添加した。ジルコニア水和物粒子を、1遠心管あたり10mgづつ、16本の各接種量の遠心管に計量分配し、次に各遠心管に30μlの3MグリシンＨＣｌを添加した。これらの管を30分間転倒型回転器（end over end rotator）に保持した。酸化鉄のはいった遠心管を磁気的に分離させ、1.0mlのETOH次に1.0mlの脱イオン水で洗浄した。
【００３４】
ジルコニア粒子の入った遠心管を、1mlのETOHの後に1mlの脱イオン水で1回づつ遠心洗浄した。粒子の種類及び接種量が異なる12本の遠心管それぞれに、500μlの70mMのKOHを15分間かけて添加した。その12本の遠心管のうち、種類と接種量が同じ粒子の4本の遠心管に各管あたり500μlの100mMの2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（ｗ／リン酸塩）を加え、さらに種類と接種量が同じ粒子の4本の遠心管に各管あたり500μlの200mMの2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液（ｗ／リン酸塩）を加え、残りの4本に試料緩衝液を1.0ml添加した。各種類、各接種量、各緩衝液の2本の遠心管を5分間沸騰水浴に置いた。その後すぐに、試料液をトラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。
【００３５】
本実施例の結果を表２にまとめた。
【表２】
上記の結果から次の考察が得られる。
上記の結果により、KOHのみを加えた酸化鉄水和物と酸化ジルコニア水和物粒子（w/o加熱）からＤＮＡは溶出及び変性可能であり、最適MOTA値を示した中和緩衝液は200と300mMのビシン2X中和緩衝液で有ることがわかった。
【００３７】
実施例３
酸化鉄水和物を用いた尿試料からの核酸の抽出
本実施例は、トラコーマクラミジアを接種した尿試料からその核酸を抽出するために低いpH溶液にある酸化鉄水和物を用いることが可能かどうか調べるために行なった。
【００３８】
本実施例で用いた材料は次の通りであった。
−尿試料
−トラコーマクラミジア試料
−試料緩衝液
−ジルコニア水和物粒子
−酸化鉄水和物粒子
−95％エチルアルコール（ETOH）
−グリシンＨＣｌ
−BDプローブTecTMETシステム用トラコーマクラミジアプライマーとウェル増幅ウェル
【００３９】
本実施例は次の操作手順に従い行われた。
10個の尿試料それぞれを2mlづつ3個に分け、その尿試料に1,000EB／ml、2,500EB／mlと5,000EB／mlのトラコーマクラミジア試料を接種した。得られた尿試料を1.0mlに分けて、2mlの遠心管に入れた。次に、10mgの酸化鉄水和物粒子を各試料の各摂取量の遠心管に計量分配した。各酸化鉄の遠心管に3MのグリシンＨＣｌを60μl添加した。この遠心管を30分間、転倒型回転器に保持した。別に、10mgのジルコニア水和物粒子を各試料の各摂取量の遠心管に計量分配した。各ジルコニア水和物の遠心管に3MのグリシンＨＣｌを30μl添加した。この遠心管を30分間、転倒型回転器に保持した。ジルコニア水和物粒子の入った遠心管を1mlのETOH次に、1mlの脱イオン水をもちいて10,000gで遠心洗浄した。この遠心管を1.0mlの試料緩衝液で再懸濁した。酸化鉄粒子の入った遠心管は磁気的に分離し、次に、1mlのETOHの後に1.0mlの脱イオン水をもちいて洗浄した。この遠心管を1.0mlの試料緩衝液で再懸濁した。各遠心管の試料液を5分間沸騰させ、次にトラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムで増幅した。
【００４０】
本実施例の結果を表３にまとめた。
【表３】
上記の結果から次の考察が得られる。
ジルコニア水和物粒子、酸化鉄水和物粒子のいずれかの場合とも同じレベルで検出される陽性率は低下する。このことは、2種の粒子が同様の性能を有していることを示している。pH値が低い環境にある酸化鉄は、尿素試料からＤＮＡを抽出することが可能であることを示した。
【００４２】
実施例４
酸化鉄水和物を用いた、血漿試料からの核酸の抽出
本実施例は、トラコーマクラミジアが接種された血漿試料からトラコーマクラミジアの核酸を抽出するために、低いpH値の溶液にある酸化鉄水和物を用いることが出来るかどうかを調べるために行われた。更に、本実施例は、酸化鉄水和物粒子を用いた血漿ＤＮＡ抽出方法とジルコニア水和物粒子を用いた血漿ＤＮＡ抽出方法を比較するために行われた。
【００４３】
本実施例に用いた材料は次の通りである。
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
−酸化鉄水和物粒子
−酸化ジルコニア水和物粒子
−グアニジンイセチオン酸塩（Guanidine isothiocynate）
−トラコーマクラミジア保存試料
−トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−内部増幅コントロール（IAC）BDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−150mMのKOH
−血漿試料
−95％エチルアルコール
【００４４】
本実施例は次の操作手順に従って行われた。
酸化鉄操作手順
40mgの酸化鉄水和物粒子の入った8本の2ml遠心管に、1mlの脱イオン水を添加した。2組の血漿試料に、9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μlの濃度のトラコーマクラミジア試料を接種した。次に、各接種済み血漿試料300μlを、上記の酸化鉄水和物粒子の入った遠心管に添加して、遠心管を105℃で30分間加熱した。80μlの氷酢酸を各遠心管に添加し、この遠心管を転倒型回転器に30分間置いた。次に遠心管を磁気管ラックに置き、処理試料液を除去した。遠心管を磁気によって分離し、次に1.0mlの25mMの酢酸で2回洗浄した。500μlの150mMのKOHで15分間、ＤＮＡを酸化鉄水和物から溶出した。得られた溶液を300mMの2X試料緩衝液500μlで中和した。試料を沸騰水浴に5分間置き、次にBDプローブTecTMETトラコーマクラミジアシステムで増幅した。
【００４５】
ジルコニア水和物操作手順
上述の酸化鉄の操作手順で用いたのと同じ、2組の血漿試料それぞれを、2.0mlの遠心管4本に一本あたり300μlづつ計量分配した。各遠心管に5モルのグアニジンイセチオン酸塩（GITC）を700μlづつ添加した。各試料の4本の遠心管に9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μl濃度でトラコーマクラミジア標本を接種し、室温で15分間保持した。10mgの酸化ジルコニア粒子と30μlの3MグリシンＨＣｌを結合させて酸化ジルコニア粒子スラリーを生成し、得られたスラリー30μlを各遠心管に添加して、転倒型回転器に30分間置いた。次に遠心管を10,000gで3.0分間遠心分離にかけ、上清を除去し、各遠心管に2MのGITCを1.0ml添加した。遠心管を10,000gで30分間遠心分離し、上清を除去して、各遠心管に、80％のエチルアルコール／20％の50mMTris緩衝液を1.0ml加え、次に遠心管を更に2回、10,000gで3.0分間遠心洗浄し、上清を抽出し、1.0mlの脱イオン水を添加してた。ＤＮＡは150mMのKOH／300mMのビシン2X試料緩衝液1.0mlで溶出した。得られた試料を沸騰水浴に5分間置いた後、3,200gでポップ遠心し、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００４６】
内部増幅制御手順
試料緩衝液に9,000EB／300μl、6,000EB／300μl、3,000EB／300μlと1,500EB／300μlのトラコーマクラミジア試料を接種した。得られた試料を沸騰水浴上に5分間置き、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００４７】
本実施例の結果を表４にまとめた。
【表４】
MOTA陽性率値1,000を用いて、酸化鉄水和物は3,000EB／300μlまでの血漿試料からＤＮＡを抽出することが可能であった。
【００４８】
実施例５
磁性酸化鉄（ Fe 3 O 4 ）を用いた核酸の捕獲
本実施例は、中性と酸性結合条件において、二種類の核酸捕獲粒子、すなわち水酸化第二鉄（酸化第二鉄水和物）及び磁性酸化鉄を比較するように行われた。
本実施例で用いられた材料は次の通りである。
−リン酸塩緩衝液
−水酸化第二鉄（FeO(OH)）粒子
−磁性酸化鉄（Fe3O4）粒子
−トラコーマクラミジア試料
−トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−内部増幅コントロール（IAC）BDプローブTecTMETプライマーウェルと増幅ウェル
−酢酸
−150mMのKOH
−300mMのビシン、2Xトラコーマクラミジア試料緩衝液
【００４９】
本実施例は次の操作手順に従って行われた。
水酸化第二鉄（FeO(OH)）粒子は、30〜50メッシュの材料を乳鉢と乳棒を用いて微粉状に磨砕して得た。得られた粉末を4分間水溶液に沈殿させた。上清を抽出し、さらに15分間沈殿させた。ペレット化した沈殿物を磁気によって分離し、脱イオン水で磁気によって洗浄した。次に得られた物質を20μm濾紙で濾過し、一晩37℃で乾燥した。得られた物質60μgを480μlの脱イオン水を含む管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。同様に、乾燥した（FeO(OH)）240μgを480μlの脱イオン水を含む管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。
【００５０】
更に、60μgのFe3O4（325番のふるいを88〜92％通過するような大きさにしたもの）を480μlの脱イオン水の入った管に移した。得られたスラリーを6本の2ml遠心管に計量分配した。別のスラリーを乾燥した240mgのFe3O4を480μlの脱イオン水の入った管に移して作成した。このスラリーを6本の2ml遠心管に移した。リン酸塩緩衝液においてトラコーマクラミジア溶液を0 EB／ml、1,000EB／mlと4,000EB／mlに調製した。各濃度のトラコーマクラミジア溶液を各種粒子の入っている2本の管に計量して小分けした。管を105℃で30分間加熱した。各種粒子の入った管の一本に80μlの酢酸を加え、管を転倒型ロッカー（end over end rocker）に30分間保持した。次にこれらの管を磁気によって分離し、1回あたり1.0mlの25mMの酢酸で2回洗浄した。各管にあたって、500μlの150mMのKOHを15分間添加し、500μlの300mMのビシン2X試料緩衝液を各管に添加して、沸騰水浴上に5分間置いた。処理後の試料液は、トラコーマクラミジアBDプローブTecTMETシステムを用いて増幅した。
【００５１】
本実施例の結果を表５にまとめる。
【表５】
上述の結果から次の考察が導き出される。
MOTA陽性率値1,000を用いて、Fe3O4は1,000EB／mlのレベルまで核酸を抽出でき、これは、FeO(OH)の抽出力に匹敵する。マイナス酸の量が、より低い1,000EB／mlにおける陽性値とMOTA値に否定的な影響を与えた。
以上の実施例は、ここに記載した本願発明の代表的な実施態様に過ぎない。当分野の当業者にとって、多くの変更と改良が可能であることは明白なものであるが、それもまた本発明に係る発明の範囲内に属するものであろう。
Claims (10)
- 核酸分子を可逆的に結合するための組成物であって、酸性溶液中に表面被覆層を有しない粒子を含んでなり、前記表面被覆層を有しない粒子は磁場におかれた場合磁気モーメントを生じることができ、前記核酸は表面被覆層を有しない粒子自体と可逆的に結合することを特徴とする組成物。
- 前記表面被覆層を有しない粒子が鉄を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記表面被覆層を有しない粒子が酸化鉄、硫化鉄及び塩化鉄からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記酸化鉄が水酸化第二鉄又は磁性酸化鉄であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
- 酸性溶液と共にパッケージされた表面被覆層を有しない粒子を含んでなる、核酸分子を可逆的に結合するためのキットであって、前記表面被覆層を有しない粒子は磁場におかれた場合磁気モーメントを生じることができ、前記核酸は表面被覆層を有しない粒子自体と可逆的に結合することを特徴とするキット。
- 前記表面被覆層を有しない粒子が鉄を含んでなることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
- 前記表面被覆層を有しない粒子が酸化鉄、硫化鉄及び塩化鉄からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
- （ａ）表面被覆層を有しない粒子を酸性溶液に懸濁させた懸濁液を作成するステップと、
（ｂ）前記懸濁液を核酸分子と結合させるステップと
を含んでなり、前記表面被覆層を有しない粒子は磁場におかれた場合磁気モーメントを生じることができ、前記核酸は表面被覆層を有しない粒子自体と可逆的に結合することを特徴とする、核酸分子を粒子に可逆的に結合させる方法。 - 前記表面被覆層を有しない粒子が鉄を含んでなることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 前記表面被覆層を有しない粒子が酸化鉄、硫化鉄及び塩化鉄からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
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