ES2270556T3 - Metodo para la purificacion y manipulacion de acidos nucleicos utilizando p0articulas paramagneticas. - Google Patents
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Abstract
Un método para unir reversiblemente al menos una molécula de ácido nucleico a al menos una partícula de unión a ácido nucleico, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una suspensión de al menos una partí- cula de unión a ácido nucleico en una solución ácida, en que dicha al menos una partícula de unión a ácido nucleico consiste solamente en un material paramagnético; y (b) combinar dicha suspensión con al menos una molécu- la de ácido nucleico, de forma que tenga lugar una unión electrostática reversible entre dicha al menos una molécula de ácido nucleico y dicha al menos una partícula de unión a ácido nucleico.
Description
Método para la purificación y manipulación de
ácidos nucleicos utilizando partículas paramagnéticas.
El acceso a los componentes celulares como
ácidos nucleicos es imperativo para una diversidad de metodologías
de biología molecular. Estas metodologías incluyen el secuenciado de
ácido nucleicos, detección directa de secuencias particulares de
ácidos nucleicos por hibridación de ácidos nucleicos y técnicas de
amplificación de secuencias de ácidos nucleicos.
La preparación y purificación de ADN plásmido de
doble cadena (ds) de pureza elevada, ADN de fago de cadena única
(ss), ADN cromosomal, fragmentos de ADN purificado por gel de
agarosa y ARN es de importancia crítica en biología molecular. De
forma ideal, un método para purificar ácidos nucleicos debe ser
sencillo, rápido y requerir poca o ninguna manipulación adicional
de muestras. Los ácidos nucleicos producidos por este método deben
ser inmediatamente utilizables para transformación, análisis de
restricción, ligado o secuenciado. Un método con todas estas
características será extremadamente atractivo en la automatización
de la preparación de muestras de ácidos nucleicos, un objetivo de
los laboratorios de investigación y diagnóstico.
Normalmente, la preparación de ADN de plásmido a
partir de precipitados en alcohol en bruto es laboriosa, muy a
menudo utilizando gradientes de CsCl, filtración por gel,
cromatografía de intercambio iónico o RNasa, proteinasa K y etapas
repetidas de precipitación en alcohol. Estos métodos requieren
también una considerable preparación de muestras posteriores para
separar CsCl y otras sales, bromuro de etidio y alcohol. Se ofrecen
argumentos similares cuando se usa cualquiera de estos métodos para
purificar fragmentos de ADN. Un problema adicional con estos
métodos es que con el ADN se pueden purificar conjuntamente
componentes celulares pequeños con carga negativa. Por tanto, el
ADN puede tener un nivel no deseable de contaminación.
Los ácidos nucleicos pueden ser purificados
también usando fases sólidas. Las técnicas convencionales de
extracción de fases sólidas han utilizado superficies que (1) no
consiguen atraer ni mantener suficientes cantidades de moléculas de
ácidos nucleicos debido a que el diseño de la superficie permite una
fácil recuperación de las moléculas de ácidos nucleicos durante la
elución, o bien (2) adhieren excesivamente moléculas de ácidos
nucleicos a la superficie, obstaculizando así la recuperación de
moléculas de ácidos nucleicos durante la elución. Las superficies
metálicas convencionales que provocan estos problemas cuando son
utilizadas en una extracción en fase sólida incluyen ciertas
superficies de sílice como vidrio y Celite. La unión adecuada a
ácidos nucleicos de estos tipos de superficies puede ser conseguida
solamente utilizando concentraciones elevadas de caotropos o
alcoholes que son generalmente tóxicos, cáusticos y/o caros. Por
ejemplo, es conocido que el ADN se une a polvos de vidrio triturado
y a filtros de fibra de vidrio en presencia de caotropos. Los iones
caotrópicos normalmente son separados por lavado con alcohol, y los
ADN son eluidos con soluciones de baja concentración salina o agua.
De forma importante, el ARN o la proteína no se unen. Sin embargo,
un inconveniente grave del uso de polvo de vidrio triturado es que
su capacidad de unión es baja. Además, los polvos de vidrio a menudo
adolecen de una recuperación inconsistente, incompatibilidad con
tampones de boratos y tendencia a mellar ADN grandes. Otras sílices,
como el gel de sílice y gránulos de sílice, no son adecuadas para la
unión y recuperación de ADN. Actualmente, la fase sólida de
elección para la extracción de la fase sólida de ADN es Celite como
la encontrada en Prep-A-Gene® y
Laboratorios Bio-Rad. Como con los polvos de vidrio
triturado, son necesarias concentraciones elevadas de caotropos para
una unión adecuada del ADN a la
Celite.
Celite.
Sin embargo, la hidratación de sustancias de
sílice ha dado lugar en algunos casos a la eliminación de la
necesidad de estas concentraciones elevadas de caotropos para eluir
el ADN unido de la sustancia de sílice es expuesta en referencias
como EP 0.512.767, EP 0.585.660, US 5.674.997 y EP 0.832.897.
Hay numerosos protocolos para purificar ADN. Por
ejemplo, la patente de EE.UU. 4.923.978 describe un procedimiento
para purificar ADN en el que una solución de proteína y ADN se hace
pasar sobre un soporte hidroxilado y seguidamente la proteína es
unida y el ADN es eluido. La patente de EE.UU. 4.935.342 describe la
purificación de ADN mediante la unión selectiva de ADN a
intercambiadores aniónicos y posterior elución. La patente de EE.UU.
4.946.952 describe el aislamiento de ADN por precipitación con
cetonas solubles en agua. Un procedimiento de purificación de ADN
usando caotropos y ADN dializado es descrito en la patente de EE.UU.
4.900.677.
Se han utilizado también diátomos para la
purificación de ácidos nucleicos, como evidencia la patente de
EE.UU. nº 5.234.809 de Boom y cols. y la patente de EE.UU. nº
5.075.430 de Little y cols.
Todavía, una técnica adicional utilizada para la
purificación de ácidos nucleicos es la unión a partículas
paramagnéticas específicamente adaptadas. Ejemplos de estas técnicas
se pueden encontrar en referencias como la memoria descriptiva
europea EP 0.446.260 B1 y patente de EE.UU. 5.512.439 (Hornes y
cols.) que describen partículas superparamagnéticas monodispersas
que tienen una desviación típica del tamaño de partículas de menos
de 5%. Cada partícula porta una pluralidad de moléculas de un
oligonucleótido, en la que cada oligonucleótido tiene una sección
que sirve como una sonda para una molécula de ácido nucleico diana
de interés.
\newpage
La patente de EE.UU. nº 4.672.040 (Josephson) y
la patente de EE.UU. nº 4.695.393 (Whitehead y cols.) describen
partículas magnéticamente sensibles para ser usadas en sistemas para
separar ciertas moléculas. Las partículas tienen un núcleo de óxido
metálico rodeado por un revestimiento de silicona estable al que
pueden estar acopladas moléculas orgánicas y/o biológicas.
El documento EP 0.818.461 describe un método
para el aislamiento de ácido ribonucleico, que comprende disolver
una muestra biológica en una solución ácida que contiene una sal de
litio y un agente caotrópico, y poner en contacto la muestra
biológica disuelta con partículas complejas hechas de un portador de
unión a ácido nucleico, como sílice, y un material magnético.
La patente de EE.UU. nº 3.970.518 (Giaever)
describe un método para clasificar y separar una población de
células seleccionadas de una población de células mezcladas. El
método utiliza partículas magnéticas pequeñas que están revestidas
con un anticuerpo a las poblaciones de células seleccionadas.
La patente de EE.UU. nº 4.141.687 (Forrest y
cols.) describe un aparato automático y un método para ensayar
muestras de fluidos. El aparato utiliza un material en forma de
partículas con un reactivo unido al mismo. El material en forma de
partículas es magnético, y el reactivo es una sustancia que toma
parte en una reacción en la mezcla de reacción.
La patente de EE.UU. nº 4.230.685 (Senyei y
cols.) describe un método para la separación magnética de células.
El método utiliza microesferas magnéticamente sensibles que están
revestidas con Proteína A de estafilococos a la que está unido un
anticuerpo.
La patente de EE.UU. nº 4.774.265 (Ugelstad y
cols.) describe un procedimiento para preparar partículas polímeras
magnéticas. Las partículas son partículas de polímero compactas o
porosas tratadas con una solución de sales de hierro.
La patente de EE.UU. nº 5.232.782 (Charmot)
describe microesferas magnetizables de
"núcleo-corteza" que tienen un núcleo de
relleno magnetizable un una corteza de organopolisiloxano
reticulado.
La patente de EE.UU. nº 5.395.688 (Wang y cols.)
describe partículas polímeras fluorescentes magnéticamente
sensibles que tienen un núcleo polímero revestido uniformemente con
una capa de óxido metálico magnéticamente sensible que contiene
polímero.
La patente de EE.UU. nº 5.491.068 y la patente
de EE.UU. nº 5.695.946 (Benjamin y cols.) describen un método de
ensayo para detectar la presencia de bacterias usando gránulos
magnéticos con anticuerpos específicos inmovilizados en los
mismos.
La patente de EE.UU. nº 5.536.644 (Ullman y
cols.) describe un método de separación de partículas. El método
utiliza partículas magnéticas con grupos funcionales superficiales
y, opcionalmente, un revestimiento superficial adicional.
La memoria descriptiva de la patente europea EP
0.444.120 B1 (Hornes y cols.) describe un método para la detección
de ARN o ADN diana. El método utiliza partículas magnéticas que
portan una sonda de ADN unida en 5' de cadena única capaz de unirse
a ARN o ADN diana.
La publicación internacional nº WO 96/18731
(Deggerdal y cols.) describe un método para aislar ácido nucleico
de una muestra usando un soporte sólido en forma de partículas y un
detergente aniónico.
La patente de EE.UU. nº 5.705.628 (Hawkins)
describe un método para la purificación y aislamiento de ADN usando
partículas magnéticas con superficies revestidas con grupos
funcionales.
El documento EP 0818461 describe el uso de un
material paramagnético encapsulado en una partícula de gel de
sílice para la unión específica a una molécula de ácido nucleico en
una solución ácida. El documento US 5.523.231 describe la
precipitación de moléculas de ácidos nucleicos de una solución
mediante la agregación alrededor de gránulos paramagnéticos.
Con el fin de proporcionar una técnica más
efectiva y eficiente para la purificación y manipulación de ácidos
nucleicos, la presente invención se refiere a un método para la
unión electrostática reversible de una molécula de ácido nucleico,
usando una composición que incluye una partícula paramagnética en un
entorno ácido. La partícula paramagnética consiste solamente en un
material paramagnético.
Las composiciones de materia usadas en el método
de la invención son una partícula paramagnética en una solución
ácido, es decir, una solución que tiene un pH menor que
aproximadamente 7,0. La partícula paramagnética consiste solamente
en un material paramagnético.
Los solicitantes encontraron que cuando están en
un entorno ácido, las partículas paramagnéticas se unirán
reversiblemente a las moléculas de ácidos nucleicos sin necesidad
de un detergente aniónico, como se expone en la publicación
internacional nº WO 96/18731. Aunque no se desean vinculaciones
particulares de carácter teórico, los solicitantes creen que un
entorno ácido aumenta la naturaleza electropositiva de la parte de
hierro de las moléculas, y por tanto aumenta la unión de las
moléculas a la parte electronegativa de fosfato de una molécula de
ácido
nucleico.
nucleico.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la expresión "partículas paramagnéticas" significa partículas
que son capaces de tener un momento magnético conferido a las mismas
cuando se colocan en un campo magnético. Por lo tanto, estas
partículas paramagnéticas, cuando están en este campo magnético, son
desplazables bajo la acción de este campo. Este movimiento es útil
para desplazar las moléculas de ácidos nucleicos unidas para
diferentes aspectos del protocolo de tratamiento de las muestras u
otras manipulaciones. Por tanto, las moléculas de ácidos nucleicos
unidas a las partículas paramagnéticas pueden ser desplazadas a
diferentes zonas para ser expuestas a diferentes reactivos y/o
estados con un contacto directo mínimo debido a la aplicación de una
fuerza magnética.
Los solicitantes han encontrado que las
partículas paramagnéticas útiles en la presente invención no es
necesario que sean estructuras complicadas. Por tanto, las
partículas de hierro son útiles en la presente invención, y el
hierro puede ser óxido de hierro de formas como hidróxido férrico y
óxido ferroso-férrico, que tienen una baja
solubilidad en un entorno acuoso. Otras partículas de hierro como el
sulfuro de hierro y el cloruro de hierro pueden ser también
adecuadas para la unión y extracción de ácidos nucleicos usando las
condiciones descritas en la presente memoria descriptiva.
Análogamente, la forma de las partículas
paramagnéticas no es crítica para la presente invención. Por tanto,
las partículas paramagnéticas pueden ser de diversas formas,
incluidas, por ejemplo, esferas, cubos, oval, en forma de cápsulas,
en forma de comprimidos, en formas al azar no descritas, etc., y
pueden ser de forma uniforme o de formas no uniformes. Cualquiera
que sea la forma de una partícula paramagnética, su diámetro en su
punto más ancho está generalmente en el intervalo de aproximadamente
0,5 \mum a aproximadamente 20 \mum.
El entorno ácido en el que las partículas se
unen de forma efectiva y reversible a las moléculas de ácidos
nucleicos puede ser proporcionado a través de una diversidad de
medio. Por ejemplo, las partículas paramagnéticas pueden ser
añadidas a una solución ácida, o puede ser añadida una solución
ácida a las partículas. Alternativamente, una solución o entorno en
el que están colocadas las partículas paramagnéticas puede ser
acidificado mediante la adición de un agente acidificante como
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético y ácido
cítrico.
Con la condición de que el entorno en que están
colocadas las partículas paramagnéticas sea de un pH menor que
aproximadamente 7,0, las partículas se unirán reversiblemente a las
moléculas de ácidos nucleicos. Además de ello, los solicitantes han
encontrado que la capacidad de unión a ácido nucleico de las
partículas paramagnéticas aumenta a medida que disminuye el pH.
Se cree que para las partículas paramagnéticas
útiles en la presente invención el entorno ácido permite eliminar
la necesidad de detergentes, como se expone en ciertas referencias
como la solicitud internacional nº WO 96/18731. Aunque no se desean
vinculaciones de carácter teórico, el solicitante cree que no son
necesarios detergentes para la presente invención, porque la
solución ácida de la presente invención favorece la unión de
partículas paramagnéticas electropositivas a las moléculas de
ácidos nucleicos electronegativas, de forma preferente sobre otras
sustancias en una muestra, como en inhibidores de hibridación y
amplificación de ácidos nucleicos. Por el contrario, la utilización
de detergentes, como se expone en referencias como la publicación
internacional nº WO 96/18731, es para solubilizar inhibidores de
hibridación y amplificación de ácidos nucleicos con el fin de que
estos inhibidores no interfieran con la unión de las moléculas de
ácidos nucleicos a partículas paramagnéticas.
Como se estableció anteriormente, en un entorno
ácido, las partículas paramagnéticas electropositivas, como las
partículas de óxido férrico, se unirán a moléculas electronegativas
de ácidos nucleicos. Por tanto, otros materiales en el entorno,
como inhibidores de hibridación y amplificación de ácidos nucleicos,
pueden ser separados de las moléculas unidas de ácidos nucleicos.
Esta separación se puede realizar por medios conocidos por los
expertos en la técnica, como centrifugación, filtración o aplicación
de una fuerza magnética.
Las moléculas unidas de ácido nucleico pueden
ser seguidamente eluidas en un tampón apropiado para una
manipulación adicional, como reacciones de hibridación o
amplificación. Esta elución se puede realizar calentando el entorno
de las partículas con ácidos nucleicos unidos y/o elevando el pH de
este entorno. Los agentes que pueden ser usados para ayudar a la
elución de ácidos nucleicos de partículas paramagnéticas incluyen
soluciones básicas como hidróxido de potasio, hidróxido de sodio o
cualquier compuesto que aumente el pH del entorno hasta un alcance
suficiente para que el ácido nucleico electronegativo sea desplazado
de las partículas.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones
específicas de la invención descritas en este documento.
\newpage
Este ejemplo fue diseñado para comparar la unión
de ácidos nucleicos con óxido de hierro para unir un ácido nucleico
con circonio a tres niveles dianas de aportación.
Se usaron los siguientes materiales en este
ejemplo.
- Una preparación de Chlamydia
trachomatis
- Tampón de fosfato
- Tampón para muestras para el sistema
BDProbeTec® ET
- Partículas de óxido de hiero hidratado
(FeO(OH)) (malla 30 = 300-1200
micrómetros)
- Óxido de circonio hidratado
- Glicina HCl
- Pocillos de cebado y amplificación de
Chlamydia trachomatis para el sistema BDProbeTec® ET
- Alcohol etílico.
El procedimiento seguido para los ejemplos fue
como sigue.
Se prepararon soluciones de Chlamydia
trachomatis a 5.000 estructuras elementales (EB)/ml, 1.000
EB/ml, 500 EB/ml y 0 EB/ml en tampón de fosfato y cada solución fue
transferida a doce tubos de centrifugadora/nivel punteado. Los
tubos fueron calentados a 105ºC durante 30 minutos. Partículas de
óxido de hierro hidratado con DiH_{2}O fueron suministradas por
gravedad a seis tubos a cada uno de los niveles punteados de
Chlamydia trachomatis a 10 mg/tubo. Se suministraron
partículas de circonio hidratado en tres tubos que contenía cada
nivel punteado de Chlamydia trachomatis a 10 mg/tubo. No se
añadieron partículas a los tres tubos de cada nivel. Se
suministraron 30 \mu de glicina-HCl 3 M a cada
tubo anteriormente descrito, y los tubos se colocaron en un
dispositivo basculador de extremo sobre extremo durante 30 minutos.
Tres tubos/nivel punteado de los tubos de óxido de hierro, los
tubos de circonio hidratado y los tubos que no contenían partículas
fueron centrifugados para separar, y fueron lavados una vez con 1
ml/tubo de EtOH al 95%, una vez con 1 ml/tubo de DiH_{2}O y se
volvieron a poner en suspensión con 1 ml/tubo de tampón para
muestras. Los otros tres tubos/nivel punteado que contenían óxido
de hierro fueron magnéticamente separados colocando un imán
adyacente al tubo, las muestras se extrajeron y los tubos se
lavaron con 1,0 ml de EtOH/tubo. La solución se separó
magnéticamente durante 3,0 minutos y se añadió 1,0 ml de DiH_{2}O
a cada tubo. La solución se separó magnéticamente durante 3,0
minutos y se añadió 1,0 ml de tampón para muestras a cada tubo. Los
tubos se calentaron durante 30 minutos a 105ºC y se amplificaron en
el sistema de Chlamydia trachomatis BDProbeTec® ET. El
sistema BDProbeTec® ET es un sistema
semi-automatizado, públicamente descrito para la
amplificación homogénea y la detección en tiempo real de moléculas
dianas de ácidos nucleicos.
Los resultados de este ejemplo fueron como
sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Las conclusiones extraídas a partir de los
resultados fueron como sigue.
Los valores MOTA (suma de unidades individuales
de medición a lo largo del tiempo) son una unidad interna
fluorescente de Becton Dickinson con un nivel de corte establecido
para positividad a 1.000 MOTA. El óxido de hierro magnéticamente
separado produjo la misma positividad que las partículas de circonio
hidratado. Los tubos que no contenían partículas no produjeron
resultados apreciables incluso al nivel de 5.000 EB/ml. Este
experimento demostró que el óxido de hierro hidratado se une al ADN
bajo condiciones ácidas.
Este ejemplo se realizó para determinar si el
ADN podría ser eluido y desnaturalizado usando hidróxido de potasio
(KOH) solo sin calor. Además, el ejemplo se realizó para determinar
que tampón de nuetralización/muestra produce valores óptimos de
MOTA.
Los materiales usados en este ejemplo fueron
como sigue.
- una solución de KOH 70 mM
- un tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis, Bicine 2X 100 mM (20% DMSO, 18% glicerol, 0,06%
Proclina, Tween 20 0,013 mM y KPO_{4} 60 mM)
- un tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis, Bicine 2X 200 mM
- un tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis, Bicine 2X 300 mM
- un tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis (10% DMSO, 9% glicerol, 0,03% Proclina, Tween 20
0,065 mM y KPO_{4} 30 mM)
- Partículas de circonio hidratado
- Partículas de óxido de hierro hidratado
- Una preparación de Chlamydia
trachomatis
- Alcohol etílico (EtOH) al 95%
- Tampón de fosfato.
El procedimiento seguido para este ejemplo fue
como sigue.
Se prepararon soluciones de Chlamydia
trachomatis a 1.000 EB/ml y 5.000 EB/ml en tampón de fosfato y
se suministraron a 32 tubos de centrifugadora de 2 ml/nivel
punteado a 1,0 ml/tubo. Se suministró óxido de hierro hidratado a
16 tubos/nivel punteado a 10 mg/tubo y se añadieron a cada tubo 60
\mul de glicina-HCl 3 M. Se suministraron
partículas de circonio hidratado a 16 tubos/nivel punteado a 10
mg/tubo y se añadieron a cada tubo 30 \mul de
glicina-HCl 3 M. Los tubos se mantuvieron en un
dispositivo rotatorio de extremo sobre extremo durante 30 minutos.
Los tubos de óxido de hierro se separaron magnéticamente y
seguidamente se lavaron con 1,0 ml de EtOH y seguidamente 1,0 ml de
DiH_{2}O. Los tubos de partículas de circonio se
centrifugaron-lavaron una vez con un ml de EtOH y
seguidamente con un ml de DiH_{2}O. A doce tubos de cada tipo de
partículas y nivel punteado se añadieron 500 \mul de KOH 70 mM
durante 15 minutos. De los doce tubos, a cuatro tubos de ambos tipos
de partículas y nivel punteado se añadieron tampón para muestras de
Chlamydia trachomatis 2X 100 mM (agua/fosfato) a cada tubo a
500 \mul. De los doce tubos, a cuatro tubos de ambos tipos de
partículas y nivel punteado se añadieron tampón para muestras de
Chlamydia trachomatis 2X 200 mM (agua/fosfato) a cada tubo a
500 \mul. De los doce tubos, a cuatro tubos de ambos tipos de
partículas y nivel punteado se añadieron tampón para muestras de
Chlamydia trachomatis 2X 300 mM (agua/fosfato) a cada tubo a
500 \mul. A los cuatro tubos restantes se añadió 1,0 ml de tampón
para muestras. Dos tubos de cada tipo de partículas, nivel punteado
y tipo de tampón se colocaron en un baño de agua en ebullición
durante cinco minutos. El fluido de la muestra fue seguidamente
amplificado de forma inmediata en el sistema BDProbeTec® ET para
Chlamydia trachomatis.
Los resultados de este ejemplo fueron como
sigue.
Las conclusiones extraídas a partir de estos
resultados fueron como sigue.
Los resultados indican que el ADN pudo ser
eluido y desnaturalizado a partir de partículas de óxido de hierro
hidratado y óxido de circonio hidratado con KOH solo (sin calor) y
que los tampones de neutralización que produjeron valores MOTA
óptimos fueron los tampones de neutralización Bicine 2X 200 y 300
mM.
Este ejemplo se realizó para determinar si el
óxido de hierro hidratado a pH bajo puede ser usado para extraer
ADN de Chlamydia trachomatis a partir de muestras de orina
punteadas.
Los materiales usados en este ejemplo fueron
como sigue.
- Muestras de orina
- Preparaciones de Chlamydia
trachomatis
- Tampón para muestras
- Partículas de circonio hidratado
- Partículas de óxido de hierro hidratado
- Alcohol etílico (EtOH) al 95%
- Glicina HCl
- Pocillos de cebador de sistema BDProbeTec® ET
para Chlamydia trachomatis y pocillos de amplificación.
El procedimiento seguido para este ejemplo fue
como sigue.
Cada una de diez muestras de orina fue dividida
en dos tres partes alícuotas de 2 ml y las muestras de orina fueron
punteadas con preparación de Chlamydia trachomatis a 1.000
EB/ml, 2.500 EB/ml y 5.000 EB/ml. Las muestras de orina se
dividieron en volúmenes de 1,0 ml en tubos de centrifugadora de 2
ml. Seguidamente se suministraron 10 mg de partículas de óxido de
hierro hidratado en un tubo a cada nivel punteado para cada muestra.
Se añadieron 60 \mul de glicina-HCl 3 M a cada
tubo de óxido de hierro. Los tubos se mantuvieron en un dispositivo
rotatorio de extremo sobre extremo durante 30 minutos. Además, se
suministraron 10 mg de partículas de circonio hidratado en un tubo
a cada nivel punteado para cada muestra. SE añadieron 30 \mul de
glicina-HCl 3 M a cada tubo que contenía circonio
hidratado. Los tubos se mantuvieron en un dispositivo rotatorio de
extremo sobre extremo durante 30 minutos. Los tubos que contenían
partículas de circonio hidratado fueron
lavados-centrifugados a 10.000 g usando 1 ml de
EtOH y seguidamente 1 ml de DiH_{2}O. Los tubos se volvieron a
poner en suspensión con 1,0 ml de tampón para muestras. Los tubos
que contenían partículas de óxido de hierro fueron magnéticamente
separados, y seguidamente lavados usando 1 ml de EtOH y seguidamente
1,0 ml de DiH_{2}O y los tubos se volvieron a poner en suspensión
con 1,0 ml de tampón para muestras. El fluido de muestra de cada
tubo se llevó a ebullición durante 5 minutos y seguidamente se
amplificó usando el sistema BDProbeTec® ET para Chlamydia
trachomatis.
Los resultados de este ejemplo fueron como
sigue.
| Nivel de Chlamydia | Tipo de partícula | Positivos |
| 1.000 EB/ml | Óxido de hierro hidratado | 3/10 |
| 1.000 EB/ml | Circonio hidratado | 9/10 |
| 2.500 EB/ml | Óxido de hierro hidratado | 10/10 |
| 2.500 EB/ml | Circonio hidratado | 10/10 |
| 5.000 EB/ml | Óxido de hierro hidratado | 10/10 |
| 5.000 EB/ml | Circonio hidratado | 10/10 |
Las conclusiones extraídas a partir de los
resultados anteriores fueron como sigue:
La velocidad de positividad detectable cae al
mismo nivel con las partículas de circonio hidratado que con las
partículas de óxido de hierro hidratado. Esto indica un rendimiento
similar con los dos tipos de partículas. El óxido de hierro a un pH
bajo puede extraer ADN de muestras de orina.
Este ejemplo se realizó para determinar si el
óxido de hierro hidratado a un pH bajo puede ser usado para extraer
ADN de Chlamydia trachomatis a partir de muestras de plasma
punteadas. Además, este ejemplo se realizó para comparar un método
de extracción de ADN de plasma usando partículas de circonio
hidratado con un método de extracción de ADN de plasma usando
partículas de óxido de hierro hidratado.
Los materiales usados para este ejemplo fueron
como sigue.
- Tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis, Bicine 2X 300 mM
- Partículas de óxido de hierro hidratado
- Partículas de óxido de circonio hidratado
- Isotiocianato de guanidina
- Preparación madre de Chlamydia
trachomatis,
- Pocillos de cebador BDProbeTec® ET de
Chlamydia trachomatis y pocillos de amplificación
- Pocillos de cebador BDProbeTec® ET testigo de
amplificación interno (IAC) y pocillos de amplificación
- KOH 150 mM
- Muestras de plasma
- Alcohol etílico al 95%
Los procedimientos seguidos para este ejemplo
fueron como sigue.
Se añadió 1 ml de DiH_{2}O a ocho tubos de
centrifugadora de 2 ml que contenían 40 mg de partículas de óxido
de hierro hidratado. Las muestras de plasma fueron punteadas con
preparación de Chlamydia trachomatis a 9.000 EB/300 \mul,
6.000 EB/300 \mul, 3.000 EB/300 \mul y 1.500 EB/300 \mul.
Seguidamente se añadieron 300 \mul de cada muestra de plasma
punteadas a los tubos que contenían partículas de óxido de hierro
hidratado. Los tubos se calentaron a 105ºC durante 30 minutos.
Seguidamente se añadieron 80 \mul de ácido acético glacial a cada
tubo, y los tubos se colocaron en un dispositivo rotatorio de
extremo sobre extremo durante 30 minutos. Los tubos se colocaron
seguidamente en una estantería de tubos magnéticos y se retiró el
fluido de muestra tratada. Los tubos fueron magnéticamente
separados y seguidamente se lavaron con 1,0 ml de ácido acético 25
mM dos veces. El ADN fue eluido a partir de las partículas de óxido
de hierro hidratado con 500 \mul de KOH 150 mM durante 15 minutos.
Las soluciones se neutralizaron con 500 \mul de tampón 2X 300 mM.
Las muestras se colocaron en un baño de agua en ebullición durante
15 minutos. Las muestras fueron seguidamente amplificadas usando el
sistema BDProbeTec® ET para Chlamydia trachomatis.
Las dos mismas muestras de plasma del
procedimiento de óxido de hierro anterior fueron suministradas a 300
\mul/tubo en cuatro tubos de centrifugadora de 2,0 ml para cada
muestra de plasma. Se añadió isotiocianato de guanidina (GITC) 5
molar a cada tubo a 700 \mul. Los cuatro tubos de cada muestra
fueron punteados con preparación de Chlamydia trachomatis a
9.000 EB/300 \mul, 6.000 EB/300 \mul, 3.000 EB/300 \mul y
1.500 EB/300 \mul, respectivamente, y los tubos se mantuvieron a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Se preparó una suspensión
de partículas de óxido de circonio hidratado combinando 10 mg de
partículas de óxido de circonio con 30 \mul de
glicina-HCl 3 M. Treinta \mul de esta suspensión
fueron añadidos a cada tubo y los tubos se colocaron en un
dispositivo rotatorio de extremo sobre extremo durante 30 minutos.
Los tubos se centrifugaron a 10.000 g durante 3,0 minutos, la
materia sobrenadante se separó y se añadió 1,0 ml de GITC 2 M a cada
tubo. Los tubos se centrifugaron a 10.000 g durante 3,0 minutos, la
materia sobrenadante se separó y se añadió 1,0 ml de 80% de alcohol
etílico/20% de tampón Tris 50 mM a cada tubo. Los tubos se lavaron
dos veces adicionales centrifugando a 10.000 g durante 3,0 minutos,
extrayendo la materia sobrenadante y añadiendo 1,0 ml de DiH_{2}O.
El ADN se eluyó en 1,0 ml de KOH 150 mM/tampón para muestras Bicine
2X 300 mM. Las muestras se colocaron en un baño de agua en
ebullición durante cinco minutos. Las muestras se centrifugaron a
3.200 g y se amplificaron usando el sistema BDProbeTec® ET para
Chlamydia trachomatis.
Se punteó tampón para muestras con preparación
de Chlamydia trachomatis a 9.000 EB/300 \mul, 6.000 EB/300
\mul, 3.000 EB/300 \mul y 1.000 EB/300 \mul. Las muestras se
colocaron en un baño de agua en ebullición durante cinco minutos y
se amplificaron usando el sistema BDProbeTec® ET para Chlamydia
trachomatis.
Los resultados de este ejemplo fueron como
sigue.
Las conclusiones extraídas a partir de los
resultados anteriores fueron como sigue.
Usando un valor de positividad MOTA de 1.000, el
óxido de hierro hidratado fue capaz de extraer ADN de muestras de
plasma hasta 3.000 EB/300 \mul.
Este ejemplo fue diseñado para comparar dos
partículas de captura de ácidos nucleicos: hidróxido férrico (óxido
férrico hidratado) y óxido ferroso-férrico bajo
condiciones de unión neutras y ácidas.
Los materiales usados para este ejemplo fueron
como sigue.
- Tampón de fosfato
- Partículas de hidróxido férrico
(FeOH(OH))
- Partículas de óxido
ferroso-férrico (Fe_{3}O_{4})
- Preparación de Chlamydia
trachomatis
- Pocillos de cebador de sistema BDProbeTec®
para Chlamydia trachomatis y pocillos de amplificación
- Ácido acético
- KOH 150 mM
- Tampón para muestras de Chlamydia
trachomatis, Bicine 2X 300 mM
El procedimiento seguido para este ejemplo fue
como sigue.
Se preparó polvo de hidróxido férrico
(FeO(OH)) triturando con un dispositivo molcajete un material
de malla 30-50 hasta dar un polvo fino. El polvo se
dejó sedimentar en una solución acuosa durante cuatro minutos. La
materia sobrenadante se extrajo y el material se dejó sedimentar
durante cincuenta minutos adicionales. Seguidamente el material
sedimentado fue magnéticamente separado y fue magnéticamente lavado
con DiH_{2}O. El material fue seguidamente filtrado en papel de
filtro de 20 \mum y se secó durante una noche a 37ºC. Seguidamente
se transfirieron 60 \mug del material a un tubo que contenía 480
\mul de DiH_{2}O. Esta suspensión fue dispersada en seis tubos
de centrifugadora de 2 ml. También se transfirieron 240 \mug de
material de FeO(OH) seco a un tubo que contenía 480 \mul de
DiH_{2}O. La suspensión creada se transfirió a seis tubos de
centrifugadora de 2 ml.
Además, se transfirieron 60 \mug de
Fe_{3}O_{4} (dimensionados a 88-92% de paso por
un tamiz 325) a un tubo que contenía 480 \mul de DiH_{2}O. La
suspensión creada fue suministrada a seis tubos de centrifugadora de
2 ml. Se creó otra suspensión transfiriendo 240 mg de material de
Fe_{3}O_{4} seco a un tubo que contenía 480 \mul de
DiH_{2}O. Esta suspensión fue seguidamente transferida a seis
tubos de centrifugadora de 2 ml. Se prepararon soluciones de
Chlamydia trachomatis a 0 EB/ml, 1.000 EB/ml y 4.000 EB/ml en
tampón de fosfato. Cada concentración de solución ce Chlamydia
trachomatis fue suministrada a dos tubos de cada tipo de
partículas. Los tubos se calentaron a 105ºC durante 30 minutos. Se
añadió una parte alícuota de 80 \mul de ácido acético a un tubo
de cada tipo de partículas, y los tubos se mantuvieron en un
dispositivo rotatorio de extremo sobre extremo durante 30 minutos.
Seguidamente los tubos fueron magnéticamente separados y lavados con
1.0 ml de ácido acético 25 mM/lavado dos veces. Se añadió una parte
alícuota de KOH 150 mM a cada tubo a 500 \mul/tubo durante 15
minutos y se añadieron 500 \mul de tampón para muestras Bicine 2X
300 mM a cada tubo y los tubos se colocaron en un baño de agua en
ebullición durante cinco minutos. El fluido de muestra fue
amplificado usando el sistema BDProbeTec® ET para Chlamydia
trachomatis.
Los resultados a partir de este ejemplo fueron
como sigue.
Las conclusiones extraídas a partir de los
resultados anteriores fueron como sigue.
Usando un valor de positividad MOTA de 1.000, El
Fe_{3}O_{4} puede extraer ácido nucleico de 1.000 EB/ml, que es
comparable a la capacidad de extracción de FeO(OH) con ambas
masas. Un volumen de ácido negativo ejerció un impacto negativo
tanto sobre el número de valores positivos al nivel inferior de
1.000 EB/ml como sobre los valores MOTA.
Claims (3)
1. Un método para unir reversiblemente al menos
una molécula de ácido nucleico a al menos una partícula de unión a
ácido nucleico, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una suspensión de al menos una
partícula de unión a ácido nucleico en una solución ácida, en que
dicha al menos una partícula de unión a ácido nucleico consiste
solamente en un material paramagnético; y
(b) combinar dicha suspensión con al menos una
molécula de ácido nucleico, de forma que tenga lugar una unión
electrostática reversible entre dicha al menos una molécula de ácido
nucleico y dicha al menos una partícula de unión a ácido
nucleico.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el material paramagnético comprende hierro.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el material paramagnético se selecciona entre el grupo que consiste
en un óxido de hierro, sulfuro de hierro y cloruro de hierro.
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