ES2245088T3 - Dispositivo y procedimiento para la transferencia de particulas magneticas. - Google Patents

Abstract

Dispositivo de transferencia (2, 2'', 2", 2'''''') adecuado para capturar y liberar micropartículas (12) que comprenden una sustancia inmovilizada unida, caracterizado porque el dispositivo comprende un imán (8), así como una membrana extensible (18, 18'') de material elastomérico, de tal modo que la membrana (18, 18'') esté estrechamente presionada contra la superficie del imán y separe el imán (8) de las micropartículas (12) pero no debilite sustancialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas (12).

Description

Dispositivo y procedimiento para la transferencia de partículas magnéticas.

La invención se refiere a un procedimiento para transferir una sustancia inmovilizada a un material magnético o magnetizable con la ayuda de un imán. La invención se caracteriza porque el imán utilizado para la transferencia está separado del material que debe transferirse por una membrana extensible de material elastomérico.

Antecedentes de la técnica

En el procedimiento tradicional para separar material magnetizable, se utiliza un imán que está fuera del recipiente. El material magnetizable se deja en el recipiente y la disolución que rodea se extrae del recipiente.

Mediante la introducción del imán en la disolución, se obtienen grandes ventajas cuando se recoge el material magnetizable, en comparación con los procedimientos tradicionales. Es especialmente notable que, en este caso, el material magnetizable puede liberarse de manera simple y efectiva del recipiente. Cuando se introduce el imán en la disolución, la distancia del imán del material magnetizable es más corta que cuando se utiliza un imán exterior. Además, debido a la tensión superficial del fluido, recoger el material magnetizable dejado en la interfase de la disolución se lleva a cabo de manera más efectiva cuando el imán se introduce en la disolución.

La bibliografía de patentes presenta numerosos dispositivos para separar material magnetizable. La publicación de patente internacional WO 87/05536 da a conocer un dispositivo de separación en cuyo interior puede utilizarse un imán permanente que se mueve dentro de un manguito de plástico para transferir el material magnetizable de un recipiente a otro. Las publicaciones de patentes finlandesas (FI 86 05002, FI 95 03669, FI 9701665, FI 97 01666, FI
97 01667 y FI 97 01668) dan a conocer asimismo varios procedimientos basados en la utilización de un imán permanente para transferir el material magnetizable de un recipiente a otro. Las publicaciones de patente US nº 4.272.510, US nº 4.649.116 y US nº 4.751.053 dan a conocer transferencias de material magnético basadas en la utilización de un electroimán, principalmente en ensayos RIA y EIA. La publicación de patente US nº 5.567.326 describe un equipo para la separación de partículas magnéticas de una disolución de reacción no magnética con la ayuda de una clavija de acero magnetizable con un imán permanente. Normalmente, el equipo incluiría una placa de reacción con múltiples pocillos en la que las partículas magnéticas pueden separarse concomitantemente en muchos pocillos de reacción vecinos utilizando un dispositivo de transferencia con muchas clavijas magnetizables. El procedimiento descrito en la publicación de patente US nº 5.567.326 es muy tedioso de utilizar. Es necesario lavar o esterilizar las clavijas de acero no protegidas entre cada tiempo de utilización. Hay un grave riesgo de contaminación en el procedimiento mencionado anteriormente si el lavado no es suficiente.

Los procedimientos y/o dispositivos para transferir partículas magnéticas también se han dado a conocer en los documentos WO 95/00247, WO 96/12959 y EP 0 687 505.

Las partículas magnéticas se han descrito en numerosas publicaciones de patente, por ejemplo en las patentes US publicadas bajo los números nº 3 970 518; nº 4 018 886; nº 4 230 685; nº 4 267 234; nº 4 452 773; nº 4 554 088; nº 4 659 678; nº 4 978 610; nº 5 200 084 y nº 5 705 628. La tecnología que utiliza partículas se hizo muy popular por ejemplo en inmunoanálisis. La utilización de partículas magnetizables para la separación de complejos unidos de antígeno - anticuerpo de la fracción no unida en inmunoanálisis ofreció ventajas principales tanto en la velocidad de la reacción como en la viabilidad de la separación.

Las partículas magnéticas en disolución de reacción con material biológico unido, por ejemplo, células o un anticuerpo, se han fijado, una vez que ha tenido lugar la reacción, con la ayuda del imán fuera del recipiente en una localización determinada, con lo que la disolución puede liberarse sin que las partículas magnéticas salgan del recipiente.

La utilización de partículas magnéticas es beneficiosa porque cuando se manipulan muestras, no son necesarios instrumentos caros o que ocupen espacio, tales como centrífugas, bombas de vacío o columnas cromatográficas. Las aplicaciones de la partícula magnética son simples de realizar y los volúmenes utilizados en ellas pueden variar, según la utilización, de pequeños a grandes.

Hasta ahora, se utilizan partículas magnéticas, entre otros, en inmunoanálisis, separación de células y bacterias, aislamiento de ácidos nucleicos así como purificación de proteínas.

En la biología molecular muchas operaciones tales como el aislamiento y/o la transferencia de ácidos nucleicos, así como la utilización de enzimas de restricción o que modifican ácidos nucleicos, plantean problemas. Entre ellos se encuentra la inactivación de las enzimas, la extracción con disolventes y la actividad estrella (star-activity).

Tradicionalmente, los ácidos nucleicos se aislan y se transfieren mediante varias precipitaciones y extracción con disolventes. Se han presentado algunos procedimientos de compensación como ayuda en el manejo de los ácidos nucleicos. Sin embargo, estos procedimientos en general son caros y requieren etapas de centrifugación. Además, en algunos de estos procedimientos, la recuperación del ácido nucleico en un volumen suficientemente pequeño tras la operación es difícil.

En los procedimientos de biología molecular, en los que se manipula ADN o ARN, se utilizan enzimas de restricción, así como enzimas de modificación de ADN y/o ARN. La utilización de estas enzimas es de esencial importancia en casi todo el trabajo en el campo de la biología molecular. Las enzimas más preeminentes en los laboratorios de biología molecular son las enzimas de restricción. Estas enzimas han hecho posible importantes desarrollos en el campo. La utilización de enzimas de restricción o enzimas de modificación de ácidos nucleicos en aplicaciones de biología molecular es principalmente un trabajo rutinario que, en muchos casos, supone tediosas fases intermitentes. Un buen ejemplo viene dado por las operaciones necesarias para eliminar la actividad de la enzima de restricción tras su utilización. Muchas enzimas de restricción requieren extracción con fenol con el fin de inactivarlas tras su utilización. Las extracciones con fenol son procesos muy tediosos y, desde el punto de vista del usuario, desagradables. Además, se generan muchos residuos peligrosos en estas extracciones. Los fabricantes comerciales sugieren para muchas enzimas de restricción la inactivación mediante tratamiento con calor, mientras que en la práctica, los usuarios a menudo realizan una extracción con fenol para garantizar la inactivación de la enzima. Tras el tratamiento con calor puede permanecer todavía un gran porcentaje de la actividad enzimática. Dado que no se pueden liberar las enzimas de restricción con las técnicas conocidas en la actualidad, el problema se ha resuelto inactivando las enzimas, por ejemplo, mediante calor o extracción con fenol. Otra desventaja es que la cara enzima utilizada no puede reutilizarse. Diversas columnas de rotación para purificar ADN a partir de la disolución de reacción llevan menos tiempo pero por lo demás, son problemáticas. La utilización de estas columnas es muy cara y no son aplicables para liberar muchas enzimas de la disolución de ADN. Incluso en este caso, la enzima retirada no puede
reutilizarse.

La extracción con fenol se requiere para la inactivación de todavía muchas otras enzimas comúnmente utilizadas en el campo de la biología molecular. Como ejemplos pueden mencionarse CIP (fosfatasa intestinal de ternero) y proteinasa K.

No se ha presentado ningún medio que no sea problemático para transferir y lavar enzimas de restricción o enzimas de modificación de ácidos nucleicos. Como ejemplo de un problema podría mencionarse la actividad estrella producida por el glicerol utilizado en la disolución de almacenamiento de enzimas de restricción. Esto se refiere a la capacidad de las enzimas de restricción para cortar ADN de manera no específica, es decir, en lugares en los que no se desea que corten. Las enzimas de restricción comerciales se facilitan generalmente como una disolución que contiene un 50% de glicerol. En su utilización normal, se añade una cantidad muy pequeña de enzima de restricción a la reacción, incluso inferior a 1 \mul. Si el contenido de glicerol en la mezcla de reacción es demasiado alto, esto constituye en muchos casos un gran problema, principalmente debido a la aparición de la actividad estrella. Esto supone límites para muchas aplicaciones de biología molecular con respecto a la utilización de enzimas de restricción. Otro hecho importante es que es recomendable mantener el volumen total de la mezcla de reacción lo más bajo posible con el fin de tener una reacción enzimática suficientemente rápida. Las enzimas de restricción comerciales generalmente están disponibles en una, como mucho en dos concentraciones estándar (U/ml). Si se desea una gran cantidad de enzima de restricción en la reacción, el contenido de glicerol en la disolución de reacción alcanza niveles demasiado altos. Como resultado, hay una actividad estrella y las cinéticas de reacción se ralentizan marcadamente.

La bibliografía de patentes sugiere preparaciones en las que las enzimas de restricción, u otras enzimas comúnmente utilizadas en biología molecular, se han inmovilizado sobre un soporte sólido. La publicación de patente internacional WO 92 15674 sugiere la inmovilización de enzimas de restricción, así como de enzimas de modificación de ácidos nucleicos, en una superficie hecha de polímero o fibra de vidrio. El documento US 4 342 833 también describe enzimas de restricción inmovilizadas utilizando agarosa activada con CNBr como soporte sólido. En un nivel general, la utilización de partículas magnéticas en la inmovilización de enzimas se describe en la publicación de patente US 4 698 302 aun cuando en esta publicación de patente no se mencionan enzimas utilizadas en el campo de la biología molecular. En la publicación de patente mencionada anteriormente, la separación de las partículas magnéticas se llevó a cabo tradicionalmente con un imán exterior.

En el campo de la biología molecular, la captura de partículas plantea problemas debido a los pequeños volúmenes de fluido en estas aplicaciones. Una técnica reconocida de los campos de la biología celular o la inmunoquímica no es aplicable en biología molecular debido a las cantidades extremadamente pequeñas de líquido utilizadas en este campo, por ejemplo, 10 - 100 \mul, cuando las cantidades correspondientes en el campo de la inmunoquímica son de varios mililitros de magnitud y en el campo de la biología celular, normalmente de 10 - 100 ml.

El tratamiento de muestras turbias o muestras que contienen material sólido con imanes localizados tradicionalmente fuera del recipiente de reacción también plantea problemas debido a que es difícil eliminar de las partículas magnéticas la turbidez que producen las partículas finas.

Cuando se utilizan los imanes exteriores tradicionales, las partículas magnéticas no pueden tratarse directamente transfiriéndolas de un recipiente de reacción a otro, sino que tienen que tratarse indirectamente uniendo las partículas a la pared del recipiente de reacción y cambiando la disolución que rodea con la ayuda de una pipeta.

En el campo hay una necesidad de un procedimiento que se adecue fácilmente para manejar pequeños volúmenes, que sea simple de realizar, se automatice fácilmente y sea fácilmente aplicable en diversos campos.

Objetivo de la invención

El objetivo de la invención es conseguir un equipo y un procedimiento para facilitar el manejo de materiales objetivo que se unen específica o inespecíficamente a un material magnético o magnetizable. En particular, la invención persigue proporcionar equipos fácilmente miniaturizados y procedimientos adecuados para manejar pequeños volúmenes de muestra.

El equipo y el procedimiento se utilizarán para muchas aplicaciones que varían ampliamente, tales como inmunoanálisis, separación de células y virus, para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos, así como para la purificación de proteínas. El procedimiento es particularmente adecuado para aislar, transferir o purificar ácidos nucleicos.

Además, el equipo y el procedimiento descritos en la presente memoria se utilizarán para manejar materiales de muestra difíciles, tales como muestras turbias o muestras que contienen material sólido.

Además, la invención pretende conseguir un dispositivo de transferencia con el que micropartículas magnéticas o magnetizables, incluyendo el material objetivo allí unido, se atrapen fácilmente y finalmente se liberen. El dispositivo de transferencia puede ser de un tipo que maneje simultáneamente solo una o más muestras. El procedimiento puede totalizarse como un producto que comprende el dispositivo de transferencia con revestimiento o membrana de separación adjunta, los reactivos necesarios y con el que se lleva a cabo fácilmente la dosificación, el lavado y la recaptura de micropartículas magnéticas o magnetizables

En particular, la invención persigue proporcionar un procedimiento con el que pueda dosificarse y transferirse la enzima de restricción u otra que se utiliza en el campo de la biología molecular, que está inmovilizada sobre micropartículas, desde el recipiente que contiene la enzima hasta el recipiente de reacción, y finalmente liberarse y recapturarse del recipiente de reacción. Esta invención trata, entre otras cosas, de incrementar la facilidad de utilización de las enzimas utilizadas en los procedimientos y aplicaciones moleculares biológicos y de reutilizar enzimas caras. Mediante el presente procedimiento, puede eliminarse el glicerol u otra sustancia que interfiere con la reacción de la enzima inmovilizada antes de suministrarse al recipiente de reacción.

El objetivo también consiste en proporcionar un procedimiento para la purificación de proteínas. Mediante el procedimiento según la invención, la purificación de proteínas es marcadamente fácil y las proteínas pueden concentrarse al mismo tiempo. En la purificación de proteínas, puede utilizarse o bien una unión de proteínas específica o no específica al material de soporte magnético o magnetizable.

Con el presente procedimiento, la dosificación de micropartículas en un recipiente, su recogida y la transferencia desde aquél se automatizan fácilmente en las aplicaciones mencionadas.

La presente invención posibilita combinar a voluntad las etapas del procedimiento que constituyen el manejo de ácidos nucleicos (aislamiento, transferencia, purificación) y la utilización de enzimas unidas, y permite su combinación con procedimientos tradicionales según las necesidades de aplicación al caso.

Descripción de la invención y realizaciones preferidas

Las características de la invención se desprenden a partir de las reivindicaciones adjuntas.

Por tanto, el objeto de la invención es un equipo y un procedimiento para la transferencia de una micropartícula con sustancias inmovilizadas desde un primer recipiente hasta un segundo recipiente. Las micropartículas son de material magnético o magnetizable o las micropartículas se han unido a un cuerpo magnético o magnetizable. Las micropartículas con la sustancia inmovilizada se recogen mediante la ayuda de una imán sumergido en el primer recipiente, el imán junto con las micropartículas capturadas se transfiere al segundo recipiente y las micropartículas se liberan de la influencia del imán. Es una característica de la invención, que la superficie del imán se separe de las micropartículas con la ayuda de una membrana extensible de material elastomérico de manera que la membrana o revestimiento no debiliten esencialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas.

El procedimiento según la invención se puede aplicar especialmente a campos en los que se manejan volúmenes pequeños.

En la presente solicitud, el concepto "sustancia" significa cualquier sustancia inmovilizada a las micropartículas que puede producirse en los campos de aplicación de la invención.

Por tanto, "sustancia" puede significar, por ejemplo una proteína, polipéptido o hapteno. La proteína puede ser, por ejemplo una enzima, anticuerpo o receptor. El polipéptido puede ser, por ejemplo, una hormona polipeptídica. Por hapteno se quiere decir compuestos de bajo peso molecular tales como lectinas, hormonas, fármacos, pesticidas o toxinas. Por tanto, también se incluirán componentes de bioafinidad utilizados en inmunoanálisis (un anticuerpo o antígeno o un complejo de los mismos), por ejemplo, y los componentes de bioafinidad utilizados en la purificación de proteínas (tales como una proteína biotinilada o estreptavidina o un complejo de los mismos) en el concepto de "sustancia".

Por tanto, "una sustancia" también puede ser una enzima de restricción, enzima de modificación o alguna otra enzima utilizada en biología molecular, por ejemplo, una proteasa como la proteinasa K. Como ejemplos de enzimas de modificación de ADN y/o ARN pueden mencionarse las siguientes: CIP (fosfatasa intestinal de ternero), fosfatasa alcalina de Escherichia coli, exonucleasas (por ejemplo, nucleasa P1, nucleasa S1), ribonucleasas, ARNasas (por ejemplo, ARNasa pancreática, ARNasa H, ARNasa T1, ARNasa M, ARNasa T2), ADN ligasas, ARN ligasas, ADN polimerasas, la enzima Klenow, ARN polimerasas, ADN cinasas, ARN cinasas, transferasas terminales, transcriptasa inversa de AMV y fosfodiesterasas. La aplicación de estas y/u otras enzimas de modificación de ADN y/o ARN es extremadamente variada tanto en investigación como en las aplicaciones de biología molecular. "Una sustancia" puede ser un ácido nucleico, cualquier ácido nucleico mono o bicatenario y especialmente ADN, ARN, ARNm o ADNc. Un ácido nucleico también puede ser PNA (ácido nucleico poliamida).

"Una sustancia" también puede ser una célula tal como una célula T, leucocito, parásito (por ejemplo, Giardia lamblia) y bacteria (por ejemplo, Salmonella sp., E. coli 0157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis).

"Una sustancia" puede ser incluso un virus, tal como VIH, rotavirus, rotavirus canino, virus del mosaico de arabis o virus del mosaico de la soja.

El concepto "micropartícula" significa en este contexto partículas bastante pequeñas, preferiblemente en el intervalo de 1,0-10 \mum. La micropartícula sobre la que se inmoviliza una sustancia puede obtenerse de un material magnético o magnetizable. Según otra alternativa, la propia micropartícula sobre la que se inmoviliza la sustancia puede ser no magnética. En este caso, la micropartícula se une adecuadamente a otro cuerpo que es de un material magnético o magnetizable.

El concepto "inmovilizada", cuando se trata de sustancias inmovilizadas sobre micropartículas, significa en este contexto todas las formas de este tipo, en las que la disolución que rodea entra en contacto con la sustancia unida a la partícula, de fijar o unir la sustancia que debe transferirse a las micropartículas durante la duración del procedimiento de la invención o al menos en las fases de transferencia de la misma. La sustancia inmovilizada puede unirse, por ejemplo, sobre la superficie de las partículas o puede capturarse en un cuerpo similar a una jaula. Por tanto, "inmovilizada" también puede significar la inmovilización reversible en aquellos casos en los que la sustancia que debe transferirse está unida a las micropartículas durante algunas fases, por ejemplo, las fases de transferencia, y se libera de ellas al final de esas fases.

"La unión" de una sustancia a las micropartículas puede llevarse a cabo mediante unión covalente, por ejemplo, haciendo uso de los grupos amino o carboxilo presentes en el soporte. Alternativamente, "la unión" puede llevarse a cabo utilizando una pareja de bioafinidad, por ejemplo, la pareja biotina / estreptavidina. Una forma de proceder es producir la sustancia que tiene que inmovilizarse, por ejemplo, una enzima, mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, en células bacterianas Escherichia coli, obteniendo una cola de afinidad especial en la enzima. Esta cola de afinidad se unirá a las micropartículas que tienen fijado adecuadamente en ellas algún componente que se unirá ávidamente a la cola de afinidad en cuestión. La cola de afinidad puede ser un compuesto, polipéptido o proteína de bajo peso molecular. Con esta disposición, podría hacerse un uso efectivo de las micropartículas en la purificación de la enzima deseada y, al mismo tiempo, la enzima unida a la micropartícula se inmovilizaría sobre la superficie de la micropartícula, lista para utilizarse en el procedimiento descrito en la invención.

"La unión" de una sustancia a las micropartículas también puede ser un acontecimiento no covalente no específico, tal como adsorción. Como ejemplo puede mencionarse la unión directa del ADN a la superficie del vidrio.

El concepto de "imán", mediante el cual se capturan las partículas, significa en este contexto un material que, o bien es permanentemente magnético o que es magnetizable, o una combinación de los mencionados anteriormente. El material ferromagnético puede combinarse adecuadamente con un imán permanente y/o con un electroimán. La magnetización puede llevarse a cabo o bien mediante un campo eléctrico o un imán permanente que se lleva en contacto con el material que debe magnetizarse Según la invención, la forma y el tamaño del imán pueden variar.

El concepto "material magnético o magnetizable" incluye materiales paramagnéticos, superparamagnéticos o ferromagnéticos. Especialmente adecuado como material de partículas es cualquiera de los materiales superparamagnéticos. Las partículas superparamagnéticas forman por sí mismas por influencia de un campo magnético exterior, un campo magnético que desaparece cuando el campo magnético exterior se elimina. Por tanto, las partículas permanecen separadas y no precipitan, lo que es beneficioso para su utilización. Muchos fabricantes comerciales suministran partículas magnéticas (tanto partículas paramagnéticos como superparamagnéticas), tales como Bangs Laboratories Inc., Dynal A.S., Advanced Magnetics Inc., Scipac Limited, Paesel+Lorei y CPG Inc. Puede elegirse entre partículas magnéticas de diferentes tamaños que están activadas de antemano y en diversas formas. Además, se dispone de partículas magnéticas que están modificadas en muchas diferentes formas. Como ejemplos pueden mencionarse partículas magnéticas que están carboxi- o amino-modificadas. Generalmente la magnetita se une a un soporte polimérico, tal como látex o celulosa. CPG Inc. fabrica partículas magnéticas hechas de vidrio poroso. En todas las partículas magnéticas mencionadas anteriormente se han dispersado pequeños cristales de magnetita (1-20 nm) en polímero y/o vidrio que está polimerizado produciendo una partícula magnetizable. Entre otros, Prolabo produce partículas magnéticas que tienen magnetita de una forma que se puede controlar sólo en el núcleo de las partículas. Esto es importante, porque el hierro no debe liberarse en la disolución de reacción en muchas aplicaciones biológicas moleculares, tal como en una reacción de PCR. El hierro liberado en la disolución inhibe el progreso de la reacción en las reacciones de PCR. Un material magnético o magnetizable también puede incluirse en una sustancia similar a un gel.

En el procedimiento según la invención, la superficie del imán utilizada se separa de las micropartículas mediante una "membrana" de separación. "La membrana" puede ser una membrana extensible de material elastomérico. Cuando el imán se sumerge en el recipiente con el fin de capturar las micropartículas, estas últimas se acumularán en la superficie de la membrana. El imán junto con las micropartículas acumuladas sobre la membrana se introduce después en un segundo recipiente. En el segundo recipiente, el imán permanente se aleja de la membrana: esto liberará las micropartículas debido al campo magnético debilitado. En caso de un electroimán, se crea un campo magnético para el acontecimiento de recogida y para liberar las partículas magnéticas se elimina el campo magnético. En caso de un imán magnetizable, el imán se magnetiza conectando un imán permanente al imán magnetizable con el fin de recoger y transferir las partículas magnéticas y el imán permanente se separa del imán magnetizable con el fin de liberar las partículas magnéticas.

La "membrana" descrita en la invención significa por ejemplo, una lámina de membrana, membrana preconfigurada o de rodillo. La membrana puede tener conectados adecuadamente a la misma elementos de refuerzo o soporte para facilitar el manejo. El material de membrana puede ser flexible y extensible, siempre que pueda configurarse para ajustarse al imán utilizado según la invención. La membrana es preferiblemente delgada o puede hacerse delgada por extensión. El material de membrana es un material elastomérico, preferiblemente caucho de silicona, poliuretano, fluoroelastómero, policloropreno o polietileno clorosulfonado.

Un objeto de la invención es también un dispositivo de transferencia que es adecuado para capturar micropartículas y liberar las mismas. El dispositivo de transferencia se caracteriza porque la superficie del imán está separada de las micropartículas por una membrana extensible de material elastomérico, de manera que una membrana o recubrimiento, que se adhiere estrechamente a la superficie del imán, separe el imán de las micropartículas pero no debilite esencialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas.

Es esencial que cuando se introduce el dispositivo de transferencia en el fluido con el fin de recoger las partículas magnéticas en disolución, se aplique un campo magnético en el mismo, de manera que las partículas magnéticas se acumulen, debido al campo magnético aplicado, en el dispositivo de transferencia. El dispositivo de transferencia según la invención puede realizarse, de manera que las micropartículas se acumulen adecuadamente sobre la superficie exterior de la membrana. El imán puede diseñarse de manera que las micropartículas se acumularán o bien sobre un área pequeña (por ejemplo, sobre la punta del dispositivo) o sobre un área sustancialmente más grande.

Las partículas magnéticas no se acumulan directamente sobre la superficie metálica del imán sino alrededor de la membrana protectora que rodea al imán. Lo más preferido es que la membrana protectora sea una capa protectora extremadamente delgada que se coloque estrechamente sobre el imán o alrededor del mismo, mediante lo cual se crea en la disolución la mayor fuerza de campo magnético posible. En el caso de la recogida de las micropartículas, la membrana protectora puede incluso estar extendida, disminuyendo así el espesor de la membrana y reforzando el campo magnético. Con el dispositivo de transferencia según la invención, pueden transferirse micropartículas a partir de pequeños volúmenes de fluido utilizando un imán extremadamente pequeño en recipientes pequeños.

El dispositivo de transferencia y el sistema de tratamiento de la muestra según la invención se presentan en mayor detalle en los dibujos siguientes, en los que:

La figura 1A presenta una vista en corte transversal axial de un dispositivo de transferencia según la invención equipado con una membrana extensible basado en la utilización de un imán permanente, en el que el imán está en la posición de liberación de partículas.

La figura 1B presenta un dispositivo de transferencia según la figura 1A como una vista en corte transversal axial, en el que el imán está colocado para recoger y transferir partículas.

La figura 1C presenta un dispositivo de transferencia según la figura 1A y la figura 1B, del que el extremo saliente que comprende una base membranosa está separado.

La figura 1D presenta la parte inferior del dispositivo de transferencia como una ampliación parcial de la figura 1A.

La figura 1E presenta la parte inferior del dispositivo de transferencia como una ampliación parcial de la figura 1A.

La figura 2A presenta un dispositivo de transferencia para manejar múltiples muestras simultáneamente.

La figura 2B presenta la parte inferior del dispositivo de transferencia como una ampliación parcial de la figura 2A, en la que los imanes del dispositivo de transferencia presentan una membrana preconfigurada común.

La figura 2C presenta la parte inferior del dispositivo de transferencia como una ampliación parcial de la figura 2A, en la que los imanes del dispositivo de transferencia presentan manguitos y una membrana común.

La figura 2D presenta la parte inferior del dispositivo de transferencia como una ampliación parcial de la figura 2A, en la que los imanes del dispositivo de transferencia presentan extremos salientes separados con una base membranosa.

La figura 3A presenta un cuerpo de pipeta y un dispositivo de transferencia que está unido al cuerpo de pipeta durante el funcionamiento.

La figura 3B presenta el dispositivo de transferencia según la figura 3A como una vista en corte transversal axial ampliada.

La figura 4A presenta una realización de la invención que representa un dispositivo de transferencia simplificado, a modo de pinzas.

La figura 4B presenta una ampliación de un extremo saliente con una base membranosa que se adapta a la realización según la figura 4A.

La figura 4C presenta una vista en corte transversal del dispositivo de transferencia según la figura 4A, en el que el imán está en la posición de liberación de micropartículas.

La figura 4D presenta una vista en corte transversal del dispositivo de transferencia según la figura 4A, en el que el imán está en la posición de recogida de micropartículas.

Las figuras 5A a 5E presentan un dispositivo de transferencia basado en la utilización de un imán magnetizable.

La figura 6 presenta un sistema de tratamiento de la muestra según la invención.

Las figuras 1A a 1E presentan un dispositivo de transferencia 2 que resulta adecuado para la captura y la liberación de micropartículas. Una barra 6, que puede moverse axialmente hacia atrás y hacia delante y que sirve como un brazo de acoplamiento para un imán 8, se coloca en una parte de cuerpo 4 a modo de tubo. La barra 6, con el imán 8 en su extremo, puede presionarse con la ayuda de la palanca 10 hacia abajo hacia la posición de recogida de la partícula 12 desde la que la fuerza de muelle del muelle 14 la devuelve a la posición de liberación de la partícula 12 cuando no se presiona la palanca 10. En esta solución, el imán 8 puede ser un poderoso imán permanente de NdFeB (neodimio, hierro, boro) y la barra 6 puede ser de un material conductor de magnetismo. Un extremo de la parte de cuerpo 4 puede fijarse a un extremo 16 saliente con una base 18 membranosa. En esta solución, el extremo 16 saliente puede tener como material extensible caucho de silicona con un espesor de 0,1 - 1,0 mm. La superficie del imán 8 puede presionarse contra la base 18 membranosa del extremo 16 saliente para unir las micropartículas 12 a la base 18 (figuras 1B y 1E). Las micropartículas 12 se separarán cuando se mueva el imán 8 alejándose de la membrana 18 (figuras 1A y 1D).

La palanca 10, que se hace funcionar presionándola con un dedo, está conectada a la barra 6 que se mueve hacia el interior de la parte de cuerpo 4 (figuras 1A y 1B). Puede estar fijada en la posición de recogida y transferencia. La palanca 10 está influida por una acción hacia arriba del muelle 14 de retorno. Cuando la palanca 10 se presiona hacia la posición más hacia abajo, la barra 6 y en su extremo, el imán 8, se presionarán hacia el extremo 16 saliente de manera que la base 18 membranosa del extremo 16 saliente se extenderá y presionará estrechamente contra el imán (figuras 1B y 1E) de manera que lleve las micropartículas 12 bajo la influencia de un flujo magnético que es lo más fuerte posible. La parte de cuerpo también se ajusta con una palanca 20 (figuras 1A a 1C) con la conexión a la misma de una barra 22 con la ayuda de la que el extremo 16 saliente presionado contra la parte inferior del dispositivo de transferencia 2 puede separarse del cuerpo 4 del dispositivo de transferencia 2 (figura 1C). Una vez que las micropartículas 12 se han transferido al recipiente deseado, el extremo 16 saliente puede separarse.

El dispositivo de transferencia descrito anteriormente puede realizarse según los principios de construcción presentados anteriormente, lo que permite modificaciones como en las localizaciones de diversas partes, en la geometría y en los materiales, por ejemplo, según se requiera por las consideraciones ergonómicas en diversas posiciones y circunstancias de trabajo.

En las figuras 2A a 2D se presenta una realización de un dispositivo de transferencia 2' que puede manejar múltiples muestras simultáneamente. Funcionalmente, el dispositivo de transferencia puede realizarse de igual manera que el dispositivo de transferencia 2 según las figuras 1A a 1E, siempre que se tenga cuidado de que los movimientos de los órganos de control, tal como la palanca 10' y la palanca 20', se desplacen simultáneamente hacia cada imán 8 y/o hacia los elementos estructurales de adherencia.

La figura 2B presenta una realización, en la que los imanes 8 presentan una membrana 18' común preconfigurada de manera que cada imán 8 presenta su propio pocillo o ranura 24 preconfigurada sobre la membrana 18'. Entonces, estas ranuras 24 pueden dejarse colgando en el recipiente al que se están transfiriendo las micropartículas y/o en el que la membrana 18' y/o cualquier micropartícula que pudiera estar adherida a la misma se esté lavando incluso cuando los imanes 8 están en la posición de liberación de las micropartículas. El área 24 preconfigurada para el imán 8 puede diseñarse especialmente para cada aplicación y, en consecuencia, presentar una forma distinta a la de la ranura
24.

La figura 2C presenta una realización en la que los imanes 8 se empujan desde los manguitos 26 hacia una posición de recogida y transferencia de micropartículas y después se retiran hacia los manguitos 26 para una posición de liberación de las micropartículas. Por tanto, la membrana 18' puede extenderse hacia abajo con la ayuda de los manguitos 26 cuando se desea hacer salir cualquier micropartícula y/u otras sustancias que pudieran estar adhiriéndose a la membrana 18' hacia los fluidos en los recipientes con los imanes 8 en la posición de liberación de micro-
partículas.

La figura 2D presenta una realización en la que cada imán 8 del dispositivo de transferencia 2' presenta su propio extremo 16 saliente equipado con una base 18 membranosa exactamente como en el dispositivo de transferencia 2 equipado con un imán 8 según las figuras 1A a 1E. Los extremos 16 salientes pueden estar conectados según se desee entre sí de una manera fija o mediante una placa separada equipada por ejemplo, con orificios de tamaño adecuado.

Las realizaciones según las figuras 2A a 2D pueden ajustarse según el número de muestras manejadas simultáneamente, así como el tamaño y las posiciones recíprocas de los imanes, de manera que sean adecuadas para el equipo según los criterios que se apliquen a la aplicación en cuestión, por ejemplo, adecuadas para placas de 96 ó 384
pocillos.

Las realizaciones según las figuras 1A a 2D se pueden hacer funcionar manualmente, pero pueden modificarse para que formen parte de un equipo o sistema automatizado.

La realización de un dispositivo de transferencia 2'' según las figuras 3A y 3B está para ser operativo, unido a un cuerpo 32 de pipeta 30. El cuerpo 4'' del dispositivo de transferencia 2'' está unido al cuerpo 32 de pipeta 30 de manera adecuada, por ejemplo mediante un montaje roscado, de modo que no se separará cuando esté en funcionamiento. El cuerpo 32 de pipeta 30 y el dispositivo de transferencia 2'' interconectados se hacen funcionar como un dispositivo de transferencia de manera que el imán 8 del dispositivo de transferencia 2'' se presione hacia abajo hacia la posición de recogida de partículas magnéticas contra la parte de fondo del extremo saliente (que aunque no se presenta en las figuras 3A y 3B es igual que el extremo 16 saliente representado en las figuras 1A a 1E) presionando el botón 10'' sobre la pipeta 30. Esto hará que el pistón 34 de la pipeta 30 presione la barra 6'' del dispositivo de transferencia 2'' contra el muelle 14'' de manera que el imán 8 en el extremo inferior de la barra 6'' empujará de nuevo la base membranosa del extremo saliente. El muelle 14'' devolverá la barra 6'' con el imán 8 unido a la misma a la posición de liberación de partículas magnéticas cuando la palanca 10'' no se presione. La realización representada en las figuras 3A y 3B puede realizarse para que se ajusten a muchas clases de cuerpos de pipetas modificando sus elementos
estructurales.

En las figuras 4A a 4D se presenta una realización simplificada del dispositivo de transferencia 2'''. El cuerpo 4''' del dispositivo de transferencia es similar a una pinzas porque consiste en dos brazos 36, 38 alargados unidos en los primeros extremos y realizados en un material que los hace flexibles, de manera que una fuerza de muelle trata de mantener los segundos extremos de los brazos 36, 38 separados. Una barra 6''' está unida al segundo extremo del brazo 36 más alto cuya barra, a su vez, presenta unido en su extremo un imán 8. En el segundo extremo del brazo 38 inferior hay un orificio 40 en el que se coloca el extremo 16 saliente. En la figura 4B se representa un extremo 16 saliente con una base 18 membranosa. En esta realización, el extremo 16 saliente es según las figuras 1A a 1E. En la figura 4C, el dispositivo de transferencia 2''' está en la posición de liberación de partículas magnéticas; cuando los brazos 36 y 38 a modo de pinzas se presionan juntos (figura 4D) la barra 6''', con el imán 8 unido en un extremo, se proyectará hacia el extremo 16 saliente y presionará contra la base 18 membranosa extendiendo la misma de manera que la base 18 membranosa se vuelva más delgada y se presione estrechamente contra la superficie del imán 8.

La realización descrita en las figuras 4A a 4D también pueden realizarse de una manera tal que los brazos del cuerpo similar a una pinzas que se conecta en sus primeros extremos según la realización anterior se crucen entre sí entre los extremos primero y segundo con el fin de que la barra y el imán en su extremo esté presionada por la fuerza de muelle contra la membrana en el extremo saliente en el que el dispositivo de transferencia está en modo de relajación en la posición de recogida y transferencia de micropartículas. Por tanto, cuando se presionan los brazos desde sus primeros extremos, sus segundos extremos se separarán y la barra, con el imán unido en un extremo, se moverá hacia arriba desde el extremo saliente y cambiará a la posición de liberación de micropartículas.

La realización descrita en las figuras 4A a 4D puede realizarse adicionalmente incluso de otras formas, por ejemplo, de manera que los brazos primero y segundo formen las partes de un cuerpo curvado, o que la estructura sea similar a unas tijeras. La fuerza de muelle puede estar producida por el material de los brazos o por un muelle separado. No es necesario aplicar a los brazos una fuerza de muelle que trata de unir los brazos entre sí o separarlos aún más en todas las realizaciones, pero el acercamiento o la separación adicional podría controlarse por el operario basándose en otras características estructurales, tales como la estructura similar a unas tijeras del dispositivo de transferencia.

Un sistema para la purificación del ADN sirve como ejemplo de un sistema para tratar muestras basadas en micropartículas. La figura 5 presenta una placa de múltiples pocillos incluida en el sistema de purificación. La placa 56 presenta los pocillos 60, 62, 64, 66 y 68 en los que pueden llevarse a cabo varias fases del procedimiento de purificación. En el procedimiento de purificación según este ejemplo, las micropartículas necesarias en el procedimiento están en el pocillo 60, a partir del cual se transfieren con la ayuda del dispositivo de transferencia al líquido de lavado en el pocillo 62 y tras el lavado, al pocillo 64 en el que se añade el ADN que debe purificarse que se une a las micropartículas. A continuación, las partículas junto con el ADN unido a las mismas, se lavan dos veces en los pocillos 64 y 66. Las transferencias de un pocillo a otro se realizan utilizando el dispositivo de transferencia según la invención. Tras los lavados, las partículas junto con el ADN todavía unido a las mismas se transfieren al pocillo 68 que contiene el eluyente. Una vez que el ADN purificado se separa de las micropartículas, estas últimas se transfieren con la ayuda del dispositivo de transferencia del pocillo 68, dejando atrás el ADN purificado. En el procedimiento de purificación según este ejemplo, las micropartículas pueden transferirse al líquido de lavado en el pocillo 62 incluso directamente a partir de un recipiente de almacenamiento separado. En los diferentes procedimientos para el tratamiento de las muestras, pueden realizarse diversos tratamientos según cada procedimiento en los pocillos de la placa 56, tal como fases para calentamiento, enfriamiento, mezclado, medición (procedimientos analíticos) y dosificación de
reactivos.

La placa 56 puede estar constituida por una serie de pocillos, por ejemplo, las tiras 58, de manera que cada tira tenga los pocillos necesarios para tratar una muestra alineada. Los pocillos 60, 62, 64, 66 y 68 en cada tira 58 forman una serie de pocillos que pueden comprender bien los pocillos necesarios para tratar todas y cada una de las fases de un procedimiento de tratamiento de múltiples fases. La placa 56 puede comprender varias tiras 58 alineadas que pueden estar adecuadamente interconectadas.

La dosificación puede automatizarse fácilmente con este sistema. Por ejemplo, el dispositivo para transferir partículas se introduce primero en un primer pocillo 60 del que se recoge la cantidad total de micropartículas dosificadas al mismo. A continuación, el dispositivo de transferencia junto con las micropartículas unidas al mismo se introduce en un segundo pocillo 62 según pueda ser necesario o directamente a un tercer pocillo 64. Los pocillos 60, 62, 64, 66 y 68 pueden localizarse incluso en placas separadas.

El dispositivo de transferencia y la placa 56 descrita anteriormente pueden formar los principales componentes de un dispositivo automatizado. El dispositivo puede comprender incluso varios dispositivos de transferencia que pueden estar conectados a un robot que controle su función según las circunstancias establecidas por el procedimiento.

Aplicaciones de la invención

El procedimiento según la invención puede aplicarse a la transferencia de material magnético o magnetizable en todas las aplicaciones en las que existe una necesidad de llevar la sustancia que debe aislarse o determinarse de un recipiente a otro. Estos casos están representados, entre otros, por todos los procedimientos en los que la sustancia que debe aislarse (célula, bacteria, proteína, hapteno) está en una matriz de muestra que contiene mucha materia particulada. También los casos en los que no pueden hacerse determinaciones debido a turbidez o coloreado de la matriz de muestra son realizaciones preferidas del procedimiento según la invención. Las muestras de alimentos o suelo pueden mencionarse como ejemplos de matrices de muestra problemáticas.

El procedimiento según la invención encuentra una aplicación satisfactoria incluso en aquellos casos en que resulta necesario concentrar o transferir la sustancia de un recipiente a otro. En las purificaciones de proteínas, hay una gran necesidad de un procedimiento por el que, además de la purificación, pueda aumentarse la concentración de proteína de una forma simple y efectiva. En las aplicaciones de biología molecular que normalmente contienen muchas fases, hay una gran necesidad de un procedimiento simple para transferir materia (por ejemplo, fragmentos de ADN) de un recipiente a otro.

El procedimiento también puede aplicarse a inmunoanálisis.

Utilizando la invención es posible llevar a cabo las transferencias de material magnético o magnetizable descritas anteriormente en recipientes de diferentes tamaños (por ejemplo, un tubo Eppendorf, una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos). El procedimiento según la invención posibilita manejar muestras en recipientes de reacción muy pequeños. El tratamiento de volúmenes de fluido extremadamente pequeños en recipientes pequeños es muy esencial, por ejemplo, en el campo de la biología molecular.

El dispositivo de transferencia según la invención puede ser un dispositivo mantenido en la mano o en un soporte para el tratamiento de una o varias muestras simultáneamente, puede ser parte de un aparato más grande o estar incluido en un equipo integrado y automatizado.

Una realización de la invención aplicable al aislamiento de ácidos nucleicos, al tratamiento y a la purificación de enzimas se presenta en el esquema 2. Mediante la utilización de la invención, el ácido nucleico puede tratarse con enzimas solubles (A), en la que después el ácido nucleico, sin las enzimas, se transfiere a otro recipiente de reacción uniéndolas reversiblemente al material magnético o magnetizable (B). El ácido nucleico también puede tratarse con enzimas unidas a un material magnético o magnetizable (C). Estas enzimas pueden utilizarse o bien para tratar los ácidos nucleicos o para inactivar cualquier enzima eventualmente presente en la mezcla de reacción. Tras el tratamiento, el ácido nucleico no requiere purificación porque las enzimas del tratamiento ya se han extraído del recipiente de reacción con la ayuda del dispositivo de transferencia según la invención. La invención también permite la utilización de combinaciones arbitrarias de utilizar enzima soluble y unida, así como la purificación de ácidos nucleicos en el tratamiento de ácidos nucleicos.

El procedimiento según la invención se puede aplicar a la digestión de ácidos nucleicos con enzimas de restricción y también a la utilización de otras enzimas utilizadas en los procedimientos y aplicaciones de la biología molecular. La enzima inmovilizada a las micropartículas se introduce en el recipiente de reacción en el que se permite que continúe la reacción enzimática durante el tiempo necesario. Tras la reacción, las micropartículas junto con la enzima unida a las mismas se extraen del recipiente de reacción. Así, la inactivación de la enzima inmovilizada se hace innecesaria. La enzima inmovilizada utilizada en la reacción se transfiere a un pocillo de lavado en el que se lava cualquier remanente de la mezcla de reacción. Las enzimas inmovilizadas una vez lavadas se transfieren a un recipiente suministrado para las mismas con el fin de reutilizarse.

Tras el tratamiento con enzimas de restricción, el recipiente de reacción puede suministrarse, por ejemplo, con la enzima CIP (fosfatasa intestinal de ternero) inmovilizada a las micropartículas, o con alguna otra enzima inmovilizada necesaria en la aplicación en cuestión. Cuando se utilizan, se aplica el procedimiento descrito anteriormente y se obtienen los mismos beneficios que cuando se utilizan enzimas de restricción.

Dado que las enzimas pueden extraerse una vez utilizadas, se elimina totalmente una fase para la inactivación enzimática. Al mismo tiempo, el procedimiento es sustancialmente más simple y más rápido que el tradicional con la inactivación enzimática. En la comparación presentada en el esquema 1 para un caso de un tratamiento simple con enzima de restricción y CIP, puede observarse que se omiten muchas fases en el nuevo procedimiento ya que son innecesarias.

La invención proporciona asimismo un procedimiento en el que puede utilizarse una proteasa (por ejemplo, proteinasa K) inmovilizada a micropartículas con el fin de inactivar una enzima soluble presente en el recipiente de reacción. La proteinasa K es una enzima muy común con múltiples aplicaciones. Desgraciadamente, esta enzima es muy estable y requiere una activación efectiva (por ejemplo, extracción con fenol). Según la invención descrita, la proteinasa K puede utilizarse de forma inmovilizada y después extraerse de manera muy efectiva del recipiente de reacción. De este modo, la proteinasa K inmovilizada complementa los beneficios de la invención como un procedimiento general de inactivación de enzimas. Este modo es muy beneficioso especialmente, por ejemplo, en los casos en los que la enzima que debe inactivarse no puede llevarse a una forma inmovilizada, la enzima que debe inactivarse está presente en la mezcla de reacción como un contaminante o cuando se desea determinar la inactivación enzimática total en la mezcla de reacción. La proteinasa K inmovilizada complementa la utilización a gran escala de la invención en aplicaciones, entre otras, de biología molecular.

El procedimiento según la invención puede aplicarse al aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos. Como aplicaciones, pueden mencionarse, por ejemplo, la purificación de ARNm, ADNc y ADN de plásmido y la purificación de productos de amplificación por PCR. La invención permite la purificación de ácidos nucleicos también a partir de matrices de muestra difíciles.

El procedimiento según la invención encuentra aplicaciones especialmente beneficiosas también en campos en los que las enzimas inmovilizadas al material magnético reportan beneficios adicionales en comparación con los procedimientos actuales.

Con el procedimiento según la invención, la enzima inmovilizada puede recogerse de la mezcla de reacción para su reutilización. Con el procedimiento, la enzima inmovilizada también puede transferirse de un recipiente de dosificación a la mezcla de reacción. Cuando se requiera, las micropartículas capturadas con la ayuda de un imán pueden introducirse en un líquido de lavado con el fin de eliminar el glicerol u otros conservantes antes de introducir el mismo en la mezcla de reacción. En el recipiente de lavado, las micropartículas pueden liberarse, según sea necesario, del campo magnético con el fin de liberar las partículas y hacer que el lavado sea más efectivo.

La invención también resulta muy adecuada para la purificación de proteínas. Formas especialmente recomendables para la purificación de proteínas son los diversos procedimientos de purificación por afinidad. Con el procedimiento descrito en la invención, las proteínas también pueden purificarse desde una matriz de muestra muy difícil (por ejemplo, que contenga células rotas) y las proteínas pueden eluirse en un volumen muy pequeño.

El dispositivo de transferencia según la invención permite manejar numerosas muestras cuando están conectadas a un equipo automatizado. La invención descrita permite manejar muestras en volúmenes de fluido muy pequeños y en recipientes de reacción muy pequeños. El manejo de volúmenes pequeños posibilita, con la técnica de membrana descrita por la invención, grandes ahorros en los costes de reactivos.

En el dispositivo de transferencia descrito por la invención, el contacto entre el imán y la membrana protectora es estrecho. Esto es importante cuando se desea determinar la reproducibilidad y la fuerza del campo magnético obtenido mediante un imán pequeño. Especialmente en el caso presentado por la invención en el que la membrana protectora es delgada y extensible, se produce una situación ideal cuando funciona con volúmenes de fluido y recipientes de reacción pequeños. Si el imán está rodeado por una cubierta protectora fija y no extensible, el contacto con el imán no podría hacerse reproducible y estrecho. Al mismo tiempo, el imán con una cubierta protectora tendría un diámetro considerablemente más grande que el dispositivo de transferencia descrito por la invención. Si el imán careciera de cualquier membrana o recubrimiento protectores, esto se concebiría como una solución no práctica y con gran riesgo de contaminación.

Como ejemplos de aplicaciones según la invención, pueden mencionarse los siguientes:

1. Clonación de insertos de ADN

Enzimas de restricción.

Creación de extremos romos (por ejemplo, polimerasas termoestables, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, nucleasa Mung Bean).

Ligación (por ejemplo, ADN ligasa de T4, ADN ligasa de E. coli, ARN ligasa de T4).

Fosforilación (por ejemplo, polinucleótido cinasa de T4)

Desfosforilación (por ejemplo, CIP, fosfatasa alcalina de E. coli, polinucleótido cinasa de T4).

Deleciones anidadas (por ejemplo, ADN polimerasa de T4, polimerasas termoestables, exonucleasa III, nucleasa Mung Bean).

2. Síntesis y clonación de ADNc

Por ejemplo, transcriptasa inversa, ARNasa H, ADN polimerasa I, ADN polimerasa I de T4, ADN ligasa de E. coli.

3. Marcado de ácidos nucleicos

Marcado en 5' (por ejemplo, polinucleótido cinasa de T4).

Adición en 3' (por ejemplo, ARN ligasa de T4).

Rellenado en 3' (por ejemplo, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, ADN polimerasa de T4).

Intercambio en 3' (por ejemplo, ADN polimerasa de T4, polimerasas termoestables).

Desplazamiento de mella (nick translation) (por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, polimerasas termoestables).

Síntesis por sustitución (por ejemplo, ADN polimerasa de T4, polimerasas termoestables, exonucleasa III).

Cebado aleatorio (por ejemplo, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, polimerasas termoestables).

Sondas de ARN (por ejemplo, ARN polimerasa de T7, ARN polimerasa de SP6).

4. Secuenciación de ácidos nucleicos

Secuenciación de ADN (por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, polimerasas termoestables).

Secuenciación de ARN (por ejemplo, transcriptasa inversa, transcriptasas inversas termoestables).

5. Mutación de ácidos nucleicos

Dirigida por oligonucleótidos (por ejemplo, ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa de T7, polimerasas termoestables).

Incorporación errónea (por ejemplo, exonucleasa III, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, polimerasas termoestables).

6. Mapeo

Restricción (por ejemplo, exonucleasa III).

Obtención de huella (footprinting) (por ejemplo, exonucleasa III)

Transcrito (por ejemplo, transcriptasa inversa, nucleasa Mung Bean).

7. Purificación y aislamiento de ácidos nucleicos

Purificación de ADN de plásmido.

Purificación de productos de PCR.

Purificación de sondas de ADN.

Purificación de ARNm.

Purificación de ADN en gel de agarosa.

8. Procedimientos de ensayo en biología molecular

Análisis molecular de mutaciones puntuales.

Procedimientos de amplificación de ADN [PCR, PCR inversa, reacción en cadena de la ligasa (LCR)].

Cuantificación de ADN/ARN).

Ensayo de protección de ribonucleasa.

PLFR (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción).

9. Procedimientos analíticos

Análisis de fármacos [detección de bibliotecas combinatorias, detección de alto rendimiento (HTS)]

Análisis de alimentos (patógenos, fármacos, toxinas).

Análisis medioambiental (pesticidas, herbicidas, insecticidas).

Diagnósticos (bacterias, parásitos, virus, anticuerpos, antígenos).

10. Separación de células

Aislamiento de leucocitos humanos

Aislamiento de células T humanas

Aislamiento de células cancerígenas

11. Purificación de proteínas

Purificación por afinidad (cola de His, estreptavidina - biotina, anticuerpos).

Las realizaciones de la invención mencionadas anteriormente son simplemente sugerencias para llevar a cabo el concepto de la invención. Para un experto en la materia está claro que las diversas realizaciones de la invención pueden variar en el alcance de las reivindicaciones presentadas más adelantes en la presente memoria.

12. Ejemplos de aplicaciones de la invención

En los ejemplos presentados a continuación se hace uso del dispositivo para transferir partículas magnéticas según la invención.

Ejemplo 1

Purificación de ADN a partir de gel de agarosa utilizando partículas paramagnéticas recubiertas con sílice

La purificación del ADN descrita a continuación se realizó utilizando el dispositivo para transferir partículas magnéticas según la invención y partículas paramagnéticas de sílice para biología molecular de Merck.

ADN de \lambda digerido con HindIII, se separó por electroforesis y el fragmento de 6,6 kpb se cortó del gel. El trozo de gel se colocó en un tubo de microcentrífuga al que se añadieron 300 \mul de tampón A (NaClO_{4} 7 M, sorbitol al 1%, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0). La suspensión se incubó en un baño de agua a 50ºC durante 10 mi-
nutos.

El tubo de microcentrífuga se extrajo del baño de agua y las partículas magnéticas se recogieron utilizando el dispositivo de transferencia según la invención. Las partículas magnéticas se lavaron con 500 \mul de tampón A. Se repitió el lavado dos veces utilizando como líquido de lavado 500 \mul de tampón B [etanol al 70%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético 1 mM)]. Tras el último lavado, las partículas se dejaron secar sobre la punta del dispositivo de transferencia.

Las partículas se suspendieron en 20 \mul de tampón C (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y se incubaron 5 minutos a 50ºC. Las partículas se recogieron con el dispositivo de transferencia fuera de la disolución en la que el fragmento de ADN se había eluido.

Con el fin de confirmar la purificación, el fragmento de ADN liberado de las partículas se sometió a electroforesis junto con un patrón de HindIII de \lambda.

Ejemplo 2

Purificación de ADN a partir de una disolución utilizando partículas paramagnéticas recubiertas con carboxilo

La purificación de ADN descrita a continuación se realizó utilizando el dispositivo para transferir partículas magnéticas según la invención y el kit de aislamiento de ADN para productos de PCR BioMag® de PerSeptive Biosystems.

Se pipetearon 100 \mul de disolución del plásmido pUC19 4 \mug/ml en un tubo de microcentrífuga. Se añadió al mismo un volumen de 10 \mul de partículas ADN Sep lavadas junto con 110 \mul de tampón de hibridación (polietilenglicol 8000 al 20%; NaCl 2,5 M). La suspensión se mezcló y luego se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia según la invención. Las partículas se lavaron dos veces con 100 \mul de disolución de lavado (etanol al 70%), después se dejaron secar sobre la punta del dispositivo de transferencia.

El ADN se eluyó de las partículas añadiendo 30 \mul de tampón de elución (Tris 10 mM, pH 8) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las partículas se recogieron fuera de la disolución que contenía ADN utilizando el dispositivo de transferencia.

Con el fin de confirmar la purificación, el ADN de pUC19 purificado liberado de las partículas se sometió a electroforesis junto con los patrones de pUC19 y HindIII de \lambda.

Ejemplo 3

Purificación de ADN de plásmido de células bacterianas Escherichia coli utilizando partículas magnéticas recubiertas con carboxilo

La purificación de ADN descrita a continuación se realizó utilizando el dispositivo para transferir partículas magnéticas según la invención y el kit de purificación de ADN Mini-Prep BioMag® de PerSeptive Biosystems. El plásmido de 9,0 kpb que tenía que aislarse se transformó en células E. coli.

Se centrifugaron 3 ml de cultivo celular bacteriano y se desechó el sobrenadante. El sedimento de células se suspendió en 30 \mul de la disolución 1 (glucosa 50 mM, Tris 25 mM, EDTA 10 mM). Se añadieron 10 \mul de ARNasa y 60 \mul de la disolución 2 (NaOH 0,2 M, SDS 1%). La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 45 \mul de la disolución 3 (potasio 3 M, acetato 5 M), la suspensión se incubó en hielo durante 10 minutos. La mezcla se centrifugó durante 10 min a 15.800 x g.

El sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga que contenía 10 \mul de partículas de ADN Sep lavadas. Se añadieron 150 \mul de 2x disolución de hibridación (polietilenglicol 8000 al 20%; NaCl 2,5 M) y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución utilizando el dispositivo de transferencia según la invención. Las partículas se lavaron dos veces con 200 \mul de disolución de lavado (etanol al 70%), después se dejaron secar sobre la punta del dispositivo de transferencia.

El ADN se eluyó de las partículas añadiendo 30 \mul de disolución de elución (Tris 10 mM, pH 8) y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Las partículas se recogieron fuera de la disolución que contenía ADN con el dispositivo de transferencia.

Con el fin de confirmar la purificación, el ADN de plásmido purificado liberado de las partículas se sometió a electroforesis junto con patrones de HindIII de \lambda.

Ejemplo 4

Digestión de ADN utilizando enzima de restricción inmovilizada sobre partículas magnéticas

Se suspendieron 25 \mug de la enzima de restricción BglII y 1,3 mg de partículas superparamagnéticas activadas con tosilo M-280 Dynabeads® de Dynal lavadas, en 160 \mul de tampón borato 0,1 M, pH 9,5. La suspensión se incubó durante 7 días a 8ºC con mezclado suave.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia según la invención y se lavaron dos veces a 4ºC durante 5 minutos cada vez con tampón PBS [solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% (p/v) de BSA (albúmina sérica bovina)]. Las partículas se lavaron una vez a 8ºC durante 2 días en tampón Tris 0,2 M (pH 8,5; 0,1% de BSA) y una vez a 4ºC durante 5 minutos con tampón PBS. Las partículas lavadas se suspendieron en 160 \mul de tampón PBS.

Se digirió 1 \mug de ADN de \lambda en 50 \mul de tampón Tris 6 mM [pH 7,9; NaCl 150 mM; MgCl_{2} 6 mM; DTT (ditiotreitol) 1 mM] a 37ºC durante 1 h utilizando diferentes cantidades de enzima de restricción BglII inmovilizada sobre partículas magnéticas. Tras la digestión, las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia según la invención.

Con el fin de confirmar la purificación, el ADN digerido se sometió a electroforesis junto con el patrón HindIII de \lambda y el ADN de \lambda digerido por BglII soluble.

Ejemplo 5

Desfosforilación de fragmentos de ADN utilizando CIP inmovilizada sobre partículas magnéticas

Se suspendieron 10 mg de Partículas superparamagnéticas Estapor EM2 100/40 de Prolabo lavadas, en 900 \mul de tampón fosfato 20 mM (pH 7,4; NaCl 150 mM; MgCl_{2} 1 mM; ZnCl_{2} 0,1 mM). Se añadieron a la suspensión 2 mg de DSS (disuccinatoimidil suberato) suspendidos en 100 \mul de DMF (N,N-dimetilformamida). La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos mezclando lentamente.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia según la invención y se lavaron una vez con 1 ml y una vez con 0,5 ml de tampón fosfato a temperatura ambiente.

Las partículas se suspendieron en 200 \mul de tampón fosfato que contenía 160 \mug de CIP (fosfatasa intestinal de ternero) y la suspensión se incubó durante 30 min a temperatura ambiente mezclando suavemente.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia y se lavaron dos veces con 0,5 ml de tampón fosfato a temperatura ambiente. Las partículas se suspendieron en 1 ml de tampón Tris 35 mM (pH 8,0; KCl 50 mM; MgCl_{2} 1 mM; ZnCl_{2} 0,1 M) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos mezclando suavemente.

La partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia y se lavaron dos veces con 1 ml de tampón Tris 10 mM (pH 8,0; KCl 50 mM; MgCl_{2} 1 mM; ZnCl_{2} 0,1 M) a temperatura ambiente. Las partículas se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón.

El ADN del plásmido pUC19 se cortó con la enzima de restricción soluble BglII para obtener 1 fragmento de 568 pb y 1 fragmento de 118 pb. Se incubaron 0,5 \mug de los fragmentos durante 1 h a 37ºC con diferentes cantidades de CIP unido a partículas magnéticas. Se utilizaron 10 \mul de Tris 10 mM (pH 7,9; MgCl_{2} 10 mM; DTT 1 mM; NaCl 50 mM) como tampón de la reacción.

Tras la desfosforilación, las partículas con CIP inmovilizada sobre ellas se recogieron fuera de la mezcla de reacción con el dispositivo de transferencia según la invención.

Se añadieron 7,5 \mul de H_{2}O, 2 \mul de Tris 300 mM (pH 7,8; MgCl_{2} 100 mM; DTT 100 mM; ATP 10 mM) y 0,5 \mul de ligasa (3 U/\mul) a los fragmentos desfosforilados y la mezcla de reacción así obtenida se incubó a 15ºC durante 17 h.

Los fragmentos de ADN tratados con ligasa se sometieron a electroforesis junto con el patrón de HindIII de \lambda, controles de ligación y el plásmido pUC19 sin cortar, con el fin de confirmar la funcionalidad de CIP inmovilizada sobre las partículas magnéticas.

Ejemplo 6

Inactivación de enzima de restricción utilizando proteinasa K inmovilizada sobre partículas magnéticas

Se disolvieron 0,23 mg de B-9-ITC (isocianato de biotina con un espaciador de nueve átomos) en 50 \mul de DMF (N,N-dimetilformamida). A esto se añadieron 0,45 mg de proteinasa K que tenía que biotinilarse disuelta en 450 \mul de tampón borato 50 mM, pH 9,5. La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 3,5 h mezclando suavemente. Cualquier reactivo de biotinilación dejado sin reaccionar se eliminó de la disolución mediante filtración en gel. Al mismo tiempo, el tampón se cambió a PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4). La mitad de la proteinasa K biotinilada y filtrada en gel se utilizó para la inmovilización.

Se suspendieron 10 mg de partículas paramagnéticas de estreptavidina BioBeads de Merck lavadas en 1 ml de disolución de proteinasa K filtrada en gel. La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos mezclando suavemente.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución con el dispositivo de transferencia según la invención y se lavaron dos veces con 1 ml de disolución de Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM a temperatura ambiente y ocho veces con 1 ml de tampón Tris 6 mM (pH 7,5; MgCl_{2} 6 mM; NaCl 100 mM; DTT 1 mM) a 50ºC durante 30 minutos. Las partículas lavadas se suspendieron en 1 ml de tampón Tris (pH 8,0; CaCl_{2} 10 mM).

Se suspendieron diversas cantidades de proteinasa K inmovilizada sobre partículas magnéticas en 35 \mul de disolución de reacción que contenía 35 U de enzima de restricción BglII en tampón Tris 6 mM (pH 7,5; MgCl_{2} 6 mM; NaCl 100 mM; DTT 1 mM) y la suspensión se incubó durante 1 h a 37ºC.

Tras inactivar la enzima de restricción, las partículas magnéticas se recogieron fuera de la disolución utilizando el dispositivo de transferencia según la invención. La inactivación con la proteinasa K unida a las partículas magnéticas de las enzimas de restricción BamHI y HindIII también se realizó igual que anteriormente para BglII, pero utilizando como tampón de la reacción tampón Tris 6 mM (pH 7,9; MgCl_{2} 6 mM; NaCl 150 mM; DTT 1 mM).

La actividad de la enzima de restricción tras la inactivación se sometió a ensayo utilizando ADN de \lambda como sustrato. La inactivación de la enzima de restricción se confirmó electroforéticamente aislando las muestras junto con el patrón de ADN digerido.

Ejemplo 7

Detección de hidrocarburos poliaromáticos utilizando un inmunoanálisis basado en partículas magnéticas.

La detección de hidrocarburos poliaromáticos (PAH) se llevó a cabo con el dispositivo de transferencia según la invención y PAHs RaPID Assay® de Strategic Diagnostics que es un inmunoanálisis basado en partículas magnéticas unidas a enzimas.

Se pipetearon 150 \mul de patrones de fenantreno de 2, 10 y 50 ppb en tubos de microcentrífuga por duplicado. Se añadieron a los tubos 150 \mul del conjugado enzima - anticuerpo frente a PAH (análogo de PAH marcado con peroxidasa de rábano) y 300 \mul de partículas paramagnéticas acopladas a anticuerpo frente a PAH (anticuerpos de conejo anti-PAH unidos covalentemente a micropartículas). Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Las partículas magnéticas se recogieron fuera de las disoluciones de reacción con el dispositivo de transferencia según la invención y se lavaron dos veces con 600 \mul de disolución de lavado (agua más detergente).

Las partículas se suspendieron en 300 \mul de disolución de color (peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina en una base orgánica) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron a cada tubo 500 \mul de disolución de parada (ácido sulfúrico al 0,5%).

Las muestras se midieron espectrofotométricamente a 450 nm utilizando la disolución de lavado como blanco. Se representó una curva patrón a partir de los resultados.

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Esquema 1

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Esquema 2

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Claims (26)

1. Dispositivo de transferencia (2, 2', 2'', 2''') adecuado para capturar y liberar micropartículas (12) que comprenden una sustancia inmovilizada unida, caracterizado porque el dispositivo comprende un imán (8), así como una membrana extensible (18, 18') de material elastomérico, de tal modo que la membrana (18, 18') esté estrechamente presionada contra la superficie del imán y separe el imán (8) de las micropartículas (12) pero no debilite sustancialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas (12).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el material elastomérico se selecciona de entre el grupo que consta de caucho de silicona, poliuretano, fluoroelastómero, policloropreno y polietileno clorosulfonado.

3. Dispositivo de transferencia (2, 2', 2'') según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un imán (8), que es un imán permanente, que se puede mover axialmente hacia atrás y hacia delante en una parte de cuerpo (4) a modo de tubo, y en un extremo de la parte de cuerpo (4, 4'), una membrana (18) contra la que puede presionarse la superficie del imán permanente con el fin de capturar las micropartículas sobre la membrana (18) y a partir del cual pueden liberarse las micropartículas desplazando el imán (8) permanente a distancia de la membrana (18).

4. Dispositivo de transferencia según la reivindicación 1, caracterizado porque el imán está realizado en material magnetizable que está magnetizado con un campo eléctrico o con la ayuda de un imán permanente, porque el imán está magnetizado con el fin de capturar micropartículas sobre la membrana y porque el campo magnético se elimina al eliminar el campo eléctrico de magnetización o al separar el imán permanente del imán magnetizable con el fin de liberar las micropartículas.

5. Dispositivo de transferencia (2''') según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende varios imanes (8) con los que transferir simultáneamente una sustancia inmovilizada sobre las micropartículas (12) desde una pluralidad de primeros recipientes vecinos hacia una pluralidad de segundos recipientes vecinos.

6. Dispositivo de transferencia (2') según la reivindicación 5, caracterizado porque una membrana (18') común a varios imanes (8) separa las micropartículas (12) de las superficies de los imanes (8).

7. Dispositivo de transferencia (2') según la reivindicación 6, caracterizado porque el dispositivo (2') está equipado con unos manguitos (26) en los que los imanes (8) se mueven en dirección axial y por los cuales se extiende la membrana.

8. Dispositivo de transferencia (2') según la reivindicación 7, caracterizado porque la membrana (18') está preconfigurada de tal modo que comprende para cada imán (8) un área (24) adecuadamente preconfigurada.

9. Dispositivo de transferencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la parte de cuerpo (4'') del dispositivo de transferencia (2'') está conectada adecuadamente a un cuerpo (32) de pipeta (30), de tal modo que el movimiento del imán (8) del dispositivo de transferencia (2'') pueda controlarse con un dispositivo de control (10'') previsto para controlar la pipeta (30).

10. Dispositivo de transferencia (2''') según la reivindicación 1, caracterizado porque el cuerpo (4''') del dispositivo de transferencia es alargado, y comprende dos brazos (36, 38) alargados esencialmente paralelos, en el que en un primer extremo del primer brazo (36) está previsto un imán (8) y en un primer extremo del segundo brazo (38) está previsto un soporte (40) para el extremo saliente (16), porque los brazos (36, 38) están interconectados y porque los brazos están sometidos opcionalmente a una fuerza de muelle con el objeto de separar aún más o unir los primeros extremos de los brazos (36, 38).

11. Procedimiento para la transferencia de una sustancia inmovilizada a micropartículas desde un primer recipiente hasta un segundo recipiente, en el que las micropartículas son de material magnético o magnetizable o las micropartículas están unidas a un cuerpo magnético o magnetizable y las micropartículas, a las que se inmoviliza la sustancia, se capturan con la ayuda de un imán sumergido en el primer recipiente, el imán junto con las micropartículas capturadas al mismo se transfiere al segundo recipiente y las micropartículas se liberan de la influencia del imán, caracterizado porque la superficie del imán está separada de las micropartículas por una membrana extensible de material elastomérico, de tal modo que la membrana está estrechamente presionada contra la superficie del imán y separa el imán de las micropartículas pero no debilita sustancialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el material elastomérico se selecciona de entre el grupo que consta de caucho de silicona, poliuretano, fluoroelastómero, policloropreno y polietileno clorosulfonado.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el imán es un imán permanente que se acerca a la membrana con el fin de capturar las micropartículas sobre la membrana y porque el imán permanente se aleja de la membrana con el fin de liberar las micropartículas.

14. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el imán está realizado en material magnetizable que está magnetizado con un campo eléctrico o con la ayuda de un imán permanente con el fin de capturar micropartículas sobre la membrana y porque el campo magnético se elimina al eliminar el campo eléctrico de magnetización o al separar el imán permanente del material magnetizable con el fin de liberar las micropartículas.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque las micropartículas son partículas paramagnéticas, superparamagnéticas o ferromagnéticas.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la sustancia inmovilizada es una proteína, polipéptido o hapteno.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la sustancia inmovilizada es una enzima de restricción o una enzima de modificación de ADN y/o ARN.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la sustancia inmovilizada es una proteasa, preferiblemente la proteinasa K.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la sustancia inmovilizada es un ácido nucleico.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la sustancia inmovilizada es una célula o un virus.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, caracterizado porque la sustancia inmovilizada sobre las micropartículas magnéticas o magnetizables se transfiere con un dispositivo de transferencia asociado a un equipo automatizado.

22. Procedimiento para modificar ácido nucleico con una enzima de modificación de ácidos nucleicos, caracterizado porque la enzima inmovilizada sobre las micropartículas se transfiere a un recipiente de reacción en el que debe tener lugar la modificación del ácido nucleico y porque la enzima inmovilizada se extrae del recipiente de reacción mediante el procedimiento según la reivindicación 11.

23. Procedimiento para la transferencia de ácido nucleico tal como ADN, ARN, de un recipiente a otro, caracterizado porque las micropartículas, sobre las que debe unirse el ácido nucleico, se transfieren al recipiente de reacción en el que está unido el ácido nucleico (ADN, ARN) a las micropartículas, y a continuación las micropartículas se extraen del recipiente de reacción mediante el procedimiento según la reivindicación 11.

24. Sistema de tratamiento de muestras basado en una sustancia inmovilizada a micropartículas, caracterizado porque comprende:

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una o varias series de pocillos (58) en el que cada serie, preferiblemente alineada paralelamente a las otras, comprende al menos un primer pocillo (60) que contiene la cantidad de micropartículas que deben dosificarse y opcionalmente los conservantes necesarios, y opcionalmente un segundo pocillo (62) que contiene una segunda sustancia en la que la cantidad de micropartículas puede estar sumergida para un primer tratamiento tal como lavado antes de introducirse opcionalmente en un tercer pocillo (64), en el que tiene lugar el segundo tratamiento deseado, tal como una reacción, y

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un dispositivo de transferencia (2', 2'', 2''') que comprende un imán (8) y una membrana extensible (18, 18') de material elastomérico, de tal modo que la membrana (18, 18') esté estrechamente presionada contra la superficie del imán y separe el imán (8) de las micropartículas (12) pero no debilite sustancialmente el campo magnético dirigido a las micropartículas (12).

25. Sistema de tratamiento de muestras según la reivindicación 24, caracterizado porque el material elastomérico se selecciona de entre el grupo que consta de caucho de silicona, poliuretano, fluoroelastómero, policloropreno y polietileno clorosulfonado.

26. Sistema de tratamiento de muestras según la reivindicación 24, caracterizado porque cada serie de pocillos (58) forma una tira (58) separada, y porque un número deseado de tiras (58), que pueden estar opcionalmente interconectadas, forman una placa (56).