KR100682945B1 - 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액에 현탁시키는 단계; 상기 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하여 세포 또는 바이러스를 응집(flocculation)시키는 단계; 상기 수득된 용액을 고체 기판과 접촉시켜 세포 또는 바이러스를 상기 기판에 부착시키는 단계; 및 상기 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판을 액체상으로부터 분리하는 단계를 포함하는 상 분리를 이용한 세포 또는 바이러스의 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 세포를 고농도로 분리할 수 있으며, 유동 제어 시스템에서도 고농도의 세포 분리가 가능하므로 랩온어칩에 용이하게 적용할 수 있다.

Description

상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트{Cell separation method and kit using phase separation}
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 세포 또는 바이러스를 분리하는 일 구체예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 코스모트로픽 염의 종류에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 광학 현미경으로 촬영한 것이다.
도 4는 pH에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다.
도 5는 pH에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다.
도 6은 PEI 농도에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다.
도 7은 PEI 농도에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다.
도 8은 고체 기판의 종류에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다.
도 9는 유동 제어 시스템에서 각각의 고체 기판에 부착된 대장균 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 NaOH 처리 유무에 따른 고체 기판에 결합된 대장균 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트에 관한 것이다.
세포 및 원하지 않는 불순물을 포함하는 혼합물로부터 세포의 분리는 당업계에서 중요한 문제이다. 이는 특히 이용된 방법이 높은 비율의 세포를 포획하거나, 실질적으로 모든 세포를 있는 그대로 포획할 필요가 있을 때 세포가 배양 배지, 생물학적 시료 또는 유사한 복잡한 혼합물에 존재할 경우에 사실이다. 이는 세포 농축 및 분리 단계에 이용된 시약이 다양한 범위의 세포 밀도로부터 세포를 매우 효율적으로 포획해야 한다는 것을 의미한다. 또한, 이용된 시약은 세포를 이용하고, 상기 세포로부터 핵산을 회수하고, 상기 핵산을 가공하는 하류(downstream) 단계를 방해해서는 안된다.
고체 지지체에 세포의 결합은 임의의 공지되거나 편리한 방식에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 지지체에 세포의 비특이적인 결합은 고체 지지체 및 조건, 예를 들면, 고체 지지체의 표면의 화학적 또는 물리적 성질(예를 들면, 소수성 또는 전하), 분리 매질의 pH 또는 조성물의 적당한 선택에 의해 달성될 수 있다. 표적 세포의 성질은 또한 중요한데, 예를 들면, 특정 소수성 세포는 소수성 표면에 비특이적으로 용이하게 결합할 수 있는 반면, 친수성 세포는 더욱 친수성 표면에 결합할 수 있다. B 림프구와 같은 음전하의 세포는 또한 약한 양전하의 표면에 높 은 정도의 비특이적인 결합을 갖는 것으로 관찰되었다. 그리하여, 원하는 세포 유형의 결합을 위해 적당하게 하전된 표면을 갖는 고체 지지체가 이용될 수 있다. 적당한 완충액 등이 고체 지지체 및 시료를 적당한 매질에 접촉되게 하여, 세포 결합에 대한 적당한 조건을 달성하기 위해 세포 분리 단계용 매질로서 이용될 수 있다. 편리하게, 적당한 전하, 삼투압 등의 완충액이 고체 지지체와 접촉하기 전에, 동시에 또는 접촉 후에 첨가될 수 있다.
미국 특허 제6,617,105호에는 세포 결합 모이어티로 코팅된 고체 지지체 상에 시료 중의 세포를 결합시키는 단계; 및 분리된 세포를 용해하는 단계를 포함하는, 세포 시료로부터 핵산을 분리하는 방법이 기재되어 있다. 이는 세포 응집제로서 이소프로판올 및 0.75M 암모늄 아세테이트를 이용하고 있으나, 본 발명의 특정 pH의 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)을 이용하여 세포를 효율적으로 분리한다는 기재는 없다.
국제공개 WO03/102184호에는 세포를 포함하는 혼합물과, 응집제(flocculating agent)가 폴리아민 또는 양이온성 계면활성제인 세포를 응집할 수 있는 응집제 및 세포를 결합할 수 있는 고체상과 접촉시키는 단계, 고체상을 이용하여 상기 혼합물로부터 응집된 세포를 분리하는 단계; 및 상기 세포로부터 표적 핵산을 정제하는 단계를 포함하는, 표적 핵산을 포함하는 세포를 분리하는 방법이 기재되어 있다. 이는 폴리아민과 같은 세포 응집제를 이용하여 세포를 분리한다고 기재되어 있으나, 본 발명의 특정 pH의 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)을 이용하여 세포를 효율적으로 분리한다는 기재는 없다.
박테리아나 바이러스로부터 핵산을 정제할 때, 세포 또는 바이러스의 초기 농도가 매우 낮을 때에는 세포 또는 바이러스의 농축이 필요한데, 특히 소형화된 칩에서는 시료의 부피가 작을 수 밖에 없으므로 세포 농축에 관한 연구가 더욱 요구된다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 세포 또는 바이러스의 분리 방법을 연구하던 중, 본 발명의 특정 pH의 코스모트로픽 염(kosmotropic salt), 세포 응집제 및 고체 기판을 이용함으로써 세포 또는 바이러스의 분리 효율이 증가된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액에 현탁시키는 단계; 상기 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하여 세포 또는 바이러스를 응집(flocculation)시키는 단계; 상기 수득된 용액을 고체 기판과 접촉시켜 세포 또는 바이러스를 상기 기판에 부착시키는 단계; 및 상기 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판을 액체상으로부터 분리하는 단계를 포함하는 상 분리를 이용한 세포 또는 바이러스의 분리 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 양이온성 중합체; pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액하에서 형성되는 세포와 양이온성 중합체의 복합체; 및 세포와 양이온성 중합체의 복합체를 결합할 수 있는 고체 기판을 포함하는 세포 또는 바이러스 분리용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액에 현탁시키는 단계;
상기 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하여 세포 또는 바이러스를 응집(flocculation)시키는 단계;
상기 수득된 용액을 고체 기판과 접촉시켜 세포 또는 바이러스를 상기 기판에 부착시키는 단계; 및
상기 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판을 액체상으로부터 분리하는 단계를 포함하는 상 분리를 이용한 세포 또는 바이러스의 분리 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특정 pH의 코스모트로픽(kosmotropic) 염, 세포 응집제 및 고체 기판을 이용하여 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 세포 또는 바이러스를 분리하는 일 구체예를 나타내는 모식도이다.
구체적으로, 특정 pH의 코스모트로픽 염에 세포 또는 바이러스를 현탁시킨 후, 폴리아민과 같은 세포 응집제를 첨가하면, 세포 또는 바이러스는 응집이 된다. 상기 응집된 세포 또는 바이러스를 고체 기판과 접촉시키면 세포 또는 바이러스는 고체 기판에 부착하게 된다. 따라서, 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판상과 세포 또는 바이러스가 제거된 액체상으로 상 분리가 일어나면서 세포 또는 바이러스는 분리되는 것이다.
본 발명의 방법은 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 pH 3 내지 6의 코스 모트로픽(kosmotropic) 염 용액에 현탁시키는 단계를 포함한다. 세포를 고농도로 고체 기판에 부착시키기 위해서는 세포 또는 바이러스를 코스모트로픽 염에 먼저 현탁시킨 후, 세포 응집제를 첨가해야 한다. 본 발명에서는 pH가 매우 중요한데, 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, pH가 3 내지 6의 범위를 벗어나면 세포 또는 바이러스가 고체 기판에 부착되는 효율이 매우 감소하게 된다.
또한, 코스모트로픽 염의 종류도 매우 중요하다. 코스모트로픽 염은 일반적으로 물에 용해된 많은 물질의 용해도를 감소시킨다. 코스모트로픽 염의 종류에 따라서 세포 또는 바이러스의 응집 효율이 달라질 수 있는데, 예를 들면, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 코스모트로픽 염은 세포 또는 바이러스를 잘 응집하나, 아세테이트 또는 설페이트와 같은 코스모트로픽 염은 세포 또는 바이러스를 응집하는 효율이 매우 낮다.
본 발명의 방법은 상기 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하여 세포 또는 바이러스를 응집(flocculation)시키는 단계를 포함한다. 세포 또는 바이러스가 현탁된 코스모트로픽 염의 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하면 세포 또는 바이러스는 응집하게 된다.
본 발명의 방법은 상기 수득된 용액을 고체 기판과 접촉시켜 세포 또는 바이러스를 상기 기판에 부착시키는 단계를 포함한다. 상기 응집된 세포 또는 바이러스를 고체 기판과 접촉시키면, 상기 세포 또는 바이러스는 고체 기판에 부착되게 된다.
본 발명의 방법은 상기 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판을 액체상으 로부터 분리하는 단계를 포함한다. 처음에 코스모트로픽 염에 현탁된 세포 또는 바이러스는 응집되어 고체 기판에 부착되므로, 결국 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판상과 세포 또는 바이러스가 제거된 액체상으로 상 분리가 일어나면서 세포 또는 바이러스는 분리되는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 폴리아민일 수 있다. 폴리아민인 응집제는 하나 이상의 공유적으로 연결된 단위를 갖는 물질을 의미하며, 각 단위는 하나 이상의 아민기, 예를 들면, 일차, 이차, 삼차, 4차, 방향족 또는 헤테리고리 아민기를 가지며, 이는 세포 분리 방법에 이용되는 pH에서 양전하를 띤다. 바람직한 폴리아민은 복수의 공유적으로 연결된 단위를 포함한다. 폴리아민을 형성하는 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 아민기외에, 폴리아민은 비치환되거나 또는 하나 이상의 작용기로 치환될 수 있다. 폴리아민의 바람직한 예는 폴리아미노산, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 폴리알킬이민, 아민기를 포함하는 중합된 생물학적 완충액 및 폴리글루코스아민을 포함한다. 상기 종류의 모든 폴리아민은 치환 또는 비치환될 수 있다.
폴리아민이 폴리아미노산인 경우에, 폴리아미노산을 형성하는 연결된 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 바람직한 예는 폴리-라이신 또는 폴리-히스티딘을 포함한다. 폴리아미노산을 형성하기 위해 이용되는 아미노산은 D 또는 L 아미노산 또는 양자의 혼합물일 수 있다.
폴리아민이 폴리알릴아민 또는 폴리알릴아민.HCl 인 경우에, 폴리알릴아민은 바람직하게는 하기 식으로 표시된다:
폴리(폴리알릴아민 히드로클로라이드): [-CH2CH(CH2NH2.HCl)-]n 또는
폴리(폴리알릴아민): [-CH2CH(CH2NH2)-]n
(식 중, n은 3 이상이며, 폴리알릴아민은 비치환되거나 또는 하나 이상의 치환기를 가질 수 있다).
상기 물질은 2-프로펜-1-아민 또는 알켄 및 아민 작용기를 포함하는 유사한 단량체의 중합에 의해 제조될 수 있다. 폴리알릴아민의 예는 고체 또는 용액의 형태(예를 들면, 20 중량% 용액)로서 Aldrich 사로부터 제공될 수 있으며, 이는 본 발명에 유용하다. 전형적인 폴리알릴아민은 폴리(알릴아민) 참고번호 47,914-4(20 중량% 용액, Mw 약 65,000), 폴리(알릴아민) 참고번호 47,913-6(20 중량% 용액, Mw 약 17,000), 폴리(알릴아민 히드로클로라이드) 참고번호 28,321-5(고체, Mw 약 15,000), 및 폴리(알릴아민 히드로클로라이드) 참고번호 28,322-3(고체, Mw 약 70,000)을 포함한다.
폴리아민이 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 폴리알킬이민인 경우에, 예를 들면 하기 화학식으로 표시되는 것이 바람직하다:
폴리에틸렌이민: (-NHCH2CH2-)x[-N(CH2CH2NH2)CH2CH2-]y.
상기 폴리아민은 폴리 비스-트리스와 같은 중합된 생물학적 완충액일 수 있다. 아민기를 가지며, 중합될 수 있는 생물학적 완충액의 예는 하기와 같다:
비스-2-히드록시에틸이미노트리스히드록시메틸메탄 (비스-트리스), pKa 6.5.
1,3-비스트리스히드록시메틸메틸아미노프로판 (비스-트리스 프로판), pKa 6.8.
N-트리스히드록시메틸메틸글리신 (트리신), pKa 8.1.
트리스히드록시메틸아미노메탄 (트리스), pKa 8.1.
상기 폴리아민은 키토산과 같은 폴리글루코스아민일 수 있으며, 이는 갑각류의 껍질로부터 유래되거나 D-글루코스아민의 반복 단위로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 접촉 단계는 정지(static) 또는 유동(fluidic) 상태에서 수행할 수 있다. 세포 또는 바이러스와 상기 고체 기판을 정지 상태에서 접촉시키는 것도 가능하지만, 유동 상태에서 접촉시키는 것도 가능하다. 즉, 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액을 유동 제어 시스템에서 유동시키면서 고체 기판과 세포 또는 바이러스를 접촉시키는 것이다. 유동 제어 시스템에서, 고체 기판은 평면 형태도 가능하지만, 세포 또는 바이러스와 고체 기판의 접촉 기회를 증가시켜 더 많은 세포 또는 바이러스를 포획하기 위해 수 많은 기둥(pillar) 구조를 가질 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 고체 기판은 평면, 비드 또는 기둥 구조를 가질 수 있다. 상기 고체 기판은 세포 또는 바이러스를 부착할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으나, 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 중에 용해되어서는 안된다.
편리하게, 상기 기판은 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합체성 물질로 제조될 수 있다. 세포를 결합하는 높은 표면적을 제공하는 물질이 바람직하다. 상기 기판은 일반적으로 평평하지 않은 표면을 가질 수 있으며, 예를 들면, 다공성 또는 미립자일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 세포 또는 바이러스는 박테리아 세포, 박테리오파아지, 식물 세포, 동물 세포, 식물 바이러스, 동물 바이러스 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 코스모트로픽(kosmotropic) 염은 시트레이트 또는 포스페이트일 수 있다. 모든 코스모트로픽 염에서 상 분리 현상이 일어나는 것은 아니며, 시트레이트 및 포스페이트 완충액에서 상 분리 현상이 일어난다. 따라서, 특정의 코스모트로픽 염을 이용해야 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 상기 고체 기판과 커플링되거나, 혼합되어, 혼합물로부터 세포를 분리하는데 이용될 수 있다. 이는 고체 기판에 세포를 응집하게 하여, 혼합물로부터 세포를 분리하는데 이용될 수 있게 한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 초기에는 가용성이며, 혼합물에서 세포와 함께 응집되어 상이 분리될 수 있다. 예를 들면, 양이온성 중합체를 물에 용해한 후, 코스모트로픽 염에 용해된 세포 또는 바이러스 현탁액과 혼합하면 상기 양이온성 중합체는 세포와 함께 응집되어 고체상으로 이동하게 된다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
양이온성 중합체;
pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액하에서 형성되는 세포와 양이온성 중합체의 복합체; 및
세포와 양이온성 중합체의 복합체를 결합할 수 있는 고체 기판을 포함하는 세포 또는 바이러스 분리용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 세포 또는 바이러스 분리용 키트는 세포 또는 바이러스를 응집할 수 있는 양이온성 중합체, pH 3 내지 6의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액하에서 형성되는 세포와 양이온성 중합체의 복합체, 및 세포와 양이온성 중합체의 복합체를 결합할 수 있는 고체 기판을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 고체 기판은 평면 또는 기둥 구조를 가질 수 있다. 고체 기판은 평면 형태도 가능하지만, 세포 또는 바이러스와 고체 기판의 접촉 기회를 증가시켜 더 많은 세포 또는 바이러스를 포획하기 위해 수 많은 기둥(pillar) 구조를 가질 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 세포 또는 바이러스는 박테리아 세포, 박테리오파아지, 식물 세포, 동물 세포, 식물 바이러스, 동물 바이러스 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 코스모트로픽(kosmotropic) 염은 시트레이트 또는 포스페이트일 수 있다. 모든 코스모트로픽 염에서 상 분리 현상이 일어나는 것은 아니며, 시트레이트 및 포스페이트 완충액에서 상 분리 현상이 일어난다. 따라서, 특정의 코스모트로픽 염을 이용해야 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 폴리아민일 수 있다. 폴리아민인 응집제는 하나 이상의 공유적으로 연결된 단위를 갖는 물질을 의미하며, 각 단위는 하나 이상의 아민기, 예를 들면, 일차, 이차, 삼차, 4차, 방향족 또는 헤테리고리 아민기를 가지며, 이는 세포 분리 방법에 이용되는 pH에서 양전하를 띤다. 바람직한 폴리아민은 복수의 공유적으로 연결된 단위를 포함한다. 폴리아민을 형성하는 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 아민기외에, 폴리아민은 비치환되거나 또는 하나 이상의 작용기로 치환될 수 있다. 폴리아민의 바람직한 예는 폴리아미노산, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 폴리알킬이민, 아민기를 포함하는 중합된 생물학적 완충액 및 폴리글루코스아민을 포함한다. 상기 종류의 모든 폴리아민은 치환 또는 비치환될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 코스모트로픽(kosmotropic) 염을 이용한 상 분리
코스모트로픽 염에 의해 상 분리가 일어나는지를 알아보기 위해, 4 종류의 코스모트로픽 염을 이용하였다. 이용된 코스모트로픽 염은 각각 0.1M, pH 4의 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트, 소듐 아세테이트 및 소듐 설페이트이다. 양이온성 중합체는 분지형의 폴리에틸렌이민(PEI)(분자량 750,000)을 이용하고, 농도는 탈이온수 중의 2.5mg/ml 이었다. 상기 각각의 코스모트로픽 염 150㎕ 및 PEI 용액 150㎕를 Eppendorf 튜브에서 혼합한 후, 상 분리 현상을 관찰하였다. 도 2는 코스 모트로픽 염의 종류에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, 설페이트 및 아세테이트 염에서는 용액 자체가 투명하게 존재하는 반면, 시트레이트 및 포스페이트 염에서는 뿌옇게 되는(cloudy) 것을 알 수 있다. 따라서, 모든 코스모트로픽 염에서 상 분리 현상이 일어나는 것이 아니라, 시트레이트 및 포스페이트 염에서만 층 분리 현상이 일어남을 알 수 있다.
실시예 2: 코스모트로픽(kosmotropic) 염을 이용한 대장균 세포의 상 분리
대장균 세포의 존재하의 코스모트로픽 염에 의해 상 분리가 일어나는지를 알아보았다. 이용된 코스모트로픽 염은 각각 0.1M, pH 4의 소듐 포스페이트, 소듐 시트레이트, 소듐 아세테이트 및 소듐 설페이트이다. 대장균 세포는 BL21(2×107 세포/ml)을 이용하고, 상기 각각의 코스모트로픽 염에 현탁시켰다. 양이온성 중합체는 분지형의 폴리에틸렌이민(PEI)(분자량 750,000)을 이용하고, 농도는 탈이온수 중의 2.5mg/ml 이었다. 상기 각각의 세포 현탁액 150㎕ 및 PEI 용액 150㎕를 혼합하였다. 이용된 고체 기판은 카르복실 코팅된 기판이었다. 60㎕ 패치를 상기 제조한 고체 기판 상에 부착한 후, 상기 세포 현탁액 및 PEI 용액의 혼합물 60㎕를 도포하였다. 이어서, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 상기 현탁액(pH 4) 35ml로 1분 동안 1회 세정하였다. 고체 기판에 결합된 대장균 세포를 염색하기 위해, 당업계에 공지된 대장균 세포용 그람 염색액으로 대장균 세포를 염색하였다. 먼저, 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액을 세포가 결합된 부위에 충분히 덮을 정도의 양을 가한 후 1분 동안 기다린 후, 흐르는 물을 이용하여 세정하였다. 이어서, 그람 요오딘 (gram iodine) 용액, 그람 탈색제, 그람 사프라닌(gram safranin) 용액을 같은 방법으로 처리하여 그람염색을 완성하였다. 그람염색 후 고체 기판을 상온에서 자연 건조시켰다. 염색 후, 광학 현미경을 이용하여 ×450 배율 및 ×3000 배율에서 이미지를 촬영하였다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 광학 현미경으로 촬영한 것이다. 도 3A에서 보여주는 바와 같이, 상기 실험에서 상 분리 현상이 일어났던 2 가지 코스모트로픽 염인 시트레이트 및 포스페이트 염에서는 고체 기판 전체에 균일하게 고농도로 세포 부착이 일어남을 알 수 있다. 이는 정지(static) 시스템에서 소수성 상호작용에 의한 세포 결합보다 약 10배 정도 증가한 결과이다. 도 3B에서 보여주는 바와 같이, 설페이트 및 아세테이트 염에서는 세포 부착이 거의 일어나지 않는다는 것을 알 수 있다. 즉, 상 분리 현상이 세포 부착의 양의 증가를 가져옴을 알 수 있는 것이다.
실시예 3: 상 분리에 대한 pH 효과
상 분리에 대한 pH 효과를 알아보기 위해, pH 3 내지 8의 소듐 포스페이트를 이용하였다. 코스모트로픽 염은 pH 3, 4, 5, 7 및 8의 소듐 포스페이트만을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 유사하게 실험을 수행하였다.
도 4는 pH에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, pH 3 내지 5에서만 상 분리 현상이 일어남을 알 수 있다. 이로부터, 코스모트로픽 염의 효과와 pH에 따른 양이온성 중합체 자체의 특정 변화가 동시에 수반되어야 상 분리 현상이 일어나는 것으로 추측된다.
실시예 4: 세포 부착에 대한 pH 효과
세포 부착에 대한 pH 효과를 알아보기 위해, pH 3 내지 7의 소듐 포스페이트를 이용하였다. 코스모트로픽 염은 pH 3, 4, 5 및 7의 소듐 포스페이트만을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 유사하게 실험을 수행하였다.
도 5는 pH에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다. 도 5에서 보여주는 바와 같이, 상 분리 현상이 일어났던 pH 3 내지 5에서만 세포 부착이 일어남을 알 수 있다. 이로부터, 양이온성 중합체의 상 분리 현상이 직접적인 세포 부착을 야기함을 알 수 있는 것이다.
실시예 5: 상 분리에 대한 PEI 농도 효과
상 분리에 대한 PEI 농도 효과를 알아보기 위해, 탈이온수 중의 0.1 내지 25mg/ml의 PEI 용액을 이용하고, 0.1M 소듐 포스페이트(pH4)를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 유사하게 실험을 수행하였다.
도 6은 PEI 농도에 따른 층 분리 현상을 보여주는 것이다. 도 6에서 보여주는 바와 같이, PEI 농도가 0.1, 0.5, 3 및 5 mg/ml에서만 상 분리 현상이 일어남을 알 수 있으며, 3 mg/ml 및 5 mg/ml의 PEI 농도에서의 상 분리 현상이 0.1 mg/ml 및 0.5 mg/ml의 PEI 농도보다 더욱 선명하게 일어남을 알 수 있다. 또한, 소듐 포스페이트의 농도를 증가시키면, 25 mg/ml의 PEI 농도에서도 상 분리 현상이 일어날 것으로 추측된다.
실시예 6: 세포 부착에 대한 PEI 농도 효과
세포 부착에 대한 PEI 농도 효과를 알아보기 위해, 탈이온수 중의 0.1 내지 25mg/ml의 PEI 용액을 이용하고, 0.1M 소듐 포스페이트(pH4)를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4와 유사하게 실험을 수행하였다.
도 7은 PEI 농도에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다. 도 7에서 보여주는 바와 같이, 명확한 상 분리 현상이 일어났던 0.5 내지 5 mg/ml의 PEI 농도에서만 고농도의 세포 부착이 일어남을 알 수 있다. 이는 코스모트로픽 염의 농도와 상관 관계가 있는 것으로 보이므로, 코스모트로픽 염의 농도를 증가시키면 25 mg/ml의 PEI 농도에서도 세포 부착이 일어날 것으로 추측된다.
실시예 7: 세포 부착에 대한 고체 기판의 효과
세포 부착에 대한 고체 기판의 종류에 따른 효과를 알아보기 위해, 고체 기판으로 양전하 코팅을 위해 GAPS (감마 아미노프로필트리에톡시실란)를 이용한 아민 코팅된 고체 기판 및 음전하 코팅을 위해 카르복실산 코팅된 고체 기판을 이용하고, 탈이온수 중의 0, 0.5 및 2.5mg/ml의 PEI 용액을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 유사하게 실험을 수행하였다.
도 8은 고체 기판의 종류에 따라 고체 기판에 부착된 대장균 세포를 보여주는 것이다. 도 8A에서 보여주는 바와 같이, 음전하의 카르복실산 코팅된 고체 기판은 PEI 용액의 농도가 0 mg/ml인 경우를 제외하고는 대장균 세포가 고체 기판에 고농도로 부착됨을 알 수 있다. 반면에 도 8B에서 보여주는 바와 같이, 양전하의 아민 코팅된 고체 기판은 PEI 용액의 3 가지 농도 모두 대장균 세포의 부착 효율이 음전하의 카르복실산 코팅된 고체 기판보다는 상대적으로 낮음을 알 수 있다.
실시예 8: 유동 제어 시스템에서 대장균 세포의 분리
상기 정지(static) 시스템과는 달리, 유동 제어 시스템에서 세포 부착이 일어나는지를 알아보았다. 고체 기판으로 양전하 코팅을 위해 GAPS (감마 아미노프로필트리에톡시실란)를 이용한 아민 코팅된 고체 기판, 음전하 코팅을 위해 카르복실산 코팅된 고체 기판 및 OTC (옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 클로라이드)를 이용한 소수성 코팅된 고체 기판을 이용하고, 탈이온수 중의 2.5mg/ml의 PEI 용액을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7과 유사하게 실험을 수행하였다.
펌프는 주사기 펌프(HARVARD, PHD2000)를 이용하고, 유속은 0.3cm/초(400㎕/분)이며, 총 표면적은 5mm×17.3mm이며, 단면적은 종횡비(aspect ratio)가 10:1이상인 5mm×0.5mm=2.5mm2이며, 대장균 200㎕가 표면적을 한 번 지나가도록 하였다. 유속 400㎕/분으로 인산나트륨 완충액(pH4) 1ml을 한 번 흘려주며 세정하였다.
도 9는 유동 제어 시스템에서 각각의 고체 기판에 부착된 대장균 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 9에 보여주는 바와 같이, 배율 450배에서는 고체 기판에 결합된 대장균 세포의 판별이 명확하지 않으나, 배율 3000배에서는 막대기 모양의 대장균 세포가 관찰되는 것을 알 수 있다. 따라서, 고정된 시스템과 유사하게 유동 제어 시스템하에서도 대장균 세포가 고체 기판에 효율적으로 부착되며, 특히 카르복실산 코팅된 고체 기판에 대한 대장균 세포의 부착 효율이 상대적으로 매우 높다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 9: 온칩(on-chip) 세포 용해 시험
칩 상에서 분리된 대장균 세포가 효율적으로 용해(lysis)되는지를 알아보았다. 고체 기판으로 양전하 코팅을 위해 GAPS (감마 아미노프로필트리에톡시실란)를 이용한 아민 코팅된 고체 기판을 이용하고, 탈이온수 중의 2.5mg/ml의 PEI 용액을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7과 유사하게 실험을 수행하였다.
세포 용해 시험은 상기 과정을 통해 1장의 칩에 60㎕ 패치를 이용하여 결합된 대장균 세포를 30㎕의 2개의 챔버를 갖는 패치를 이용하여, 하나의 챔버만 0.1N NaOH 용액을 2분간 처리하고, 나머지 챔버는 대조군으로 0.1N NaOH 용액을 처리하지 않았다.
도 10은 NaOH 처리 유무에 따른 고체 기판에 결합된 대장균 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 10에서 보여주는 바와 같이, 0.1N NaOH 용액을 처리한 경우에는 대장균 세포가 용해되어 고체 기판에 부착된 세포를 거의 관찰할 수 없는 반면, 0.1N NaOH 용액을 처리하지 않은 경우에는 대장균 세포가 고체 기판에 그대로 부착되어 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 장치를 이용하여 분리된 세포는 효율적으로 용해되므로, 핵산 정제와 같은 세포 분리 이후의 과정에 유용하게 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 세포를 고농도로 분리할 수 있으며, 유동 제어 시스템에서도 고농도의 세포 분리가 가능하므로 랩온어칩에 용이하게 적용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 pH 3 내지 6의 시트레이트 또는 포스페이트의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액에 현탁시키는 단계;
    상기 현탁액에 양이온성 중합체를 첨가하여 세포 또는 바이러스를 응집(flocculation)시키는 단계;
    상기 수득된 용액을 고체 기판과 접촉시켜 세포 또는 바이러스를 상기 기판에 부착시키는 단계; 및
    상기 세포 또는 바이러스가 부착된 고체 기판을 액체상으로부터 분리하는 단계를 포함하는 상 분리를 이용한 세포 또는 바이러스의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 폴리아민인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리아민은 폴리알릴아민, 폴리아미노산, 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸이민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 정지(static) 또는 유동(fluidic) 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 고체 기판은 평면, 비드, 또는 기둥(pillar) 구조를 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 상기 고체 기판과 커플링되거나, 혼합되어, 혼합물로부터 세포를 분리하는데 이용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 상기 코스모트로픽 염 용액과 혼합되기 전에는 가용성이며, 혼합물에서 세포와 함께 응집되어 상이 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 양이온성 중합체;
    pH 3 내지 6의 시트레이트 또는 포스페이트의 코스모트로픽(kosmotropic) 염 용액; 및
    세포와 양이온성 중합체의 복합체를 결합할 수 있는 고체 기판을 포함하는 세포 또는 바이러스 분리용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 고체 기판은 평면 또는 기둥(pillar) 구조를 가진 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 폴리아민인 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리아민은 폴리알릴아민, 폴리아미노산, 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸이민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 삭제
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