JP2006325592A - 細胞またはウイルスの分離方法および該方法に用いられるキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞またはウイルスを含む試料を、pHが3ないし6であるコスモトロピック塩溶液中に懸濁させるステップと、前記懸濁させるステップで得られた懸濁液に、カチオン性ポリマーを添加して細胞またはウイルスを凝集させるステップと、前記細胞またはウイルスを凝集させるステップで得られた細胞またはウイルスとカチオン性ポリマーとの複合体を、前記カチオン性ポリマーの相分離によって固体基板に付着させるステップと、前記固体基板に付着させるステップで得られた細胞またはウイルスが付着された固体基板を、前記懸濁液から分離するステップと、を含むことを特徴とする細胞またはウイルスの分離方法、および該方法に用いられる細胞またはウイルスの分離用キットである。
【選択図】図1
Description
コスモトロピック塩が相分離を引き起こすか否かを調べるために、4種類のコスモトロピック塩が試験された。用いられたコスモトロピック塩溶液は、それぞれ濃度が0.1Mであり、pHが4であるリン酸ナトリウム溶液、クエン酸ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、および硫酸ナトリウム溶液である。カチオン性ポリマーとして、2.5mg/mlの濃度で脱イオン水に溶解している分枝型のポリエチレンイミン(PEI)(Mw:約750,000)が用いられた。上記の4種類のコスモトロピック塩溶液150μlを、PEI溶液150μlとエッペンドルフチューブで混合した後、相分離を観察した。図2は、これらの混合物のそれぞれの相分離を示す写真である。図2に示したように、硫酸塩の混合物および酢酸塩の混合物は、透明である一方、クエン酸塩の混合物およびリン酸塩の混合物は濁っているということが分かる。したがって、すべてのコスモトロピック塩が相分離を引き起こすのではなく、クエン酸塩およびリン酸塩でのみ相分離が起こるということが分かる。
大腸菌細胞を含むコスモトロピック塩溶液で相分離が起こるかどうかを調べる実験を行った。用いられたコスモトロピック塩は、それぞれ濃度が0.1M、pHが4であるリン酸ナトリウム溶液、クエン酸ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、および硫酸ナトリウム溶液である。大腸菌細胞は、BL21(2×107細胞/ml)が用いられた。大腸菌細胞は、上記のそれぞれのコスモトロピック塩溶液に懸濁された。カチオン性ポリマーとして、2.5mg/mlの濃度で脱イオン水に溶解している分枝型のポリエチレンイミン(PEI)(Mw:約750,000)が用いられた。上記の4種類のそれぞれのコスモトロピック塩溶液150μlとPEI溶液150μlとを混合した。固体基板として、カルボン酸でコーティングされた基板が用いられた。60μlのパッチを、前記のカルボン酸でコーティングされた固体基板上に付着させた後、上記の細胞懸濁液およびPEI溶液の混合物60μlが塗布された。次いで、混合物が塗布された固体基板を、室温で5分間インキュベーションした後、上記の懸濁液(pH4)35mlで、1分間1回洗浄した。固体基板に付着した大腸菌細胞を染色するために、当業界に公知である大腸菌細胞用のグラム染色液を用いて固体基板を染色した。詳細には、大腸菌細胞が付着した固体基板の部分が、クリスタルバイオレット溶液で十分に浸されるように、固体基板にクリスタルバイオレット溶液を塗布し、1分後、流水で固体基板を洗浄した。次いで、固体基板に付着した大腸菌細胞がグラム染色されるように、グラムヨウ素溶液、グラム脱色剤、またはグラムサフラニン溶液で固体基板を処理した。グラム染色後、固体基板を常温で自然乾燥させた。その後、光学顕微鏡を用いて、450倍または3000倍の倍率で固体基板を写真撮影した。
相分離に対するpHの効果を調べるために、pHが3ないし8のリン酸ナトリウム溶液を用いた。本実施例では、pHが3、4、5、7、および8のリン酸ナトリウム溶液をコスモトロピック塩溶液として用いたことを除いては、実施例1と同様に実験を行った。
細胞付着に対するpHの影響を調べるために、pH3ないし7のリン酸ナトリウム溶液(pH3ないし7)を用いた。本実施例では、pH3、4、5、および7のリン酸ナトリウム溶液を用いたことを除いては、前記実施例2と同様に実験を行った。
相分離に対するPEIの濃度の影響を調べるために、0.1ないし25mg/mlの脱イオン水中の濃度を有するPEIの脱イオン水溶液を用いた。本実施例では、0.1Mのリン酸ナトリウム溶液(pH4)を用いたことを除いては、前記実施例3と同様に実験を行った。
細胞付着に対するPEIの濃度の影響を調べるために、0.1ないし25mg/mlの脱イオン水中の濃度を有するPEI溶液を用いた。本実施例では、0.1Mのリン酸ナトリウム溶液(pH4)を用いたことを除いては、前記実施例4と同様に実験を行った。
細胞付着に対する固体基板の種類の影響を調べるために、ガンマ アミノプロピルトリエトキシシラン(GAPS)を用いて正電荷コーティングされた、アミンコーティングされた固体基板、および負電荷コーティングされたカルボン酸コーティングされた固体基板を用いた。本実施例では、0、0.5および2.5mg/mlの脱イオン水中の濃度を有するPEI溶液を用いたことを除いては、前記実施例6と同様に実験を行った。
流動制御システムで細胞付着が起こるかを調べるために実験を行った。本実施例では、GAPSを用いて正電荷コーティングされたアミンコーティングされた固体基板、負電荷コーティングされたカルボン酸コーティングされた固体基板、およびオクタデシルジメチル(3−トリメトキシシリルプロピル)アンモニウムクロライド(OTC)を用いて疎水性コーティングされた固体基板を用いた。その他、2.5mg/mlの脱イオン水中の濃度を有するPEI溶液を用いたことを除いては、前記実施例7と同様に実験を行った。
オン・チップで分離された大腸菌細胞が効率的に溶解されるかを調べるために実験を行った。本実験では、GAPSを用いて正電荷コーティングされたアミンコーティングされた固体基板を用いた。その他、2.5mg/mlの脱イオン水中の濃度を有するPEI溶液を用いたことを除いては、前記実施例7と同様に実験を行った。
Claims (13)
- 細胞またはウイルスを含む試料を、pHが3ないし6であるコスモトロピック塩溶液中に懸濁させるステップと、
前記懸濁させるステップで得られた懸濁液に、カチオン性ポリマーを添加して細胞またはウイルスを凝集させるステップと、
前記細胞またはウイルスを凝集させるステップで得られた細胞またはウイルスとカチオン性ポリマーとの複合体を、前記カチオン性ポリマーの相分離によって固体基板に付着させるステップと、
前記固体基板に付着させるステップで得られた細胞またはウイルスが付着した固体基板を、前記懸濁液から分離するステップと、
を含むことを特徴とする、細胞またはウイルスの分離方法。 - 前記カチオン性ポリマーは、ポリアミンであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリアミンは、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリエチレンイミン、ポリエチルイミン、およびポリグルコースイミンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記固体基板に付着させるステップは、静止状態または流動状態で行われることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体基板は、平面構造、ビーズ構造、または柱構造を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コスモトロピック塩は、クエン酸塩またはリン酸塩であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カチオン性ポリマーは、前記固体基板と連結されるかまたは混合されて、細胞またはウイルスの分離に用いられることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カチオン性ポリマーは、初期には可溶性であり、コスモトロピック塩溶液に添加される時に細胞と共に凝集して、それにより相が分離されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- カチオン性ポリマーと、
pHが3ないし6であるコスモトロピック塩溶液と、
細胞またはウイルスとカチオン性ポリマーとの複合体を付着できる固体基板と、
を備えることを特徴とする、細胞またはウイルスの分離用キット。 - 前記固体基板は、平面構造、ビーズ構造、または柱構造を有することを特徴とする、請求項9に記載のキット。
- 前記カチオン性ポリマーは、ポリアミンであることを特徴とする、請求項9または10に記載のキット。
- 前記ポリアミンは、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリエチレンイミン、およびポリエチルイミンでからなる群より選択されることを特徴とする、請求項11に記載のキット。
- 前記コスモトロピック塩は、クエン酸塩またはリン酸塩であることを特徴とする、請求項9〜12のいずれか1項に記載のキット。
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