CN1956780B - 亲和颗粒和亲和分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异性亲和性的配体。本发明的目的还在于提供亲和分离方法，该方法通过利用有机颗粒的亲和颗粒，可简便且高精度地分离目标物质。

Description

亲和颗粒和亲和分离方法
技术领域
本发明涉及亲和颗粒和亲和分离方法。更具体的说，涉及利用了有机颗粒的亲和颗粒和可高精度且容易分离目标物质的亲和分离方法。本发明的亲和颗粒对于可高精度且容易地检测目标物质的免疫沉淀法、胶乳凝集法等为代表的各种分离、纯化、检测方法也极为有用。
背景技术
以往，生物体物质的分离纯化是采用柱层析。但是，柱分离中由以下(1)-(3)所示的致命的问题。
(1)为了获得目标物质，必须使用多种柱，纯化效率差。
(2)必须进行确认实验，以确认分离成分中是否含有目标物质，因此纯化需要较多时间。
(3)纯化时的损失大，需要大量的样品。
为此，在目标物质的分离纯化中采用了担载有配体的亲和柱或亲和颗粒(专利文献1、专利文献2)。
但是，通过亲和柱进行分离纯化有以下的问题。
(1)所需目标物质无法选择性分离。即，除被配体捕捉的目标物质之外，不希望的目标物质也吸附在柱上。
(2)捕捉效率低，需要大量的液体试样。
另外，在使亲和颗粒分散在液体试样中进行分离的亲和分离方法中，要使用琼脂糖等(非专利文献1)，这有无法选择性分离所需目标物质的问题。即，除被配体捕捉的目标物质之外，不希望的物质也吸附于亲和颗粒上。
含有有机颗粒的亲和颗粒除上述致命问题之外，在高盐浓度的试样中还存在有机颗粒容易发生凝聚的问题。因此，需要将试样稀释进行测定。
专利文献1：日本特公平8-26076号公报
专利文献2：日本特表平2002-511141号公报
非专利文献1：Bioconjugate Chem.；2002；13(2)；163-166
发明内容
发明所要解决的课题
本发明为解决上述课题而设，提供在各种分离、纯化、检查方法等中使用的、含有有机颗粒的亲和颗粒。
解决课题的方法
本发明的第一方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附配体的基团，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm；通过在上述有机颗粒的表面直接导入氨基，并由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，将所得醛体或水合物与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，使上述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，或者使下式(2)所示化合物与上述氨基反应。
[化1]
[化9-1]
n为1-12的整数。
本发明的第二方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500um；通过在上述有机颗粒的表面直接导入氨基，并由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，将所得醛体或水合物与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，使上述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，或者使下式(2)所示化合物与上述氨基反应。
[化2]
Figure G200580016582101D00041
[化9-2]
Figure G200580016582101D00042
n为1-12的整数。
本发明的第三方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附配体的基团，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm；由存在于上述有机颗粒表面的羟基与下述式(3)或(4)所示化合物的Si-OMe通过脱水形成化学键，由此使上述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面。
[化3]
[化10-1]
[化11-1]
Figure G200580016582101D00052
式中，m为2-6，n为1-4。OMe可以是OEt或Cl。并且，与Si结合的OMe或OEt或Cl中最多两个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基。
本发明的第四方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm；由存在于上述有机颗粒表面的羟基与下述式(3)或(4)所示化合物的Si-OMe通过脱水形成化学键，由此使上述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面。
[化4]
Figure G200580016582101D00061
[化10-2]
[化11-2]
Figure G200580016582101D00063
式中，m为2-6，n为1-4。OMe可以是OEt或Cl。并且与Si结合的OMe或OEt或Cl中最多两个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基。
本发明的第五方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附配体的基团，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm；在上述有机颗粒的表面直接导入羧基，通过常规方法使下述式(9)所示含有磷酰胆碱的化合物与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使上述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面。
[化5]
Figure G200580016582101D00071
[化16-1]
Figure G200580016582101D00072
本发明的第六方面提供一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体，其中所述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm；在上述有机颗粒的表面直接导入羧基，通过常规方法使下述式(9)所示含有磷酰胆碱的化合物与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使上述式(1)的磷酰胆破基直接加成到颗粒表面。
[化3]
[化16-2]
本发明又提供上述亲和颗粒，其特征在于：上述配体为选自各种抗体、抗原、酶、底物、受体、肽、DNA、RNA、适体、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各种金属离子的一种或多种配体。
本发明还提供通过有机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤：(1)使上述本发明第一、三、五方面的技术方案中任一项的亲和颗粒与任意的配体结合的第1步骤，(2)使第1步骤中制造的亲和颗粒分散于液体试样中的第2步骤，其中液体试样含有通过任意的配体选择性捕捉的目标物质，(3)回收由亲和颗粒捕捉的目标物质的第3步骤。
本发明又提供通过有机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤：(1)使上述本发明第二、四、六方面的技术方案中任一项的亲和颗粒分散于液体试样中的第1步骤，其中所述液体试样含有通过任意的配体选择性捕捉的目标物质，(2)回收由亲和颗粒捕捉的目标物质的第2步骤。
将本发明的亲和颗粒应用于免疫沉淀法或胶乳凝集法等抗体或蛋白的检测时，不需要(2)的回收步骤，可通过目视，通过其分散状态的变化容易地进行确认。
发明效果
本发明的亲和颗粒通过配体只捕捉某种目标物质(希望分离的目标物质)，并抑制其他物质吸附于颗粒上，因此分离选择性极高。由于其优异的分散性，以及在血清中等各种盐存在的试样中也不会发生凝聚，因此可简便且高精度地分离目标物质。
也就是说，本发明的目标物质的分离方法可以在短时间有效、且简便地分离以分离为目的的目标物质。通常，物质具有吸附异物的性质，以往的亲和颗粒难以有效地只分离目标物质，但通过用磷酰胆碱基修饰颗粒表面，可极有效地防止目标物质与亲和颗粒的非特异性吸附，可提高纯化效率。
另外，磷酰胆碱基具有极高的亲水性，在含有水的液体试样中，也具有使亲和颗粒的分散性提高的功能。
并且，通常的颗粒有遇盐凝聚的倾向，例如要从血清中分离目标物时，颗粒由于血清中的各种盐而凝聚，纯化效率低，但本发明的亲和颗粒即使在盐的存在下也较少凝聚，可高效回收目标物。
附图简述
图1是表示本发明的亲和颗粒与以往的亲和颗粒在捕捉蛋白质时的选择性的差异的模式图。
图2是合成例1制造的化合物的结构式和NMR波谱。
图3是合成例2制备的化合物的结构式和NMR波谱。
图4是表示以往的亲和颗粒在水中和食盐水中的粒度分布的图表。
图5是表示本发明的亲和颗粒在水中和食盐水中的粒度分布的图表。
图6是比较参考例1制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒与PC颗粒(A)的蛋白质吸附量的图表。
图7是比较参考例2制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒与PC颗粒(B)、(C)的蛋白质吸附量的图表。
图8是比较参考例3制备的琼脂糖珠与PC颗粒(D)的蛋白质吸附量的图表。
图9是比较实施例1的亲和颗粒的抗体选择性的图表。
图10是比较比较例1的亲和颗粒的抗体选择性的图表。
实施发明的最佳方式
以下详细说明本发明。
“有机颗粒”
本发明中，对于构成亲和颗粒的有机颗粒没有特别限定。有机颗粒通常是指平均粒径为20nm-500μm左右的有机物体。具体的颗粒有：聚合物中含有苯乙烯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸氨基烷基酯、(甲基)丙烯酸羟基烷基酯中的一种或多种单体单元而得到的合成颗粒，或者琼脂糖、琼脂糖凝胶等有机颗粒。也包含外层含有有机的物体、内侧含有无机颗粒的芯-壳结构的混杂颗粒。
特别优选的颗粒是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油基酯-二乙烯基苯共聚物、丙烯酸-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羟基酯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物等可通过乳液聚合、悬浮聚合等容易地合成的颗粒。
上述(1)式的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团通过共价键导入颗粒表面，因此优选其表面具有氨基、羧基、羟基、硫醇基等反应基团的颗粒。
还优选有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm的亲和颗粒。
例如：苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯共聚物、丙烯酸-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羟基酯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物等。
“配体可结合的反应基团或吸附配体的基团”
只要配体可结合即可，没有特别限定。例如共价键形态中，优选酰胺、酯、氨基甲酸乙酯、醚、仲胺、脲键、二硫键等。因此，优选配体可以形成这些共价键形态的反应基团，优选氨基、羟基、羧基、硫醇基等。吸附形态，优选抗生物素蛋白-生物素、金属-螯形化合物等。因此，优选配体可形成这些吸附形态的吸附配体的基团，优选抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物等。
“配体”
本发明中，配体是与某种目标物质特异性结合的物质，是各种抗体、抗原、酶、底物、受体、肽、适体、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各种金属离子等。例如，各种抗体有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY、多糖类、酶有谷胱甘肽-S-转移酶，底物有谷胱甘肽，受体有激素受体、细胞因子受体，配体有凝集素，螯形化合物有氮川三乙酸，各种金属离子有Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+。
“本发明的亲和颗粒的制造方法”
有机颗粒的表面以共价键的形式具有式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式直接存在可以与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附配体的基团，这是本发明的本质，因此其制备方法没有限定，可以通过任何方法结合。
不过，如上所述，使用预先具有磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团的聚合物、没有化学键、只是被覆在颗粒表面的方案不包含在本发明中。这是由于被覆的聚合物可能发生剥离，出现由于被覆聚合物产生的影响。
本发明的亲和颗粒可通过下述方法等制备。
步骤1：向颗粒导入下述式(1)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。对反应基团或吸附配体的基团没有限定，可以是氨基或羟基、羧基、硫醇基等。
步骤2：使式(1)所示的磷酰胆碱基和配体与导入颗粒的反应基团或吸附配体的基团结合。在磷酰胆碱基或配体与反应基团或吸附配体的基团之间存在的化学结构(间隔基团)是任意的。例如任意的间隔基团除亚甲基链、氧乙烯基链等之外，还可以是含有一个或多个氨基的亚烷基链。
“存在于颗粒表面的反应基团或吸附配体的基团为氨基时”
步骤1：可通过公知的方法或今后开发的方法将氨基导入任意的颗粒中。氨基可直接导入颗粒表面。氨基为伯胺或仲胺。
步骤2：由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，将其与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，使磷酰胆碱基直接附加于颗粒表面。
不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残留的氨基成为配体可结合的取代基。
或者，由甘油磷酰胆碱的氧化开裂反应得到羧基体，将其与具有氨基的颗粒进行酰胺化反应，将磷酰胆碱基直接附加于颗粒表面。不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残留的氨基成为配体可结合的取代基。
“颗粒表面导入氨基的方法”
将氨基导入颗粒的公知的方法(步骤1)如下所述。
1.通过等离子体处理的表面反应导入氨基
在氮气气氛下，通过低温等离子体向颗粒表面导入氨基。具体来说，将颗粒装入等离子体反应容器内，用真空泵将反应容器内抽真空，然后导入氮气和氢气。接着可通过辉光放电向颗粒表面导入氨基。也可以将经等离子体处理的有机材料进行机械制粒。关于等离子体处理的文献如下所示。
1.M.Muller，C.oehr
Plasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes：comparison of the in plasma modifications with a grafting method usingESCA and an amino-selective fluorescent probeSurface and Coatings Technology 116-119(1999)802-807
2.Lidija Tusek，Mirko Nitschke，Carsten Werner，Karin Stana-Kleinschek，Volker Ribitsch
Surface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foilsColloids and Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects 195(2001)81-95
3.Fabienne Poncin-Epaillard，Jean-Claude Brosse，Thierry FalherReactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly(propylene)film
Macromol.Chem.Phys.200.989-996(1999)
2.通过表面改性剂导入氨基
使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性剂，对含烷氧基甲硅烷基的颗粒等有机颗粒表面进行处理。
例如，通过具有伯氨基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，对含烷氧基甲硅烷基的颗粒进行处理，导入氨基。具体来说，将1-甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙基酯-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚颗粒浸入水-2-丙醇混合液中，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷，然后加热至50℃，反应6小时。冷却至室温后，用甲醇洗涤上述聚合物，干燥，可得到氨基直接导入到上述共聚颗粒表面的颗粒。
3.通过有机硅气相处理导入氨基(参照日本特公平1-54379号公报、日本特公平1-54380号公报、日本特公平1-54381号公报)
首先通过1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷对颗粒表面进行处理，使导入到表面的Si-H基与具有氨基的单体反应，得到氨基化的表面。例如，将苯乙烯-二乙烯基苯共聚颗粒和1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷装入干燥器中，用吸气机进行脱气。在80℃下反应16小时，然后取出上述颗粒，在50℃下干燥。将所得颗粒分散于乙醇中，添加烯丙基胺，接着添加氯铂酸的乙醇溶液，在60℃下搅拌2小时，反应终止后过滤，用乙醇洗涤，减压干燥，得到氨基化有机颗粒。
本方法中使用的单体可以使用胺系单体。胺系单体不限于烯丙基胺，只要具有氨基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反应性部位即可。氨基可被丁氧基羰基、苄氧基羰基等保护。
另外，即使不是胺系单体，如环氧基那样，也可以是具有例如通过与二胺的反应可简单地导入氨基的官能团的单体。
“向具有氨基的颗粒导入磷酰胆碱基的方法”
下面，如下表示向氨基化颗粒表面导入磷酰胆碱基的方法(步骤2)。
将颗粒浸泡于甲醇中，添加磷脂酰甘油醛，在室温下放置6小时。然后在0℃下添加氰基硼酸钠，加热搅拌过夜，使磷酰胆碱基附加到氨基上。将颗粒用甲醇洗净后，干燥，可得到表面直接具有磷酰胆碱基的颗粒。反应溶剂除甲醇外，只要是水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂均可使用，使用甲醇时的导入率较高。
或者将颗粒分散于二甲基亚砜-水混合溶液中，添加溶解了N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羧甲基磷酰胆碱的二甲基亚砜-水混合溶液。在室温下搅拌6小时，将颗粒用水充分洗涤，然后干燥，可得到表面直接具有磷酰胆碱基的颗粒。反应溶剂除上述之外，还可优选使用N，N’-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈等非质子性溶剂。或者使羧甲基磷酰胆碱与亚硫酰氯反应，制成酰氯化物，在以N，N’-二甲基甲酰胺、乙腈等为溶剂的无水条件下与颗粒反应，将颗粒用水充分洗涤，然后干燥，可得到表面直接具有磷酰胆碱基的颗粒。该方法也可以与表面的羟基有效反应，对于颗粒为琼脂糖、琼脂糖凝胶等多糖类的情况或为(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯的情况也是有效的。
使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作为表面改性剂，将氨基导入具有烷氧基甲硅烷基的有机颗粒、接着导入磷酰胆碱基(简称PC)的方法的方案如下所示。
[化7]
Figure G200580016582101D00151
如上所述，制备具有氨基的颗粒，由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，通过其与具有氨基的颗粒的还原性氨基化反应，可以制备磷酰胆碱基直接附加在颗粒表面的颗粒。
该方法具有磷酰胆碱基的导入率高，可以修饰各种有机颗粒的表面的优点。
上述方法中，含有由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体的化合物是通过公知的方法，将公知的甘油磷酰胆碱基进行氧化性开裂得到的，是极简单的步骤。该反应是使用高碘酸或高碘酸盐，对1，2-二醇进行氧化，使键开裂，得到两个醛体，本方法生成磷酰胆碱醛体和甲醛。反应通常在水中或含有水的有机溶剂中进行。反应温度为0℃至室温。醛体在水中经过平衡反应可成为水合物，这对于接下来的与胺的反应没有影响。以下表示制备含有磷酰胆碱基的单官能醛体的方案的一个例子。
[化8]
Figure G200580016582101D00161
使由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到的醛体(或水合物)与颗粒的氨基结合的还原性氨基化反应可通过将两者在溶剂中搅拌而容易地进行。该反应是将两者溶解或分散于水或醇中(可以混合第三成分的有机溶剂)，形成亚胺，然后通过还原剂将其还原，得到仲胺。还原剂优选氰基硼酸钠等温和的还原剂，只要磷酰胆碱稳定，也可以使用其它还原剂。反应通常在0℃至室温下进行，也可以根据情况加热。
可以使式(2)所示的化合物以任意的量、按照常规方法与上述氨基反应，也可以将残留的氨基作为配体可结合的反应基因或吸附配体的基团。
[化9]
Figure G200580016582101D00171
n＝1-12的整数
“关于配体可结合的反应基团或吸附配体的基团”
上述反应中，不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残留的氨基成为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。该颗粒为权利要求2的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团直接存在于有机颗粒的表面的颗粒。配体与该残留的氨基结合的颗粒是权利要求3的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体直接存在于有机颗粒的表面的颗粒。
权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕捉的物质(目标物质)，可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是预先与使其与配体结合了的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是至少式(1)的磷酰胆碱基存在于颗粒表面的亲和颗粒，不管有否配体或可与其结合的反应基团或吸附配体的基团，使用者根据要捕捉的物质(目标物质)，可以使其与任意的配体结合的制品形式。只要至少式(1)所示的磷酰胆碱基存在于颗粒表面即可，包含任何形式的亲和颗粒，例如也包含权利要求2和权利要求3的形式。
上述反应中，使氨基残留以作为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团，这可通过使3-氨基丙基三甲氧基硅烷和导入了磷酰胆碱基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷进行竞争反应的方法或调节反应量等来进行。
也可以使任意的具有官能团的化合物与该氨基反应，使该官能团成为配体可结合的反应基或吸附配体的基团。例如可以是戊二醛、二亚氨酸烷基酯、酰基叠氮基类、异氰酸酯类等。
在使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作为上述表面改性剂时的方案中，调节表面改性剂的反应量，使存在于颗粒表面的羟基(OH)残留，可以利用残留的OH基作为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。
“配体与具有氨基的颗粒的结合方法”
配体为蛋白质时，可以使戊二醛的一个醛基与有机颗粒上的氨基反应，使蛋白质中的氨基与另一个醛基反应，从而结合蛋白质。“存在于颗粒表面的反应基团或吸附配体的基团为羟基的情况”
有机颗粒存在羟基时，无需新导入象上述氨基那样的配体可结合的反应基团或吸附配体的基团，可直接利用存在于颗粒表面的羟基(OH)，导入磷酰胆碱基以及配体或配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。本发明的亲和颗粒优选通过该方法制备。
“向具有羟基的颗粒导入磷酰胆碱基的方法”
存在于颗粒表面的羟基与下述式(3)或(4)的化合物的Si-OMe通过脱水形成化学键。通过在几乎所有的有机溶剂中进行加热·回流，该化学反应可极容易地定量进行。通过该脱水反应，可以导入化学性、物理性极其稳定的磷酰胆碱基，因而优选。下述式(3)或式(4)所示的含有磷酰胆碱基的化合物为新型化合物。
[化10]
Figure G200580016582101D00181
[化11]
式中，m为2-6，n为1-4。OMe可以是OEt、Cl。另外与Si结合的OMe或OEt或Cl中最多两个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基。
“式(3)的含磷酰胆碱基化合物的制备方法”
使下述式(5)所示的磷酰胆碱衍生物溶解于蒸馏水。下述式(5)的磷酰胆碱衍生物为公知的化合物，可购自市场。
[化12]
Figure G200580016582101D00192
将式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷却，加入高碘酸钠，搅拌5小时。减压浓缩反应液，减压干燥，通过甲醇萃取下述式(6)所示的具有醛基的磷酰胆碱衍生物。
[化13]
Figure G200580016582101D00201
接着，向式(6)的甲醇溶液中添加0.5当量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。将该混合溶液在室温下搅拌规定时间，然后冰冷却，适量添加氰基硼氢化钠，回复至室温，搅拌16小时。其间继续向反应容器中通入干燥氮。过滤沉淀后，得到式(3)的甲醇溶液。
即使式(3)所示化合物中的m、n改变，也可按照上述顺序完全同样地进行。这里所示的顺序是m＝3、n＝2的情况。对反应溶剂没有特别限定，除上述甲醇之外，可以使用水或乙醇、丙醇、丁醇等醇，DMF或DMSO等非质子性溶剂。不过，为防止反应中的聚合，优选脱水溶剂，其中优选脱水甲醇。
(3)中的甲氧基(OMe)换为乙氧基(OEt)时，可以将甲醇改为乙醇进行反应，为Cl时，可只变更为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
并且，与Si结合的OMe或OEt或Cl中，2个或1个被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基的其中之一取代时，也可以与上述方法完全同样地制备。
“式(4)的含磷酰胆碱基化合物的制备方法”
将式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷却，添加高碘酸钠和催化剂量的三氯化钌，搅拌3小时。减压浓缩反应液并减压干燥，通过甲醇萃取下述式所示的具有羧基的磷酰胆碱衍生物(7)。
[化14]
Figure G200580016582101D00211
接着，向式(7)的乙腈或N，N’-二甲基甲酰胺分散液中添加1.2当量亚硫酰氯，搅拌30分钟，向所得溶液中添加0.9当量3-氨基丙基三甲氧基硅烷。将该混合溶液在室温下搅拌4小时，得到式(8)的化合物。
[化15]
Figure G200580016582101D00212
上述缩合反应中使用的试剂除亚硫酰氯之外，只要是通常生成羧基酰卤化物的试剂均可无问题地使用，有五氯化磷、氯氧化磷、三溴化磷、草酰氯等。
除使用式(8)的硅烷偶联剂之外，还可以使式(7)的化合物与羟基直接反应。例如将琼脂糖凝胶珠分散于无水乙腈中，将式(7)的化合物与1.2当量的亚硫酰氯混合，添加搅拌过夜的乙腈溶液，搅拌3小时，得到表面导入了磷酰胆碱化合物的颗粒。
“关于配体可结合的反应基团或吸附配体的基团”
上述反应中，不使磷酰胆碱基与全部羟基反应(调节反应量)，则残留的羟基成为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。该颗粒为权利要求2的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团直接存在于有机颗粒表面的颗粒。该残留的羟基与配体结合得到的颗粒则是权利要求3的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体直接存在于有机颗粒的表面的颗粒。
权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕捉的物质(目标物质)，可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是预先与配体结合了的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是至少式(1)的磷酰胆碱基存在于颗粒表面的亲和颗粒，是不管有否配体或配体可结合的反应基团或吸附配体的基团，使用者根据要捕捉的蛋白质(某种目标物质)，可使其与任意的配体结合的制品形式。另外，只要是至少式(1)的磷酰胆碱基存在于颗粒表面，则本发明包含任何形式的亲和颗粒，例如也包含权利要求2和权利要求3的形式。
“配体与具有羟基的颗粒的结合方法”
配体为蛋白质时，使用溴化氰活化颗粒上的羟基。使蛋白质中的氨基与其反应，以此结合蛋白质。
使任何具有官能团的化合物与该羟基反应，可以使该官能团成为蛋白质可以结合的反应基团或吸附配体的基团。
“导入到颗粒中的反应基团或吸附配体的基团为羧基的情况”
步骤1：通过公知的方法或今后开发的方法将羧基导入任意颗粒中。羧基可直接导入颗粒表面。
步骤2：通过常规方法使下述式(9)所示的含有磷酰胆碱的化合物与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使残留的羧基作为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。
不使磷酰胆碱基与全部羧基结合(调节反应量)，则残留的羧基成为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。
[化16]
“向颗粒表面导入羧基的方法”
向颗粒中导入羧基的公知的方法(步骤1)如下所述。
1.通过表面改性剂导入羧基
使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性剂，对含有烷氧基甲硅烷基的颗粒等有机颗粒表面进行处理。
例如通过三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐对具有烷氧基甲硅烷基的有机颗粒进行处理，导入羧基。具体来说，使三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺，添加蒸馏水和4-二甲基氨基吡啶，在室温下搅拌16小时，得到具有羧酸的硅烷偶联剂。本反应是通过4-二甲基氨基吡啶进行的琥珀酸酐的水解反应。
通过具有羧酸的硅烷偶联剂，将具有烷氧基甲硅烷基的有机颗粒浸泡在水-2-丙醇混合液中，添加具有羧酸的硅烷偶联剂，然后加热至50℃，反应6小时。冷却至室温，然后用甲醇洗涤有机颗粒，干燥，可得到羧基直接导入到有机颗粒表面的颗粒。
2.通过有机硅气相处理导入羧基(参照日本特公平1-54379号公报、日本特公平1-54380号公报、日本特公平1-54381号公报)。
首先通过1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷对颗粒表面进行处理，使导入到表面的Si-H基与具有羧基的单体反应，得到羧基化表面。
本方法中使用的单体可以使用羧基系单体。羧基系单体只要具有羧基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反应性部位即可。
“向具有羧基的颗粒中导入磷酰胆碱基的方法”
接着，以下表示向羧基化颗粒表面导入磷酰胆碱基的方法(步骤2)。
将表面具有羧基的颗粒浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的溶液中，颗粒的表面被活性酯基覆盖。向其中加入式(9)所示的具有氨基的磷酰胆碱衍生物溶液，导入磷酰胆碱基。
“关于配体可结合的反应基团或吸附配体的基团”
上述反应中，不使磷酰胆碱基与全部的羧基结合(调节反应量)，则残留的羧基成为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。该颗粒为权利要求2的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团直接存在于有机颗粒表面的颗粒。配体与该配体可结合的反应基团或吸附配体的基团结合，则成为权利要求3的亲和颗粒，是式(1)所示的磷酰胆碱基和配体直接存在于有机颗粒的表面的颗粒。
权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕捉的物质(目标物质)，可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是预先与配体结合的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是颗粒表面至少存在式(1)的磷酰胆碱基的亲和颗粒，是不管有否配体或配体可结合的反应基团或吸附配体的基团，使用者根据要捕捉的物质(目标物质)，可以使其与任何配体结合的制品形式。只要是颗粒表面至少存在式(1)的磷酰胆碱基，则本发明包含任何形式的亲和颗粒，例如也包含权利要求2和权利要求3的形式。
上述反应中，使羧基作为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团残留，这可通过调节导入磷酰胆碱基的具有羧酸的硅烷偶联剂的反应量来进行。
使任意具有官能团的化合物与该羧基反应，该官能团可以作为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团。
“配体与具有羧基的颗粒的结合方法”
配体为蛋白质时，有机颗粒上的羧基浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的溶液中，使颗粒表面形成活性酯。使蛋白质中的氨基与其反应，以此结合蛋白质。使任意的具有官能团的化合物与该羟基反应，则该官能团可以作为蛋白质可结合的反应基团或吸附配体的基团。
“目标物质的亲和分离方法”
使用上述所得本发明的亲和颗粒，可以进行本发明的目标物质的亲和分离方法。
本发明方法利用有机颗粒，可简便的进行高精度的分离，从这点来讲，是具有划时代意义的目标物质的分离方法。
本发明的方法包含以下三个步骤。当为配体预先结合的亲和颗粒时(权利要求2)，第1步骤已经进行，因此省略。
1.使任意的配体与亲和颗粒化学结合的第1步骤，其中，亲和颗粒的特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有式(1)所示的磷酰胆碱基，或者有机颗粒的表面以共价键的形式具有式(1)所示的磷酰胆碱基且有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有配体，该配体与某种目标物质具有特异亲和性。
例如，有机颗粒的表面具有式(1)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附配体的基团，其中前者以共价键结合，后者以共价键或吸附形式结合，将这样的亲和颗粒和1ml任意的配体PBS溶液装入2ml微量离心管中，在4℃下缓慢振荡30分钟。以15000rpm离心30分钟，倾去上清。为了清洗，加入1ml PBS溶液，缓慢振荡，以15000rpm离心30分钟，倾去上清。将该漂洗操作重复三次。
2.使第1步骤中制备的亲和颗粒分散于液体试样中的第2步骤，其中所述液体试样含有可被任意的配体选择性捕捉的目标物质。
例如，使第1步骤中制备的亲和颗粒分散于液体试样中，其中液体试样含有可被任意的配体选择性地捕捉的目标物质，在4℃下缓慢振荡30分钟。以15000rpm离心5分钟，倾去上清。为了漂洗，加入1ml PBS溶液，缓慢振荡，以15000rpm离心30分钟，倾去上清。将该漂洗操作重复3次。
3.从分离出的亲和颗粒中回收捕捉的目标物质的第3步骤。
例如为了从亲和颗粒中回收捕捉的目标物质，加入1ml洗脱缓冲液，在4℃下缓慢振荡30分钟，从颗粒中洗脱目标物质，回收上清。加入1ml洗脱缓冲液，缓慢振荡，以15000rpm离心30分钟，回收上清。将该操作重复2次。
图1是表示通过本发明的亲和颗粒与以往的亲和颗粒捕捉目标物质的选择性的差异的模式图。
实施例
下面根据实施例进一步详细说明本发明。本发明不受这些实施例的限定。导入到颗粒表面的磷酰胆碱基可通过以下方法进行确认、定量。
<定量方法>
将所得颗粒浸泡在高氯酸中，加热至180℃使其分解。将所得溶液用水稀释，向其中加入七钼酸六铵四水合物和L抗坏血酸，在95℃下显色5分钟，然后进行710nm的吸光度测定，求出导入量。校正曲线使用磷酸二氢钠水溶液。
“合成例1”
“含有磷酰胆碱基的醛化合物”
将6.29g 1-α-甘油磷酰胆碱溶解于210ml蒸馏水，在冰水浴中冷却。添加10.23g高碘酸钠，搅拌5小时。减压浓缩反应液，减压干燥，通过甲醇萃取目标物。下述化合物(6)表示其结构。
式(6)的化合物在重水中的1H NMR波谱如图2所示。式(6)的化合物在水中与式(10)呈平衡状态，因此实际的波谱反应了式(6)和式(10)双方。
[化17]
[化18]
Figure G200580016582101D00272
“合成例2”
“含有磷酰胆碱基的羧酸化合物”
将5g 1-α-甘油磷酰胆碱溶解于70ml水-30ml乙腈。在冰冷却下添加17g高碘酸钠和80mg三氯化钌，搅拌过夜。过滤沉淀物，减压浓缩，用甲醇萃取，得到化学式(7)所示的目标羧甲基磷酰胆碱。
式(7)的化合物在重水中的1H NMR波谱如图3所示。
[化19]
“参考例1”
“苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒”
将3.6g甲基丙烯酸缩水甘油酯、2.4g苯乙烯、0.08g二乙烯基苯添加到220ml用氮取代进行了充分脱气的纯净水中。添加0.12gV-60聚合引发剂，在70℃下搅拌1小时。再添加0.6g甲基丙烯酸缩水甘油酯，在70℃下搅拌过夜。冷却至室温，通过离心(15000rpm×30分钟，3次)进行纯化，得到目标颗粒。
“导入氨基的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒”
将1g苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒分散于80ml纯净水中，添加20ml 25％氨水溶液，在70℃下加热搅拌过夜。冷却至室温，通过离心(17000rpm×60分钟，3次)进行纯化。
“磷酰胆碱修饰颗粒(PC颗粒(A))”
将0.5g导入了氨基的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒分散于10ml甲醇中，添加0.5g合成例1的醛体，搅拌过夜。在冰水浴中添加140mg氰基硼酸钠，搅拌6小时，然后通过离心(17000rpm×60分钟，3次)进行纯化，得到PC颗粒(A)。
“盐发生的凝聚”
图4、5中给出了参考例1中制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒和PC颗粒(A)在水中和食盐水(0.1M水溶液)中的粒度分布。
图4中，对于使用亲和颗粒的胶乳凝聚法中通常使用的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒在水中的粒度分布的大小比较，在NaCl水溶液中的粒度分布的大小大幅增大，表示发生了凝聚。而图5与图4相比较，PC颗粒(A)在食盐水溶液中的粒度分布变化小，表示难以发生盐引起的凝聚。以上表明：PC颗粒(A)通过式(1)的磷酰胆碱的修饰，可降低盐等妨碍物质的影响，提高测定精度。
“对抑制蛋白质非特异吸附的评价”
分别取25mg参考例1中制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒和PC颗粒(A)，加入1ml蒸馏水，进行1分钟超声波处理。离心除去蒸馏水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室温下反应1小时，通过MICRO BCA法对离心(5000g)后的上清进行定量。结果如图6所示。由此可知：与苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒相比，用磷酰胆碱基处理的PC颗粒(A)强烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。通过式(1)的磷酰胆碱的修饰，蛋白质的吸附量大幅减少。除颗粒之间的凝聚外，各种蛋白质对颗粒的非特异性吸附也是测定精度降低的主要原因，因此，本发明的亲和颗粒被配体只选择性地捕捉目标蛋白质的精度优异。
“参考例2”
“甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺颗粒”
将1.35g N-异丙基丙烯酰胺和58mg亚甲基丙烯酰胺添加到200ml用氮取代进行了充分脱气的纯净水中。添加7mg V-50聚合引发剂，在70℃下搅拌30分钟。添加100mg甲基丙烯酸2-氨基乙酯，再在70℃下搅拌4小时，冷却至室温，然后在水中透析，通过冷冻干燥得到目标颗粒。
“磷酰胆碱修饰颗粒(PC颗粒(B))”
将0.1g所得甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺颗粒分散于20ml甲醇中，添加25mg合成例1的醛体，搅拌过夜。在冰水浴中添加6mg氰基硼酸钠，搅拌6小时，然后通过在水中透析进行纯化，得到PC颗粒(B)。
“磷酰胆碱修饰颗粒(PC颗粒(C))”
将0.1g所得甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺颗粒分散于8ml二甲基亚砜-2ml水中，添加溶解有25mg合成例2的羧基体、20mg N-羟基琥珀酰亚胺、23mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的1ml水，搅拌过夜。通过在水中透析进行纯化，得到PC颗粒(C)。
“对抑制蛋白质非特异吸附的评价”
分别取25mg参考例1中制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒和参考例2中制备的PC颗粒(B)、(C)，加入1ml蒸馏水，进行1分钟超声波处理。离心除去蒸馏水，加入1ml100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室温下反应1小时，通过MICRO BCA法对离心(5000g)后的上清进行定量。结果如图7所示。与苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒相比，用磷酰胆碱基处理的PC颗粒(B)、(C)强烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。由此可知：通过式(1)的磷酰胆碱的修饰，蛋白质的吸附量大幅减少。除颗粒之间的凝聚外，各种蛋白质对颗粒的非特异性吸附也是测定精度降低的主要原因，因此，本发明的亲和颗粒被配体只选择性地捕捉目标蛋白质的精度优异。
“参考例3”
“磷酰胆碱修饰颗粒(PC颗粒(D))”
将100mg琼脂糖珠(交联率6％)分散于10ml无水N，N’-二甲基甲酰胺中，将50mg合成例2的羧基体和25mg亚硫酰氯溶解于1ml无水N，N’-二甲基甲酰胺中，添加反应的溶液，在室温下搅拌3小时。通过用N，N’-二甲基甲酰胺、乙腈依次离心，进行纯化，得到PC颗粒(D)。
“对抑制蛋白质非特异吸附的评价”
分别取25mg参考例1中制备的苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒和参考例3中制备的PC颗粒(D)，加入1ml蒸馏水，进行1分钟超声波处理。离心除去蒸馏水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室温下反应1小时，通过MICRO BCA法对离心(5000g)后的上清进行定量。结果如图8所示。与琼脂糖珠相比，用磷酰胆碱基处理的PC颗粒(D)强烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。由此可知：通过式(1)的磷酰胆碱的修饰，蛋白质的吸附量大幅减少。除颗粒之间的凝聚外，各种蛋白质对颗粒的非特异性吸附也是测定精度降低的主要原因，因此，本发明的亲和颗粒被配体只选择性地捕捉目标蛋白质的精度优异。
“实施例1”
“亲和颗粒”
以下给出权利要求6所示的亲和分离法。向0.1g参考例2中得到的甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺颗粒中添加10mg合成例1的醛体，搅拌过夜，然后在冰水浴中添加3mg氰基硼酸钠，搅拌6小时，然后通过在水中透析进行纯化、制备。向25mg该亲和颗粒中加入1mL 8％戊二醛溶液和10mg用于稳定席夫碱的氰基硼氢化钠(シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室温下反应5小时，用PBS离心·纯化(5000g)5次。得到戊二醛为配体可结合的反应基团或吸附配体的基团的权利要求2的亲和颗粒。接着加入1ml 1mg/ml牛白蛋白或1mg/ml人血红蛋白和10mg硼氢化钠，在室温下反应1天，用PBS进行4次离心·纯化(5000g)。该牛白蛋白或人血红蛋白为配体。以下是权利要求7所示的亲和分离方法。为了使残留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺盐酸盐(0.5M、pH 7.1)和10mg硼氢化钠(トリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室温下反应1小时，用PBS进行4次离心·纯化(5000g)，得到权利要求3的亲和颗粒。接着加入1ml HRP标记抗牛白蛋白抗体(10μg/ml)或HRP标记抗人血红蛋白抗体(10μg/ml)，在室温下反应1小时，用PBS离心·纯化(5000g)5次。再加入1ml PBS，搅拌，将10μl转移至96孔板，用底物TMBZ进行显色实验，用450nm进行测定。其结果如图9所示。可知使用任何的配体，都可以高选择性捕捉目标抗体。
“比较例1”
对0.1g参考例2中得到的甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺颗粒不经磷酰胆碱修饰，进行与实施例相同的操作，结果如图10所示。可知：与实施例1比较，使用任何配体，选择性都低。
产业实用性
本发明的亲和颗粒只捕捉要分离的目标蛋白质，因此选择性极高。另外分散性优异，极容易从液体试样中分离。盐产生的凝聚少，因此可简便且高精度地分离目标物质。作为免疫沉淀法、胶乳凝聚法等的试剂，可以不受盐的影响，灵敏度良好地检测，因此可用作要求高精度分离、检测目标物质的生物体相关产业。

Claims (14)

1.一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附配体的基团：
2.一种亲和颗粒，其特征在于：有机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，有机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体：
Figure FSB00000274752600012
3.权利要求1的亲和颗粒，其特征在于：上述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm。
4.权利要求2的亲和颗粒，其特征在于：上述有机颗粒为合成颗粒或多糖类，其中所述合成颗粒是聚合物中含有选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1种或多种单体单元而得到的，多糖类含有琼脂糖或琼脂糖凝胶，所述有机颗粒的平均粒径为20nm-500μm。
5.权利要求3的亲和颗粒，其特征在于：通过在所述有机颗粒的表面直接导入氨基，并由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，将所得醛体或水合物与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，使下式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，或者使下式(2)所示化合物与上述氨基反应，
n为1-12的整数。
6.权利要求4的亲和颗粒，其特征在于：通过在所述有机颗粒的表面直接导入氨基，并由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物，将所得醛体或水合物与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，使下式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，或者使下式(2)所示化合物与上述氨基反应，
Figure FSB00000274752600022
n为1-12的整数。
7.权利要求3的亲和颗粒，其特征在于：由存在于所述有机颗粒表面的羟基与下述式(3)或(4)所示化合物的Si-OMe通过脱水形成化学键，由此使下式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，
式中，m为2-6，n为1-4，OMe可以被OEt或Cl取代，并且与Si结合的OMe或OEt或Cl这3个取代基中，其中的2个或1个可以被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一种取代。
8.权利要求4的亲和颗粒，其特征在于：由存在于所述有机颗粒表面的羟基与下述式(3)或(4)所示化合物的Si-OMe通过脱水形成化学键，由此使下式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，
Figure FSB00000274752600041
式中，m为2-6，n为1-4，OMe可以被OEt或Cl取代，并且与Si结合的OMe或OEt或Cl这3个取代基中，其中的2个或1个可以被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一种取代。
9.权利要求3的亲和颗粒，其特征在于：在所述有机颗粒的表面直接导入羧基，通过常规方法使下述式(9)所示含有磷酰胆碱的化合物与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使下式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，
Figure FSB00000274752600042
10.权利要求4的亲和颗粒，其特征在于：在所述有机颗粒的表面直接导入羧基，通过常规方法使下述式(9)所示含有磷酰胆碱的化合物与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使下述式(1)的磷酰胆碱基直接加成到颗粒表面，
Figure FSB00000274752600052
11.权利要求1～10中任一项的亲和颗粒，其特征在于：上述配体为选自各种抗体、底物、受体、蛋白质、肽、DNA、RNA、适体、生物素、螯形化合物、各种金属离子的一种或多种配体。
12.权利要求11的亲和颗粒，其特征在于：上述肽为抗原、酶、蛋白A、蛋白G或抗生物素蛋白。
13.一种通过有机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤：(1)使权利要求1、3、5、7中任一项的亲和颗粒与任意的配体结合的第1步骤；(2)使第1步骤中制造的亲和颗粒分散于液体试样中的第2步骤，其中所述液体试样含有能够被任意的配体选择性捕捉的目标物质；(3)回收由亲和颗粒捕捉的目标物质的第3步骤。
14.一种通过有机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤：(1)使权利要求2、4、6、8中任一项的亲和颗粒分散于液体试样中的第1步骤，其中所述液体试样含有能够被任意的配体选择性捕捉的目标物质；(2)回收由亲和颗粒捕捉的目标物质的第2步骤。
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