KR101248231B1 - 단백질의 분리 또는 정제를 위한 금속 이온-고분자하이드로겔 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질의 분리 또는 정제를 위한 매트릭스에 관한 것으로, 이러한 매트릭스로서 금속 이온;과 아크릴릭산을 포함한 단량체가 중합된 고분자 하이드로겔의 복합체, 보다 바람직하게는 금속 이온-폴리(2-아세트아미도 아크릴릭산)(poly(2-acetamido acrylic acid) 하이드로겔을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 단백질 분리 또는 정제용 하이드로겔은 단백질과의 친화성이 높아 단백질 정제 등에 효율적이며, 경제적이고, 재생산성이 양호하다.

폴리(2-아세트아미도 아크릴릭산), 하이드로겔, 금속 이온, Ni, 단백질

Description

단백질의 분리 또는 정제를 위한 금속 이온-고분자 하이드로겔{Metal ion-polymer hydrogel for separating or purifying protein}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리(2-아세트아미도 아크릴릭산)(Poly(2-acetamido acrylic acid; PAAA)의 분자 구조를 나타내는 개략도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PAAA 하이드로겔과 금속 이온이 결합한 형태를 보여주는 개략도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예인 금속이온-PAAA 하이드로겔에 히스티딘 태그를 가진 GFP(His-tagged GFP)를 결합시킨 후 칼럼에 충진시킨 모습을 보여주는 사진이다. 도 3의 (a)는 금속 이온으로 Ni^{2 +}을 이용한 결과이며, 도 3의 (b)는 금속 이온으로 Co^{2 +}를 이용한 결과이다.

도 4는 도 3의 결과물의 정제 여부를 12% SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다. 도 4의 (a)는 금속 이온으로 Ni^{2 +}을 이용한 결과이며, 도 4의 (b)는 금속 이온으로 Co^{2 +}를 이용한 결과이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예인 PAAA 하이드로겔의 Ni^{2 +} 결합 유무에 따른 정 제 효과를 비교 평가한 실험 결과이다. 도 5의 왼쪽 사진은 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔을 이용한 결과이며, 도 5의 오른쪽 사진은 Ni^{2 +}을 결합시키지 않은 PAAA 하이드로겔을 이용한 결과이다.

도 6은 도 5의 결과물의 정제 여부를 2% SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다. 레인 1은 Ni^{2 +}-PAAA하이드로겔로 정제한 경우이며, 레인 2는 금속 이온이 결합되지 않은 PAAA 하이드로겔을 이용한 결과이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔과 GFP의 결합을 Confocal Fluorescence Microscopy를 이용하여 촬영한 이미지이다.

본 발명은 단백질의 정제 또는 분리에 사용되는 물질, 이러한 물질을 포함하는 칼럼 등에 관한 것이다.

현재 Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography(이하, IMAC)는 재조합 단백질의 정제에서 가장 보편적인 방법 중 하나이다. 이 IMAC는 매트릭스 상의 불용성 지지체에 고정화된(immobilized) 결합물질(ligand)에 정제하고자 하는 물질을 특이적(specific)이며 가역적(reversible)으로 결합시키는 방법으로 단백질 등의 특정물질을 분리하는 대표적인 흡착크로마토그래피의 일종이다. 크로마토그래피 중 가장 효과적이고 선택성이 높아 단 한 번의 크로마토그래피로 수백 배에서 수천 배의 정제효과를 가져올 수도 있다.

IMAC 방법은 실험실에서 재조합된 단백질의 정제를 위해 정제용 태그(tag)를 사용한다. 이 펩타이드 태그(Peptide tag)는 단백질에 복수의 히스티딘(multiple histidine)을 결합시켜 폴리-히스티딘 태그의 형태(poly-Histidine tagged)로 만들어진다. 목적하는 단백질의 사이드 체인인 이러한 히스티딘 태그에서 아미노산과 금속 이온(Cu^{2 +}, Ni^{2 +}, Zn^{2 +} 등)들 사이의 결합친화력을 이용해서 단백질을 정제하는 것이 IMAC의 기본원리이다.

또한 상기 금속 이온들은 이미노디아세틱 산(iminodiacetic acid; IDA), 니트릴로아세틱 산(nitrilotriacetic acid; NTA) 등과 같은 킬레이팅화제에 고정되어 있으며, IDA, NTA 등과 같은 킬레이팅화제는 고체 지지체에 고정되어있다. 이러한 지지체로 사용되는 주요 매트릭스로는 아가로스(agarose), 세파로스(sepharose) 및 셀룰로스(cellulose)가 있으며, 현재 상용중인 대표적인 주요 매트릭스에는 Ni^{2 +}-NTA 아가로스 겔, Ni^{2 +}-IDA 멤브레인 등이 있다. 이런 IMAC는 매우 선택적(selective)이므로 가장 효과적인 크로마토그래피 방법이지만 가격 면에서 많은 부담감을 주고 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 경제적이며, 단백질 분리 또는 정제에 유용한 매트릭스 형성 물질, 이러한 물질을 포함하는 단백질 분리 또는 정제용 칼럼, 및 이러한 물질을 이용하는 단백질 분리 또는 정제 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 금속 이온; 및 아크릴릭산을 포함한 단량체가 중합된 고분자 하이드로겔로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 복합체, 보다 바람직하게는 상기 고분자가 폴리(2-아세트아미도 아크릴릭산)(poly(2-acetamido acrylic acid; PAAA)인 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 복합체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 칼럼 및 이러한 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리 또는 정제 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 단백질 분리 또는 정제용 복합체 등에 대해 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 IMAC의 공정량 증가에 따른 가격적인 문제와 금속 이온과 히스티딘 태그의 친화성(affinity)의 효율을 높이기 위하여 IMAC의 매트릭스로 하이드로겔 물질을 사용하는 것은 많은 이점이 있다는 점과 이러한 하이드로겔 물질로 PAAA가 유용하다는 점에 기초한다. 아크릴릭산을 포함한 단량체가 중합 및 가교되어 형성된 고분자 하이드로겔은 3차원 구조를 가지며, 3차원 구조인 하이드로겔은 물에 녹지 않고 팽윤된다. 그들의 팽윤정도에 따라 부피, 면적 등이 조절되고 이 조절된 구조는 다른 매트릭스보다 많은 입체공간을 가진다. 이 3차원 구조를 가지는 하이 드로겔은 수성 환경(Aqueous environment)에서의 단백질 정제에 있어 보다 많은 양의 정제된 단백질을 얻을 수 있으며, 가격적인 문제도 해결될 수 있다.

본 발명에 따른 아크릴릭산을 포함한 단량체가 중합된 고분자, 특히 PAAA 하이드로겔은 조절 가능한 기능성(functionality)을 가지는 미세구조(microstructures)이다. 이러한 고분자 하이드로겔의 3차원 구조에 의해 많은 기능성을 가지는 하이드로겔에 금속 이온을 붙여 보다 많은 히스티딘 태그와 강한 친화력이 있는 매트릭스를 만들 수 있다. 만들어진 금속 이온-특정 고분자, 바람직하게는 PAAA 하이드로겔은 재생산성 문제에 있어서도 상업적으로 현재 사용되고 있는 Ni^{2 +}-NTA 아가로스 비드와 비교하여 많은 장점을 가진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 사용되는 PAAA 고분자의 분자 구조를, 도 2는 본 발명에 따른 일 실시예인 금속 이온-PAAA 하이드로겔 복합체를 개략적으로 나타낸다.

본 발명의 금속 이온-고분자 하이드로겔은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.

예를 들어, 금속 이온-PAAA 하이드로겔의 경우 상업적으로 이용가능한 2-아세트아미도아크릴릭산(Aldrich, 미국), 또는 피부르산과 아세트아마이드를 반응시켜 제조한 모노머인 2-아세트아미도아크릴릭산을 가교제와 함께 용해시킨 후, 포타시움 퍼설페이트 등의 개시제를 사용하여 폴리(2-아세트아미도아크릴릭산)(PAAA) 하이드로겔을 제조할 수 있으며, 이 후 이러한 PAAA 하이드로겔을 특정 금속 이온 용액과 혼합하여 금속 이온-PAAA 하이드로겔 복합체를 제조할 수 있으나, 본 발명이 이러한 제조방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 금속 이온으로는 Ni^{2 +}, Cu^{2 +}, Zn^{2 +}, Co⁺² 등이 사용될 수 있으며, 단백질과 금속 이온의 특이성(specificity) 및 흡착(adsoption) 특성을 고려할 때 상기 금속 이온들 중 Ni 이온이 보다 바람직하다.

본 발명은 또한 전술한 금속 이온-고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 칼럼 및 이러한 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리 또는 정제 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 금속 이온-고분자 하이드로겔은 통상적인 칼럼 충진제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이미다졸 등의 경쟁자 리간드를 이용하여 결합한 단백질을 분리하고 원심분리하여 단백질 등을 회수한 후 복합체를 재사용함으로써 복합체 자체로 사용될 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<PAAA 하이드로겔의 제조>

300ml 3구 플라스크에 피부르산(pyruvic acid) 13.2g(0.15mol)과 아세트아마이드 4.43g(0.075mol)를 벤젠 150ml에 넣고 90℃ 오일 반응조에서 7시간 이상 반응시켜 후술하는 반응에 사용되는 모노머인 2-아세트아미도아크릴릭산을 제조하였다.

또한 300ml 3구 플라스크에 피부르산 8.8g(0.1mol)와 석신아미드(succinamide) 2.32g(0.02mol)을 벤젠 100ml에 넣고 90℃ 오일 반응조에서 7시간 반응시켜 후술하는 반응에 사용되는 가교제 2,2'-[(1,4-디옥소-1,4-부탄디일)디이미노]비스(2-프로페노익 산)(2,2'-[(1,4-dioxo-1,4-butanediyl)diimino]bis(2-propenoic acid)을 제조하였다.

모노머인 2-아세트아미도아크릴릭산(AAA) 0.1g과 상기 가교제(cross-linker)(AAA 모노머의 5wt%)를 디메틸 설폭사이드 1.5ml에 용해시켰다. 그 후, 개시제인 포타시움 퍼설페이트(Potassium Persulfate)(KPS, 99%, ACROS) 0.001g(상기 모노머의 1wt%)을 첨가하여 교반하였다. 이 혼합물을 70℃ 오븐에 2시간 동안 넣어 두었다. 반응이 끝난 뒤 만들어진 폴리(2-아세트아미도아크릴릭산)(PAAA) 하이드로겔을 1차 증류수 500ml로 세 번 세척하여 미반응된 모노머를 제거하였다.

<금속 이온-PAAA 하이드로겔의 제조>

물에 팽윤된 PAAA 하이드로겔 10g을 0.1M 니켈 클로라이드 하이드레이트(NiCl₂·xH₂O) 100ml 또는 0.05M 코발트 클로라이드 헥사하이드레이트(CoCl₂·6H₂O) 100ml 용액 속에 담구어 12시간 동안 잘 흔들어주었다. 그러면 니켈 이온 또 는 코발트 이온이 결합된 PAAA 하이드로겔이 만들어지며, 이렇게 만들어진 금속 이온-하이드로겔을 1차 증류수로 세척하여 과잉결합된 금속 이온들을 제거하였다.

<GFP 발현, 세포파쇄 및 정제 평가>

His-tagged GFP/BL21(DE3)를 100ml LA 매질에서 O.D가 약 0.6이 될 때까지 37℃에서 키운 후, 0.05mM IPTG를 첨가하고 20℃에서 6시간 유도시켜주었다. 세포 용해 완충액(Novagen)을 이용하여 세포를 파쇄시켜고, 이렇게 얻어진 His-tagged GFP(Green Fluorescence Protein) 단백질을 전술한 바와 같이 제조한 금속 이온-PAAA 하이드로겔에 약 2-3시간 정도 결합시킨 후 이를 칼럼에 충진하였다. 그런 다음 세척 완충액(50mM phosphate buffer, pH 8.0, 300mM NaCl, 30mM 이미다졸)로 4ml씩 2번 정도 세척을 한 뒤, 용출 완충액(50mM phosphate buffer, pH 8.0, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸) 1ml을 흘려주어 얻고자 하는 단백질들이 용출되게 하였다. 용출된 단백질의 순도는 12% SDS-PAGE 겔을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.

도 3의 (a)는 본 발명의 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔에 His-tagged GFP를 결합시킨 후 컬럼에 충진시켰을 때의 사진이고, 도 3의 (b)는 Co^{2 +}-PAAA 하이드로겔에 His-tagged GFP를 결합시킨 후 컬럼에 충진시켰을 때의 사진이며, 도 4는 도 3의 결과물의 정제 여부를 정제 후 12% SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다. 도 4의 결과로부터 본 발명의 일 실시예인 금속이온-PAAA 하이드로겔이 단백질의 정제에 유용함을 확인할 수 있다.

도 5는 본 발명의 PAAA 하이드로겔의 Ni^{2 +} 결합 유무에 따른 차이점을 비교해본 실험 결과이다. 도 5의 왼쪽은 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔로, PAAA 하이드로겔에 Ni^{2 +}이 결합되어 있을 때는 His-tagged GFP가 잘 결합함을 확인할 수 있었다. 그러나 도 5의 오른쪽 결과로 알 수 있는 바와 같이, Ni^{2 +}을 결합시키지 않은 PAAA 하이드로겔 경우는 His-tagged GFP와 결합이 잘 되지 않았다.

도 6은 도 5의 결과물의 정제 여부를 12% SDS-PAGE를 통해 확인한 결과로, 레인 1은 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔로 정제한 경우이며, 레인 2는 금속 이온이 결합되지 않은 하이드로겔을 이용하여 정제를 한 결과이다. 이러한 결과로부터 하이드로겔에 Ni²⁺을 결합시켜 이용한 경우에만 정제가 이루어진다는 점을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔에 GFP를 결합시켰을 때, GFP가 발현되는 형광 현미경 이미지를 도 7에 나타내었다. 이 형광 이미지는 Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔과 GFP를 결합시킨 뒤 하이드로겔과 단백질이 선택적으로 잘 결합되었는지를 보기 위하여 샘플의 단층을 형광이미지로 본 것이다. 도 7에 나타나는 바와 같이, Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔의 Ni 2가 이온과 GFP에 붙어있는 히스티딘 태그가 선택적으로 잘 결합한 것을 알 수 있다. 이것은 입체 공간이 큰 3차원 구조를 가진 PAAA 하이드로겔이 보다 많이 금속 이온과 3차원적으로 결합되어 있기 때문인 것으로 생각된 다. Ni^{2 +}-PAAA 하이드로겔을 이용한 단백질 정제는 금속 이온의 수용력(capacity)이 높기 때문에 고정된 금속 이온 친화 크로마토그래피(IMAC)에 있어 아주 좋은 방법이다.

이와 같이, 본 발명은 단백질의 정제 또는 분리에 효율적이며, 재생산이 용이하고, 경제적인 금속 이온; 및 아크릴릭산을 포함한 단량체가 중합된 고분자 하이드로겔의 복합체, 이러한 금속 이온-특정 고분자 하이드로겔 복합체를 포함하는 칼럼, 이러한 금속 이온-특정 고분자 하이드로겔을 이용하여 단백질을 분리 또는 정제하는 방법을 제공한다.

Claims (6)

1. 금속 이온; 및 폴리(2-아세트아미도 아크릴릭산)(poly(2-acetamido acrylic acid) 하이드로겔로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 복합체.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 금속 이온은 Ni^{2 +}, Cu^{2 +}, Co⁺² 및 Zn^{2 +}으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 복합체.
4. 제3항에 있어서, 상기 금속 이온은 Ni^{2 +}인 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 복합체.
5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리 또는 정제용 칼럼.
6. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리 또는 정제 방법.

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